Name: Chip-op basis van drie-dimensionale Cultuur van de Cel in doorbloed Micro-bioreactoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-05-21T20:23:00.000+00:00
Duration: 12 min 39 s
Description: Leer een chip-gebaseerd platform voor driedimensionale celkweek in micro-bioreactoren met gecontroleerde omstandigheden. Dit systeem ondersteunt tot 10 miljoen cellen en biedt veelzijdige toepassingen voor celbiologie en biotechnologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We willen graag Mechthild Herschbach en Anke Dech bedanken voor de uitstekende technische ondersteuning.

Dit document beschrijft het gebruik van een chip-gebaseerde platform (fig. 1) voor de drie-dimensionale teelt van cellijnen en primaire cellen. Aangezien veel cellen te uiten organotypische werkt alleen in een 3D-omgeving, hebben we een polymeer chip die een steiger waarop de cellen kunnen zich in alle ruimtelijke richtingen biedt, en dat kan worden gemonteerd in een bioreactor behuizing voor de controle van de vloeistofstroom , zuurstofspanning etc. Afhankelijk van de proefopzet, kan het oppervlak van het polymeer gemodificeerd door verschillende technieken, bijvoorbeeld UV-bestraling, PECVD, γ-enten of conventionele natte chemie. <img src="/files/ftp_upload/old/564_2008_9_19_6/564_Figure-01.png" alt="564_Figure-01.png" width="546" height="386" /> Figuur 01 1. Ontluchting en hydrophilisation van de chip Voor het gebruik, de chip moet worden ontlucht en hydrophilized. Hiervoor is een alcohol-serie uitgevoerd. Isopropanol oplossingen bestaande uit 100%, 70%, 50%, 30% isopropanol in DMPC-behandelde water worden voorbereid en de chip is gedoopt in iedere concentratie, te beginnen met de 100%-oplossing, voor maximaal de jaren &#39;30. De laatste stap van de serie bestaat uit pure Dimethyl pyrocarbonate (DMPC)-behandeld water. Vanaf dit punt, is het belangrijk om de chip nat. 2. Collageen I coating Na de alcohol-serie, is de chip meestal bedekt met een collageen I oplossing van rattenstaart. Van het collageen voorraad oplossing van 2 mg / ml in 0,2% azijnzuur een hoeveelheid die overeenkomt met 30 ug eiwit collageen is verdund met DMPC-behandeld water tot een eindvolume van 150 ul. Dit resulteert in een collageen coating van de chip oppervlak met een dichtheid van 10 ug collageen I per cm 2 oppervlakte. 3. Inoculatie van hepatocellulair carcinoom cellen Hepatocellulair carcinoom cellen van lijn Hep G2 zijn getrypsiniseerd en geteld. Voor de korte termijn experimenten (1 tot 6 dagen) 5 * 10 6 cellen worden geënt in elke chip en de bijbehorende controle 6 cm weefselkweek petrischaaltjes. Om inoculte, zijn de chip 5 * 10 6 cellen geresuspendeerd in 150 ul kweekmedium en geplaatst op de top van de microstructured oppervlakte van de chip (fig. 2). Daarna wordt het geplaatst in een incubator voor 2-3 uur. Tijdens deze incubatieperiode van de cellen sediment in de micro-containers en zich houden aan de collageen I-gecoate schavot. <img src="/files/ftp_upload/old/564_2008_9_19_7/564_Figure-02.png" alt="564_Figure-02.png" width="300" height="225" /> Figuur 2 4. Het inbrengen van de chip in de bioreactor behuizing Na de incubatieperiode wordt de chip verwijderd uit de incubator en gemonteerd in de bioreactor behuizing. Voor deze, onder de schone bank, is de voorgemonteerd bioreactor verwijderd uit de steriele verpakking en gedemonteerd in een mate die het mogelijk maakt voor het inbrengen van de chip. De chip wordt zorgvuldig omgegaan met een steriele pincet en geplaatst in de groef, dat de pakking, die sluit de chip en die resulteert in het genereren van een bovenste en onderste compartiment in de bioreactor bevat. Daarna wordt de bioreactor weer gemonteerd en overgebracht naar de incubator, waar deze is aangesloten op de pomp, de gastoevoer en de zuurstof analyzer. 5. Het vullen van het systeem Zodra de bioreactor is verbonden met het medium reservoir, pomp-en gasvoorziening van de gesloten circulatie lus is gevuld met medium. Dit wordt gedaan door het plaatsen van de 3-weg-connectors op een zodanige wijze dat superfusie, die wordt gedefinieerd als de stroom van medium over de bovenkant van de chip, is bereikt. Dit leidt tot een ontlading van de ingesloten lucht uit de bioreactor circulatie, zonder het verwijderen van de cellen uit het schavot. Nadat het systeem volledig is gevuld met medium, zijn de 3-weg-connectors overgestapt op een zodanige wijze dat de perfusie, wat wordt gedefinieerd als de doorstroming van onderaf de chip door het weefsel, is bereikt. In de perfusie configuratie de stroom wordt aangepast aan de behoeften van de cel die doorgaans voor de hepatocyten varieert 60 tot 500 pl / min. 6. Monsterneming Tijdens het experiment medium monsters kunnen worden getrokken. Hiervoor zijn spuiten verbonden met de steriele-poorten op de top van het medium reservoir. Na de bemonstering, worden de poorten gesteriliseerd met 70% isopropanol. 7. Isolatie van intacte cellen van de chip voor downstream toepassingen Aan het einde van het experiment worden de bioreactoren losgekoppeld van de gasvoorziening en de rol pomp, overgebracht naar de schone bank en gedemonteerd zoals eerder beschreven. Met een steriel pincet de chip wordt verwijderd uit de bioreactor behuizing, geplaatstin een 3,5 cm petrischaal en gespoeld met PBS. Daarna is de chip geïncubeerd met trypsine / EDTA (0,25% / 0.53mM) voor 5-15 min in een couveuse op de cellen van de microstructured gebied los te maken. De verzamelde celsuspensie wordt gecentrifugeerd voor 5 minuten bij 600 g. De cellen kunnen vervolgens worden gebruikt voor conventionele downstream toepassingen, bijv., totaal RNA of eiwit geïsoleerd. Routinematig, we isoleren totaal RNA (PARIS kit, Ambion Inc, Austin, Texas, USA) voor de microarray analyse en real-time RT-PCR. Eiwitexpressie wordt geanalyseerd na immunohistochemische kleuring van de cellen in de chip met een laser scanning microscoop, maar kan ook op andere wijze worden geanalyseerd, bijvoorbeeld door flowcytometrie.

