Overlappende Peptide bibliotheek Qa-1 Epitopes in een proteïne in kaart

Het algemene doel van deze procedure is om Qa-1-epitopen in eiwitten te identificeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van immuunregulatie en immunotherapie. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat gekartelde peptiden bekend zijn om Qa-1-beperkte CD8 T-cellen te stimuleren, en de procedure is eenvoudig uit te voeren.

De implicaties van deze techniek reiken tot therapeutische ontwerpen voor immuun-gemedieerde ziekten, zoals multiple sclerose. Hoewel deze methode inzicht kan geven in Qa-1-gemedieerde immuunregulatie bij dieren, kan deze ook worden toegepast op HLA-E-gemedieerde immuunregulatie bij mensen. Om de procedure te beginnen, ontwerp een bibliotheek van 15-mer peptiden, waarbij aangrenzende peptiden overlappen in 11 aminozuren.

Verkrijg en reconstrueer de peptiden onder steriele omstandigheden. Combineer voor elk peptide vijf milligram van het peptide met 100 microliter dimethylsulfoxide. Combineer 10 microliter van elk peptide-voorraad in een schone 1-milliliter cryo tube om de OLP-pool voorraad voor te bereiden.

Laad vervolgens 20 microliter van elk peptide-voorraad in een V-vormige 96-well plate, en verdun elke voorraad met 80 microliter steriele water. Bewaar zowel de resterende 50 milligram per milliliter peptide-voorraden als de plaat met 10 milligram per milliliter peptide-voorraden bij 20 graden Celsius. Voeg vervolgens 10 microliter van de OLP-pool voorraadoplossing toe aan een 15 milliliter buisje met twee milliliter geïrradieerd dendritisch cel in serumvrij medium, waardoor de DMSO tweehonderdvoudig wordt verdund.

Bewaar de resterende OLP-pool voorraad bij 20 graden Celsius. Incubeer de DC's met de OLP-pool bij kamertemperatuur gedurende drie uur. Schud de cellen elke 15 minuten voorzichtig met de hand.

Tijdens de incubatie, gebruik een kit om CD8+T cellen te zuiveren uit een geoogste muis milt of lymfeklieren. Bereid vijf milliliter van een oplossing met 10 miljoen T cellen per milliliter serumvrij medium met 50 eenheden per milliliter interleukine 2 en 100 eenheden per milliliter interleukine 7. De gezuiverde CD8 T cellen moeten vrij zijn van kralen, of onaangeroerd.

Plaats 0,5 milliliter van de T-cel oplossing in elk van de 10 putjes van een 48-well plaat. Zodra de incubatie van de OLP-pool-gepulseerde DC-oplossing voltooid is, voeg 10 milliliter serumvrij medium toe aan de DC's. Centrifugeer de cellen bij 300 keer G gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.

Vervolgens, reconstrueer de cellen in vijf milliliter serumvrij medium. Voeg 0,5 milliliter van de celsuspensie toe aan elk van de 10 putjes. Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius in een atmosfeer van 5% koolstofdioxide gedurende vier dagen.

Vervolgens, verwijder 400 microliter van het kweekmedium uit elk putje. Voeg 500 microliter vers serumvrij medium toe aan elk putje, bevattende 100 eenheden per milliliter van IL-2 en IL-7. Incubeer de cellen nog eens twee tot drie dagen voordat de OLP-pool-geprimede cellen opnieuw worden gestimuleerd.

Voorafgaand aan herstimulatie, verkrijg en bestraal muis peritoneale macrofagen. Pas de macrofagen concentratie aan tot vijf miljoen cellen per milliliter serumvrij medium. Combineer 10 microliter van de OLP-pool voorraad met twee milliliter van de bestraalde peritoneale macrofagen voor een uiteindelijke DMSO concentratie van 0,5% in volume.

Suppleer deze oplossing met 100 eenheden per milliliter van muis macrofagen koloniestimulerende factor. Vul een 48-well plaat met 200 microliter van de OLP-pool macrofagen oplossing in elk putje. Incubeer de plaat bij 37 graden Celsius gedurende vier uur.

Was vervolgens elk putje voorzichtig met 200 microliter voorverwarmd RPMI-0 medium. De macrofagen oplossing zal veel kralen bevatten. Voordat de OLP-pool-geprimeerde CD8 T cellen worden toegevoegd, moet de plaat onder een microscoop worden gecontroleerd om er zeker van te zijn dat alle putjes vrij zijn van kralen.

Verzamel vervolgens en pool de OLP-pool-geprimeerde CD8+T cellen die klaar zijn voor herstimulatie. Pas de T-cel concentratie aan tot één miljoen cellen per milliliter in serumvrij medium bevattende 25 eenheden per milliliter van IL-2, en 50 eenheden per milliliter van IL-7. Voeg één milliliter van de gepoolde T-cel oplossing toe aan elk putje met OLP-pool-gepulseerde macrofagen.

Kweek de cellen bij 37 graden Celsius in een atmosfeer van 5% koolstofdioxide gedurende vier dagen. Vervolgens, verwijder ongeveer 400 microliter van het medium uit elk putje. Voeg aan elk putje 500 microliter vers serumvrij medium toe, bevattende 100 eenheden per milliliter van IL-2 en IL-7.

Hervat de incubatie onder dezelfde omstandigheden. Na drie tot vier dagen, onderzoek de opnieuw gestimuleerde cellen op een OLP-pool-specifiek Qa-1 beperkt antwoord met een interferon-gamma enzym gekoppelde immuno spot assay. Ververs het CD8+T-cel medium elke drie tot vier dagen terwijl u op de resultaten wacht.

Voer een ELISPOT-assay uit met de verdunde peptide voorraden om te bepalen welke peptiden de OLP-pool-specifieke Qa-1 beperkte interferon-gamma secretie produceren. Ten slotte, evalueer een verkortte peptide reeks met ELISPOT om het optimale Qa-1-epitoop te identificeren. Een interferon-gamma ELISPOT-assay toonde een significante toename van spotvormende cellen aan toen CD8+T cellen, gestimuleerd door de gepoolde MOG overlappende peptide bibliotheek, werden gecombineerd met C1R.

Qa-1b cellen. Dit suggereerde dat de T cellen reageerden op de Qa-1 binding peptiden, en dat de MOG_pool een of meer Qa-1 binding epitopen bevatte. Een andere assay werd uitgevoerd om de individuele peptiden in de pool te screenen.

Drie peptiden toonden reacties die minstens drie keer groter waren dan de reactie in aanwezigheid van