Zuivering van viraal DNA voor de identificatie van geassocieerde virale en cellulaire eiwitten
31 augustus 2017
Het doel van dit protocol is te specifiek tag en selectief isoleren viraal DNA van geïnfecteerde cellen voor de karakterisatie van het virale genoom geassocieerde eiwitten.
Het algemene doel van deze methode is om Herpes Simplex virus type één DNA te zuiveren van geïnfecteerde cellen voor de proteomische analyse van virale genoom-geassocieerde eiwitten. Deze methode biedt belangrijke inzichten in de betrokkenheid van cellulaire factoren en herpesvirusinfectie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het kan worden aangepast om direct verschillende populaties van vireel DNA uit geïnfecteerde cellen te zuiveren, waardoor de analyse van meerdere aspecten van infectie mogelijk wordt.
Begin deze procedure met het kweken van MRC vijf cellen zoals beschreven in het tekstprotocol. Vervolgens, verdun HSV-1 in koud tris-gebufferd zout of TBS. Voor de volgende stappen is het belangrijk om de ventilator en de weefselkweekkap uit te schakelen om te voorkomen dat cellen uitdrogen.
Gebruik een pipette om het groeimedium van de MRC 5 cellen over te brengen naar een steriele fles om het na infectie weer aan de cellen toe te voegen. Infecteer de cellen door zeven milliliter verdund virus toe te voegen aan de cellen. Schud de cellen elke 10 minuten gedurende één uur op kamertemperatuur.
Na absorptie, aspireer het innoculum, spoel de cellen met 50 milliliter kamertemperatuur TBS en vervang het oorspronkelijke groeimedium. Vervolgens, incubeer de cellen bij 37 graden Celsius in de aanwezigheid van 5% koolstofdioxide. Na het begin van virale DNA-replicatie, ongeveer vier uur na infectie, label replicerend vireel DNA.
Om dit te doen, verdun EdC in één milliliter groeimedium en voeg het toe aan het celkweekmedium van geïnfecteerde cellen gedurende twee tot vier uur. Om kernen te oogsten, vervang het groeimedium door 20 milliliter nucleaire extractiebuffer en incubeer gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius met af en toe schudden. Na incubatie, schraap kernen van de plaat met een celschraper en breng ze over naar een 50 milliliter conische buis op ijs.
Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 2.500 x g en vier graden Celsius om de kernen te bezinken. Na centrifugatie, gooi de supernatant weg. Los de nucleaire pellet voorzichtig op in 10 milliliter fosfaatbufferzoutoplossing of PBS en breng het over naar een 50 milliliter conische buis.
Centrifugeer vervolgens het monster zoals eerder. Na volledige verwijdering van de PBS, suspendeer de nucleaire pellet opnieuw in 10 milliliter klikreactiemix, door voorzichtig vijf keer op en neer te pipetteren met een 10 milliliter pipette. Roter het monster gedurende één uur bij vier graden Celsius, voordat de kernen worden bezonken zoals eerder.
Verwijder de snelle reactiemix volledig, was vervolgens de pellet door het voorzichtig op te schorsen in 10 milliliter PBS en opnieuw te centrifugeren. Resuspendeer nu voorzichtig de nucleaire pellet in één milliliter PBS en breng de oplossing over naar een 1,5 milliliter microcentrifugebuisje. Na centrifugatie, verwijder volledig de PBS en vries de pellet snel in vloeibare stikstof in.
Op dit punt kan de pellet worden bewaard bij 80 graden Celsius of de procedure kan worden voortgezet. Om de kernen te lyzeren en het DNA te fragmenteren, suspendeer de ontdooide kernen in 500 microliter Buffer B1 door op en neer te pipetteren. Incubeer de suspensie op ijs gedurende 45 minuten.
Vervolgens, sonificeer de monsters zes keer gedurende 30 seconden elk bij 40% amplitude, met behulp van een drie millimeter microtip probe. Plaats de monsters gedurende ten minste 30 seconden op ijs tussen de pulsen. Na sonificatie zouden monsters helder moeten zijn, niet troebel.