<ol><li>Berry, M. N., Friend, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yield+preparation+of+isolated+rat+liver+parenchymal+cells%3A+A+biochemical+and+fine+structural+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: A biochemical and fine structural study.</a> J. Cell Biol. 53, 506-520 (1969).</li>
<li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+rat+liver+cells.+3.+Enzymatic+requirements+for+tissue+dispersion%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Preparation of rat liver cells. 3. Enzymatic requirements for tissue dispersion.</a> Exp. Cell Res. 82, 391-398 (1973).</li>
<li>Giselbrecht, S., Gietzelt, T., Gottwald, E., Trautmann, C., Truckenmueller, R., Weibezahn, K. F., Welle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+tissue+culture+substrates+produced+by+microthermoforming+of+pre-processed+polymer+films%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdev%22%5BJournal%5D)">3D tissue culture substrates produced by microthermoforming of pre-processed polymer films.</a> Biomed. Microdev. 8, 191-199 (2006).</li>
<li>Welle, A., Gottwald, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UV-based+patterning+of+polymeric+substrates+for+cell+culture+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdev%22%5BJournal%5D)">UV-based patterning of polymeric substrates for cell culture applications.</a> Biomed. Microdev. 4, 33-41 (2002).</li>
<li>Gottwald, E., Giselbrecht, S., Augspurger, C., Lahni, B., Dambrowsky, N., Truckenmueller, R., Piotter, V., Gietzelt, T., Wendt, O., Pfleging, W., Welle, A., Rolletschek, A., Wobus, A. M., Weibezahn, K. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chip-based+platform+for+the+in+vitro+generation+of+tissues+in+three-dimensional+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A chip-based platform for the in vitro generation of tissues in three-dimensional organization.</a> Lab Chip. 7, 777-785 (2007).</li>
<li>Eschbach, E., Chatterjee, S. S., Noldner, M., Gottwald, E., Dertinger, H., Weibezahn, K. -F., Knedlitschek, G., G, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microstructured+scaffolds+for+liver+tissue+with+high+density%3A+Morphological+and+biochemical+characterization+of+tissue+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Microstructured scaffolds for liver tissue with high density: Morphological and biochemical characterization of tissue aggregates.</a> J. Cell. Biochem. 95, 243-255 (2005).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te melden.

