Chip-op basis van drie-dimensionale Cultuur van de Cel in doorbloed Micro-bioreactoren

Hallo, ik ben Eric Gottwald en ik ben onderzoeker bij het Institute for Biological Interfaces van het Ware Institute of Technology. Vandaag wil ik u kennis laten maken met ons chipgebaseerde geperfuseerde micro-bioactieve systeem. Voordat we de chip kunnen gebruiken in celkweektoepassingen, moeten we het polymeer hydrolyseren en het microgestructureerde gebied ontgasen.

Dit wordt bereikt door de chip simpelweg in verschillende concentraties isopropanol te dopen, beginnend bij 100%. Ik dip de chip slechts enkele seconden in elke concentratie en de laatste stap is enkel water. Daarna wordt de chip gedroogd en tot slot moet de chip worden gecoat met een collageen-1-oplossing om de adhesie van de cellen aan het polymeer te vergemakkelijken. Dit gebeurt door slechts enkele druppels van een collageen-1-oplossing op het microgestructureerde gebied te druppelen, waarna de chip in deze toestand gedurende de nacht wordt geïncubeerd bij 4 °C.

Na de incubatie van een nacht met de collageen one-oplossing wordt de oplossing verwijderd en wordt de chip gewassen met steriele PBS. Vervolgens wordt ook de PBS verwijderd, waarna de chip gereed is voor de inoculatie van de cellen. Nu inoculeren we de celchip met een suspensie van enkelvoudige cellen; dit gebeurt door simpelweg 150 µL cel-suspensie op het microgestructureerde gebied aan te brengen. Na de depositie van de cellen wordt de chip gedurende drie uur bij 37 °C in een incubator geïncubeerd.

Na de incubatieperiode van drie uur wordt de chip uit de incubator gehaald en is deze nu klaar voor insertie in de ector. Hiervoor wordt de ector uit de steriele verpakking gehaald; de steriliteit is bereikt door gammastraling van deze transparante folie. We hoeven dus alleen de verpakking te openen en de ector te verwijderen.

Vervolgens plaatsen we de bovenkant van de fles in dit mediumreservoir, zodat we de behuizing van de bioreactor kunnen demonteren om de chip te kunnen plaatsen. Nadat de behuizing van de bioreactor is geopend, kunnen we de chip invoeren door deze simpelweg in de gleuf van de behuizing van de bioreactor te plaatsen, waarna de bioreactor weer kan worden gemonteerd. Tot slot moeten we twee steriele filters en één steriele bemonsteringspoort aan het mediumreservoir koppelen.

Voor de meting van de werkelijke zuurstofspanning in de gesloten circulatielus plaatsen we twee zuurstofsensoren door deze simpelweg tussen deze twee connectoren te monteren. De bactor is nu klaar om te worden gevuld met kweekmedium. Het bactor-systeem is nu gereed om te worden gevuld met celkweekmedium, wat wordt bereikt door de gesloten circulatielus eenvoudig aan de rollerpomp aan te sluiten.

Hiermee zullen we gelijktijdig de gehele bactor-circulatie ontluchten. Zoals u hier in het Ector-venster kunt zien, stijgt het medium van onderen op en verlaat het de bactor aan de bovenzijde. Voordat we het Bactor-systeem in de incubator plaatsen, controleren we of de circulatielus bubbelvrij is gevuld.

Nu is het systeem volledig gevuld met celkweekmedium en kunnen we de bioreactor naar de incubator overbrengen. We plaatsen de bioreactor nu in de incubatiekamer. Hiervoor wordt de bioreactor eerst aangesloten op de rollerpomp, zoals u kort daarvoor al heeft gezien, waardoor de bioreactor nu actief wordt geperfuseerd door dit medium uit de fles.

Om de omgevingszuurstofconcentratie te handhaven, verbinden we het mediumreservoir met de gastoevoer. Ten slotte verbinden we twee zuurstofsensoren met de circulatie om de zuurstofspanning in het systeem online te monitoren. De opstelling is nu compleet en kan worden uitgevoerd gedurende de door u voor het experiment ontworpen periode.

Een van de krachtigste instrumenten bij de analyse van de organotypische functies van de cellen in de MicroCon-containers is de laser-scanning microscoop, die u hier ziet. De laser-scanning microscoop biedt ons de mogelijkheid om in elke individuele MicroCon-container te kijken zonder deze te vernietigen. En omdat de MicroCon-containers of de chip gebruikt kunnen worden voor conventionele immunokleuring- en immunofluorescentiemethoden, zijn we in staat om allerlei markers en organotypische functies in de microcontainers te detecteren.

Zoals u hier in de animatie van deze chip kunt zien, is de bodem volledig gevuld met cellen, evenals de wanden van de MicroCon-container. Er zijn volop vitale cellen aanwezig en er zijn zeer weinig dode cellen. De volgende afbeelding laat zien dat we alle soorten organotypische functies binnen de MicroCon-container kunnen detecteren.

Zo kan bijvoorbeeld voor hepatocyten de albumineproductie of de expressie van E in de cellen worden waargenomen, wat hier duidelijk te zien is in de overlay. De kernen zijn blauw gekleurd. De eco herein is groen gekleurd en het albumine is rood tot expressie gebracht of gekleurd.

En zoals hier duidelijk te zien is, worden alle organotypische functies die men van hepatocyten verwacht, goed tot uiting gebracht in dit type 3D-cultuur. Verder hebben we gekeken naar een andere hepatocytmarker, namelijk cytokeratine 18, en deze afbeelding laat zien dat cytokeratine 18 eveneens goed tot uiting komt in dit soort culturen. Hopelijk overtuigt dit u ervan dat dit type organotypische functies ook nuttig kan zijn voor andere organotypische culturen.

Na afloop van het Biore-experiment kan de chip worden gebruikt voor de isolatie van allerlei cellulaire componenten, zoals bijvoorbeeld totaal RNA. Zoals u hier kunt zien, tonen we hier het totaal RNA dat uit het bioreactorsysteem is geïsoleerd. Dit totaal RNA kan vervolgens worden gebruikt voor downstream-toepassingen, zoals bijvoorbeeld realtime PCR, of zoals u hier ziet, microarray-analyse.

Bovendien kunnen intacte cellen uit het systeem worden geïsoleerd, waarna deze cellen kunnen worden gebruikt voor conventionele flowcytometrie-analyse. Zoals u hier kunt zien, hopen we u hiermee te hebben aangetoond dat het systeem nuttig kan zijn voor allerlei toepassingen waarbij organotypische reacties vereist zijn, en dat het systeem mogelijk waardevol is voor alle soorten toepassingen die we tot nu toe niet hebben overwogen, zoals bijvoorbeeld toepassingen met stamcellen.