Pellet de celdeeltjes door te centrifugeren bij 14.000 x G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. De pelletgrootte zou aanzienlijk moeten afnemen, filter de supernatant door een 100 micron celstrainer en houd de doorstroming vast. Voeg vervolgens 500 microliter Buffer B2 toe aan de gefilterde supernatant.
Om het biotinyleren DNA aan streptavidine gecoate kralen te binden, bereid de streptavidine magnetische kralen voor door 300 microliter kralenslurry over te brengen naar een 1,5 milliliter microcentrifugebuisje. Bereid één buis met kralen per monster. Was de kralen drie keer met milliliter Buffer B2 door te vortexen om op te schorsen, toe te passen op een magneet om de kralen te scheiden en het wasbuffer af te zuigen.
Voeg vervolgens 900 microliter van het monster toe aan de gewassen kralen. De rest van het monster wordt gebruikt voor invoer-DNA en eiwitisolatie. Roter de suspensie een nacht bij vier graden Celsius.
De volgende dag, plaats de monsters in een magnetisch microfugebuisjesrek en verwijder de supernatant. Resuspendeer de kralen voorzichtig in één milliliter Buffer B2, voordat u roteren bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Verwijder de supernatant opnieuw met behulp van de magnetische microfugebuisjesrek.
Resuspendeer deze keer de kralen voorzichtig in één milliliter Buffer B3 en roter gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Na het verwijderen van het supernatant van de beadmix met behulp van de magneet, resuspendeer de kralen in 50 microliter van 2x Laemmli monsterbuffer om DNA-eiwitcomplexen te alluderen. Kook vervolgens de monsters gedurende 15 minuten bij 95 graden Celsius.
Vortex een mix voordat u de monsters snel in een microfuge draait. Breng de monsters op de magneet aan en breng de toewijzing over naar een nieuwe buis. Ten slotte vries de monsters snel in en bewaar ze bij 80 graden Celsius.
Voer eiwitanalyse uit zoals beschreven in het tekstprotocol. EdC-labeling werd uitgevoerd gedurende nul, 20, 40 of 60 minuten gevolgd door de zuivering van vireel DNA en geassocieerde eiwitten. De eluteerde eiwitten werden onderworpen aan coomassie blauwkleuring en western blotting met het antilichaam specifiek voor virale DNA-bindende eiwitten, ICP4 en UL42.
De pijl geeft streptavidin aan dat tijdens elutie van de kralen werd verwijderd, wat onder alle omstandigheden aanwezig is. Eiwitten geïsoleerd door deze methode worden vervolgens onderworpen aan massaspectrometrie. De cirkeldiagram illustreert het aantal eiwitten in elke functionele categorie dat geassocieerd werd met Herpes Simplex virus type op genomen zes uur na infectie.
Een nadere blik op eiwit-eiwitinteracties tussen ge
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol heeft als doel Herpes Simplex virus type één DNA te zuiveren uit geïnfecteerde cellen voor de proteomische analyse van eiwitten die geassocieerd zijn met het virale genoom. Het biedt inzicht in de rol van cellulaire factoren bij Herpes virus infectie.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Virologie
- Proteomics
- Celbiologie
Achtergrond
- Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) is een veelvoorkomend viraal pathogeen.
- Inzicht in eiwitten die geassocieerd zijn met het virale genoom is cruciaal voor de therapeutische ontwikkeling.
- Cellulaire factoren spelen een significante rol in de dynamiek van virale infecties.
- Huidige methoden voor het isoleren van viraal DNA kunnen worden verbeterd wat betreft specificiteit en efficiëntie.
Doel van de studie
- Om viraal DNA uit geïnfecteerde cellen te isoleren.
- Om eiwitten te analyseren die geassocieerd zijn met het virale genoom.
- Om de methode aan te passen voor verschillende populaties van viraal DNA.
Gebruikte methoden
- Kweken van MRC-5-cellen.
- Verdunnen van HSV-1 in koude tris-gebufferde zoutoplossing (TBS).
- Uitschakelen van de ventilator in de weefselkweekkast om uitdroging van de cellen te voorkomen.