We hebben een chip-gebaseerde platform voor de drie-dimensionale kweken van cellen in actief doorbloed micro-bioreactoren. De chips kunnen worden vervaardigd uit niet-biologisch afbreekbare en biologisch afbreekbare polymeren door micro-spuitgieten, hot embossing en micro thermoforming technieken 3. Afhankelijk van het experimenteel ontwerp, kan het oppervlak van het polymeer gemodificeerd door UV-bestraling 4. Hepatocyt cellijnen en primaire rattenhepatocyten met succes kunnen worden geteeld in deze apparaten als kan ...

<table><tbody><tr><td>Cellen</td><td>Overig</td><td>ATCC</td><td>HB-8065</td><td></td></tr><tr><td>Collageen I uit rattenstaart</td><td>Reagens</td><td>Roche Group</td><td>11 179 179 001</td><td></td></tr><tr><td>PARIS-kit</td><td>Reagens</td><td>Ambion</td><td>AM1921</td><td></td></tr><tr><td>Syto16</td><td>Reagens</td><td>Invitrogen</td><td>S7578</td><td></td></tr><tr><td>anti-cytokeratine 18</td><td>Antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab668</td><td>Primair Ab, muis monoklonaal, gebruikt 1/100 in PBS</td></tr><tr><td>Anti E-cadherine</td><td>Antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab1416</td><td>Primair Ab, muis monoklonaal, gebruikt 1/50 in PBS.</td></tr><tr><td>Geit anti-albumine</td><td>Reagens</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>E80-129</td><td>Primair Ab, geit anti-menselijk albumine, gebruikt 1/200 in PBS</td></tr><tr><td>Konijn anti-muis IgG1</td><td>Antilichaam</td><td>Invitrogen</td><td>A11059</td><td>Secundair Ab, Alexa Flour 488 geconjugeerd, gebruikt 1/100 in PBS + 0.5 % BSA</td></tr><tr><td>Cy3 anti-geit IgG</td><td>Reagens</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-165-003</td><td>Cy3 AffiniPure ezel a-geit IgG Ab, gebruikt 1/700 in PBS + 0.5% BSA</td></tr></tbody></table>

chip-op basis van drie-dimensionale cultuur van de cel in doorbloed micro-bioreactoren

Chip-based Three-dimensional Cell Culture in Perfused Micro-bioreactors

We hebben een chip-gebaseerde celcultuur systeem voor de drie-dimensionale kweken van cellen. De chip is meestal vervaardigd uit niet-biologisch afbreekbare polymeren, zoals polycarbonaat of polymethylmethacrylaat door micro-spuitgieten, micro hot embossing of micro thermovormen. Maar, het kan ook zijn vervaardigd uit biologisch afbreekbare polymeren. Heeft de volgende afmetingen zijn 0,7 x 1 20 x 20 x 0,7 1 mm (hxbxl). De belangrijkste kenmerken van de gebruikte chips zijn ofwel een raster van maximaal 1156 kubieke micro-containers (cf-chip) elk ter grootte van 120 tot 300 x 300 x 300 μ (hxbxl) of ronde uitsparingen met een diameter van 300 μ en een diepte van 300 μ (r-chip). De steiger kan huis 10 miljoen. cellen in een drie-dimensionale configuratie. Voor een optimale voedingsstoffen-en gasvoorziening, wordt de chip ingebracht in een bioreactor behuizing. De bioreactor is een onderdeel van een gesloten steriele oplage lus die, in de eenvoudigste configuratie, Additionaly bestaat uit een roller pomp en een medium reservoir met een gastoevoer. De bioreactor kan worden uitgevoerd in perfusie, superfusie, of zelfs een gemengde modus. We hebben met succes gecultiveerd cellijnen en primaire cellen over periodes van enkele weken. Voor de rat primaire levercellen konden we zien een behoud van de organotypische functies voor meer dan 2 weken. Voor hepatocellulair carcinoma cellijnen konden we geven de inductie van lever specifieke genen niet of nauwelijks geformuleerd in norm monolaag cultuur. Het systeem kan ook nuttig zijn als een stamcel teeltsysteem sinds de eerste experimenten met differentiatie stamcellijnen waren veelbelovend.

