Chip-op basis van drie-dimensionale Cultuur van de Cel in doorbloed Micro-bioreactoren

Hallo, ik ben Eric Gottwald en ik ben onderzoekswetenschapper bij het Institute for Biological Interfaces van het Ware Institute of Technology. En vandaag wil ik je graag kennis laten maken met ons chip-gebaseerde geperfundeerde Micro bioactieve systeem. Voordat we de chip kunnen gebruiken in celcultuurtoepassingen, moeten we het polymeer hydrolyseren en het micro-gestructureerde gebied de-raten.

Dit wordt bereikt door de chip simpelweg enkele seconden in een verschillende concentraties isopropanol te dopen, beginnend met 100%Ik doop de chip slechts enkele seconden in elke concentratie en de laatste stap is gewoon water. Daarna wordt de chip gedroogd en tenslotte moeten we de chip coaten met een collageen, één oplossing om de hechting van de cellen aan het polymeer te vergemakkelijken. Dit wordt gedaan door slechts een paar druppels van een collageen, één oplossing bovenop het micro-gestructureerde gebied te druppelen, en in deze staat wordt de chip 's nachts bij vier graden Celsius geïncubeerd.

Na de overnachting met de collageen een oplossing, wordt de oplossing verwijderd en wordt de chip gewassen met steriele PBS Daarna wordt ook de PBS verwijderd en de chip is nu klaar voor de inoculatie van de cellen. Nu gaan we de celchip inoculeren met een suspensie van enkele cellen, en dit gebeurt door slechts 150 microliters celsuspensie bovenop het micro-gestructureerde gebied te plaatsen. Na de depositie van de cellen wordt de chip drie uur bij 37 graden in een incubator geïncubeerd.

Na de drie uur durende incubatieperiode wordt de chip uit de incubator verwijderd en is nu klaar voor de invoeging in de ector. Hiervoor wordt de ector uit de steriele verpakking gehaald en de steriliteit wordt bereikt door middel van gammastraling van deze transparante folie. Dus we hoeven alleen maar de verpakking te openen en de ector te verwijderen.

Wat we vervolgens zullen doen, is dat we de bovenkant van de fles in dit middelreservoir steken, zodat we de bioreactorhuisvesting kunnen demonteren voor de invoeging van de chip. Nadat we de bioreactorhuisvesting hebben geopend, kunnen we nu de chip invoegen, wat wordt bereikt door de chip in de groef van de bioreactorhuisvesting te plaatsen en de bactor kan nu weer worden geassembleerd. Wat we uiteindelijk moeten doen, is dat we twee steriele filters op het middelreservoir en een steriele bemonsteringspoort moeten aansluiten.

Voor het meten van de werkelijke zuurstofspanning in de gesloten circulatieloop, zullen we twee zuurstofsensoren invoegen door ze gewoon tussen deze twee connectoren te monteren. De bactor is nu klaar om te worden gevuld met kweekmedium. Het bactor-systeem is nu klaar om te worden gevuld met celkweekmedium, en dit wordt bereikt door eenvoudigweg de gesloten circulatieloop aan te sluiten op de rollerpomp.

Hierdoor derateren we tegelijkertijd de hele bactor-circulatie. Zoals je hier in het Ector-venster kunt zien, kun je het medium zien opkomen van onderaf en op en op, en het bactor verlaten aan de bovenkant. Voordat we het Bactor-systeem in de incubator plaatsen, controleren we op bel-vrije vulling van de circulatieloop.

Nu is het systeem volledig gevuld met celkweekmedium en kunnen we de bioreactor naar de incubator overbrengen. Nu zullen we de bi rector in de incubatiekamer plaatsen. En hiervoor wordt de bi rector eerst aangesloten op de rollerpomp, zoals je al kort geleden hebt gezien, en nu wordt de ector actief geperfundeerd door dit medium vanuit de fles.

En om de omgevingszuurstofconcentratie te handhaven, verbinden we het middelreservoir met de gastoevoer. En tenslotte zullen we twee zuurstofsensoren aansluiten op de circulatie om de zuurstofspanning in het systeem online te monitoren. Nu is de opstelling compleet en kan hij draaien zolang je het experiment hebt ontworpen.

Een van de krachtigste hulpmiddelen tijdens de analyse van de organotypische functies van de cellen in de MicroCon-containers is de laserscanningmicroscoop, die je hier kunt zien. De laserscanningmicroscoop geeft ons de mogelijkheid om in elke afzonderlijke MicroCon-container te kijken zonder vernietiging. En omdat de MicroCon-containers of de chip kunnen worden gebruikt voor conventionele immunokleuring immunofluorescence-methoden, kunnen we allerlei markeringen en organotypische functies detecteren in de microcontainers.

Zoals je hier in de, in de animatie van deze, van deze chip kunt zien, is de bodem volledig gevuld met cellen, evenals de wanden van de MicroCon-containers. We hebben veel cellen die behoorlijk levend zijn, en we hebben heel, heel weinig dode cellen. De volgende afbeelding laat je zien dat we allerlei organotypische functies kunnen detecteren in de MicroCon-container.

Zo bijvoorbeeld voor hepatocyten, de albumineproductie of de E-expressie in de cellen, wat je hier mooi in de overlay kunt zien. De nucle ir is in het blauw gekleurd. De eco hierin is in het groen gekleurd, en het albumine wordt geëxpresseerd of in het rood gekleurd.

En zoals je hier mooi kunt zien, worden alle organotypische functies die je van hepatocyten verwacht, mooi geëxpresseerd in dit soort 3D-cultuur. Verder hebben we gekeken naar een andere hepatocytenmarker, en dit was cytokeratine 18, en deze afbeelding laat je zien dat cytokeratine 18 ook mooi wordt geëxpresseerd in dit soort culturen. En dit zal je hopelijk overtuigen dat dit soort organotypische functies ook nuttig kunnen zijn voor andere organotypische culturen.

Na het einde van het Biore-experiment kan de chip worden gebruikt voor de isolatie van allerlei cellulaire componenten, zoals bijvoorbeeld totaal RNA. Zoals je hier kunt zien, laten we je hier totaal RNA zien, dat is geïsoleerd uit het bioreactorsysteem. Dit totaal RNA kan vervolgens worden gebruikt voor downstream-toepassingen zoals bijvoorbeeld realtime PCR, of zoals je hier kunt zien, microarray-analyse.

Bovendien kunnen intacte cellen worden geïsoleerd uit het systeem en die cellen kunnen vervolgens worden gebruikt voor conventionele flowcytometrie-analyse. Zoals je hier kunt zien, hoop ik dat we je kunnen laten zien dat het systeem nuttig kan zijn voor allerlei toepassingen waar organotypische reacties vereist zijn en dat het systeem ook nuttig kan zijn voor allerlei soorten toepassingen die we tot nu toe niet hebben overwogen, zoals