- Volgen van een gedetailleerd protocol voor de zuiveringsstappen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle zuivering van HSV-1 DNA uit geïnfecteerde cellen.
- Identificatie van eiwitten die geassocieerd zijn met het virale genoom.
- Inzichten in de interactie tussen cellulaire factoren en virale infectie.
- Aanpasbaarheid van de methode voor diverse virale DNA-populaties.
Conclusies
- De methode isoleert viraal DNA effectief voor proteomische analyse.
- Het vergroot het begrip van de mechanismen van virale infectie.
- Toekomstige toepassingen kunnen de identificatie van therapeutische targets omvatten.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Directe zuivering van HSV-1 DNA uit geïnfecteerde cellen maakt een volledige identificatie mogelijk van virale en gastheerproteïnen die geassocieerd zijn met replicerende virale genomen. Deze mogelijkheid bevordert de mechanistische risicoreductie en doelwitvalidatie op het grensvlak van virologie en proteomica, wat het voorspellende vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase ondersteunt. De aanpasbaarheid van de methode aan andere DNA-virussen positioneert deze als een herbruikbaar platform voor portfolio-brede studies naar virus-gastheerinteracties.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt het mogelijk om proteïnecomplexen bij virale replicatievorken te onderzoeken voor mechanistisch inzicht.
- Ondersteunt functionele targetvalidatie door associaties tussen gastheer- en virale proteïnen met viraal DNA in kaart te brengen.
- Faciliteert biologische risicoreductie door cellulaire factoren te onthullen die kritiek zijn voor de uitkomst van infecties.
- Biedt een basis voor voorspellende betrouwbaarheid bij de selectie van antivirale targets.
Screening & assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde viraal DNA-eiwitcomplexen voor voor downstream massaspectrometrie-workflows.
- Standaardiseert de isolatie van replicatiespecifiek DNA voor reproduceerbare proteomische assays.
- Genereert kwantitatieve gegevens over eiwitassociaties om strategieën voor compound screening te informeren.
- Maakt schaalbare aanpassing mogelijk aan verschillende virale populaties of infectiestadia.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt proteomische bevindingen uit met ziekterelevante interacties tussen virus en gastheer voor de translationele ontdekking van biomarkers.
- Ondersteunt de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie van antivirale mechanismen.
- Vermindert risico's bij beslissingen over verdere ontwikkeling door gastheer-afhankelijkheidsfactoren bij infectie te verduidelijken.
- Biedt mechanistische context voor de selectie en validatie van preklinische modellen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode integreert op het snijvlak van vroege ontdekking en lead-identificatie, waardoor directe analyse van viraal-gastheer eiwitcomplexen mogelijk wordt en downstream screening en translationeel onderzoek worden ondersteund.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing van interacties tussen virale genomen en eiwitten en het in kaart brengen van signaalpaden.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve proteomische resultaten voor de ontwikkeling van assays.
- Analytica: Biedt identificatie en categorisatie van geassocieerde eiwitten op basis van massaspectrometrie.
- Translationeel onderzoek: Verbindt gegevens over virale-gastheer-eiwitten met ziekterelevante mechanismen en biomarkerstrategieën.
- Enterprise-hergebruik: Aanpasbaar aan andere DNA-virussen en infectiemodellen voor een brede impact op R&D.
Operationele impact & impact op de onderneming
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in studies naar virale infecties.
- Operationele waarde: Standaardiseert de zuivering van viraal DNA-eiwit voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen en verbetert de kapitaalefficiëntie bij de ontdekking van antivirale middelen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van virale targets en gastheerafhankelijke factoren mogelijk.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in virologie, proteomics en massaspectrometrie-analyse.
- Vereist toegang tot celcultuur, click-chemie-reagentia en geavanceerde analytische instrumentatie.
- Vereist strikte standaardisatie tussen teams om contaminatie te voorkomen en reproduceerbaarheid te waarborgen.
- Aanpasbaar voor verschillende DNA-virussen en infectiemodellen door optimalisatie van het protocol.
- Afhankelijk van zorgvuldige hantering om contaminatie met DNAse en protease te vermijden, zoals vermeld in het protocol.