Beschrijven we een chip-gebaseerde platform voor de drie-dimensionale kweken van cellen in micro-bioreactoren. Een chip kan maximaal huis tot 10 miljoen. cellen die kunnen worden geteeld onder nauwkeurig omschreven voorwaarden met betrekking tot stroming, zuurstofspanning enz. in een steriele, gesloten circulatie lus.

Chip-op basis van drie-dimensionale Cultuur van de Cel in doorbloed Micro-bioreactoren

Wij hebben een chipgebaseerd celkweek-systeem ontwikkeld voor de driedimensionale cultivatie van cellen. De chip wordt doorgaans vervaardigd uit ...

Hallo, ik ben Eric Gottwald en ik ben onderzoeker bij het Institute for Biological Interfaces van het Ware Institute of Technology. Vandaag wil ik u kennis laten maken met ons chipgebaseerde geperfuseerde micro-bioactieve systeem. Voordat we de chip kunnen gebruiken in celkweektoepassingen, moeten we het polymeer hydrolyseren en het microgestructureerde gebied ontgasen.Dit wordt bereikt door de chip simpelweg in verschillende concentraties isopropanol te dopen, beginnend bij 100%. Ik dip de chip slechts enkele seconden in elke concentratie en de laatste stap is enkel water. Daarna wordt de chip gedroogd en tot slot moet de chip worden gecoat met een collageen-1-oplossing om de adhesie van de cellen aan het polymeer te vergemakkelijken. Dit gebeurt door slechts enkele druppels van een collageen-1-oplossing op het microgestructureerde gebied te druppelen, waarna de chip in deze toestand gedurende de nacht wordt geïncubeerd bij 4 °C.Na de incubatie van een nacht met de collageen one-oplossing wordt de oplossing verwijderd en wordt de chip gewassen met steriele PBS. Vervolgens wordt ook de PBS verwijderd, waarna de chip gereed is voor de inoculatie van de cellen. Nu inoculeren we de ce

chip-based-three-dimensional-cell-culture-perfused-micro

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In het verleden tal van in vitro-cultuur systemen - met name monolaagculturen - vaak last van het nadeel dat gedifferentieerde primaire cellen een relatief korte levensduur hebben en de-gedifferentieerde tijdens de cultuur. Als gevolg daarvan werden de meeste van hun orgaan-specifieke functies snel verloren. Zo, met het oog op betere voorwaarden voor deze cellen in vitro te reproduceren, zijn wijzigingen en aanpassingen gedaan om de conventionele monolaagculturen.

Interview: bioreactoren en ondergedompeld-Modified 3D-Stellingen voor stamcelonderzoek

In dit protocol, tonen we de fabricage van een Microactuator reeks van verticaal verschoven berichten op de technologie gebaseerd is, en hoe deze basistechnologie kunnen worden gewijzigd om high-throughput mechanisch dynamische celkweek te voeren in zowel twee-dimensionale en drie-dimensionale cultuur paradigma's.

Microfabricated Platforms voor Mechanisch Dynamic Cel Cultuur

In dit protocol wordt de fabricage, installatie en basisbediening van een microfluïdische picoliter bioreactor (PLBR) voor single-cel analyse van prokaryotische micro-organismen geïntroduceerd. Industrieel relevante micro-organismen werden geanalyseerd als bewijs van principe, waardoor inzichten in groeisnelheid, morfologie en fenotypische heterogeniteit over bepaalde tijdsperioden mogelijk werden, wat nauwelijks mogelijk is met conventionele methoden.

Microfluïdische Picoliter Bioreactor voor Microbiële Eéncellige Analyse: Fabricage, Systeemopstelling en Werking

Hier presenteren we een protocol om primaire cellen, weefselmodellen en punchbiopten gedurende maximaal 28 dagen te cocultiveren in een microfluïdische multi-orgaan chip. Humane dermale microvasculaire endotheelcellen, leveraggregaten en huidbiopten werden met succes gecombineerd in een gemeenschappelijke mediacirculatie.

De Multi-orgel Chip - Een Microfluïdische platform voor lange termijn Multi-weefsel Coculture

We beschrijven een methode om apparaten te construeren voor 3D-cultuur en experimenten met cellen en multicellulaire organoids. Dit apparaat maakt analyse van cellulaire reacties op oplosbare signalen in 3D-micromilieus met gedefinieerde chemoattractant gradiënten. Organoids zijn beter dan enkele cellen bij de opsporing van zwakke luidruchtige ingangen.

3D-analyse van multi-cellulaire reacties op chemoattractant gradiënten

Dit protocol toont methoden om een uitgebreide in vitro cultuur van patiënt-afgeleide xenografts (PDX) mogelijk te maken. Een stap verbetert de algehele levensvatbaarheid van meercellige clusterculturen in 3D hydrogels, door eenvoudige verwijdering van niet-levensvatbare enkele cellen. Een secundaire stap toont best practices voor PDX-cultuur in een geperfundeerd microfluïdisch platform.

Verbeterde levensvatbaarheid voor Ex vivo 3D Hydrogel Culturen van patiënt-afgeleide Xenografts in een perfused microfluïdisch platform

We presenteren een microfluïdisch systeem voor studies met hoge doorvoer op complexe levensmachines, dat bestaat uit 1500 kweekeenheden, een reeks verbeterde peristaltische pompen en een on-site mengmodulus. De microfluïdische chip maakt de analyse van de zeer complexe en dynamische micromilieuomstandigheden in vivo mogelijk.

Generatie van dynamische omgevingsomstandigheden met behulp van een microfluïdisch apparaat met hoge doorvoer

Dit artikel presenteert een methode om een goedkoop, meerkanaals perfusiecelkweeksysteem te construeren en te gebruiken voor het meten van de dynamiek van secretie en absorptiesnelheden van opgeloste stoffen in cellulaire processen. Het systeem kan cellen ook blootstellen aan dynamische stimulusprofielen.

Multi-Stream Perfusion Bioreactor geïntegreerd met Outlet Fractionation voor dynamische celcultuur

Dit protocol presenteert de opzet en werking van een nieuw ontwikkelde, 3D-geprinte bioreactor voor de ex vivo kweek van bloedvaten in perfusie. Het systeem is ontworpen om gemakkelijk door andere gebruikers te worden overgenomen, praktisch, betaalbaar en aanpasbaar aan verschillende experimentele toepassingen, zoals basisbiologie en farmacologische studies.

Ex Vivo Perfusiecultuur van grote bloedvaten in een 3D-geprinte bioreactor

Ons gedetailleerde protocol schetst de creatie en het gebruik van het geavanceerde darm-op-chip-model, dat menselijk darmslijmvlies simuleert met 3D-structuren en verschillende celtypen, waardoor een diepgaande analyse van immuunresponsen en cellulaire functies als reactie op microbiële kolonisatie mogelijk is.

Immunocompetent darm-op-chip-model voor het analyseren van immuunresponsen van het darmslijmvlies

Hier presenteren we protocollen met gedetailleerde instructies voor het implementeren van 3D-celculturen met behulp van collageen- en collageen-agarosematrices in een microfysiologisch systeem. Deze protocollen ondersteunen de co-cultuur van spheroïden in de nierproximale tubulus en niercelcarcinoom, waardoor in vivo omstandigheden worden gesimuleerd en geavanceerd onderzoek naar interacties tussen nierkankercellen mogelijk wordt.

Microfluïdische co-cultuur van gezond nier- en tumorepitheel om de progressie van nierkanker te modelleren

Leer een chip-gebaseerd platform voor driedimensionale celkweek in micro-bioreactoren met gecontroleerde omstandigheden. Dit systeem ondersteunt tot 10 miljoen cellen en biedt veelzijdige toepassingen voor celbiologie en biotechnologie.

Chip-op basis van drie-dimensionale Cultuur van de Cel in doorbloed Micro-bioreactoren

Meer video's verkennen