Zika Virus infectie van de ontwikkelende hersenen In Vitro met behulp van stamcel modellering afgeleid cerebrale Organoids
September 19th, 2017
Dit protocol beschrijft een techniek gebruikt om te modelleren Zika virusinfectie van de ontwikkeling van de menselijke hersenen. Wildtype of gemanipuleerde stamcellijnen kunnen, onderzoekers gebruiken deze techniek te ontdekken van de verschillende mechanismen of behandelingen die vroege infectie van de hersenen en de resulterende microcefalie in Zika virus-geïnfecteerde embryo's kunnen beïnvloeden.
Het algemene doel van deze procedure is om zikavirusinfectie in de zich ontwikkelende menselijke hersenen te modelleren met behulp van uit stamcellen afgeleide cerebrale organoïden. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in het biologische veld, zoals welke cellen besmet kunnen worden en welke eiwitten betrokken zijn bij de infectieroute. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het vroege menselijke infectie nabootst, kan worden gebruikt in high-throughput analyses en kan worden gecombineerd met gefocuste genetische technieken zoals CRISPR.
Deze methode kan inzicht geven in het mechanisme van zikavirusinfectie. Het kan ook worden toegepast op andere systemen zoals, medicijnscreens en viruspseudotyping. Gebruik reguliere stamcelonderhoudsmethoden om culturen tussen 50% en 70% confluentie te brengen.
Inspecteer de culturen met behulp van helderveldmicroscopie bij 10 tot 20x vergroting en zorg ervoor dat de kolonie een gezonde morfologie heeft zonder detecteerbare differentiatie. Breng het xeno-vrije stamcelonderhoudsmedium naar 37 graden Celsius in een heetwaterbad en ontdooi twee milliliter enzymatisch detacheringsreagens en een 50 microliter flacon van de stock rock-remmer op kamertemperatuur. Bereid vervolgens een ultra-lage hechtings U-bodem 96-wellplaat, een multikanaals p200 pipette en een 25 milliliter reagent reservoir voor.
Pipet vervolgens 45 milliliter van het medium in een 50 milliliter conische buis. Voeg 45 microliter van de rock-remmer toe en meng de remmer grondig door de mix op te slaan, gevolgd door twee tot vier inversies. Aanzuig met een vacuüm twee putjes van een zes-wellplaat met stamcellen en voeg snel één milliliter enzymvrij detacheringsreagens toe aan elke put, bewaar de plaat vervolgens 4 minuten bij 37 graden Celsius.
Aanzuig vervolgens de behandelde putjes met een vacuüm en voeg één milliliter enzymatisch detacheringsreagens toe aan elke put. Na een incubatie van vijf minuten bij 37 graden Celsius, verwijder de plaat uit de incubator. Tik zachtjes op de plaat om eventuele geaggregeerd cellen te breken.
Inspecteer vervolgens de cellen onder de microscoop. Als er nog grote celclusters zichtbaar zijn, incubeer de plaat nog twee minuten bij 37 graden Celsius. Herhaal de stap totdat clusters niet langer zichtbaar zijn met het blote oog.
Zodra de cellen goed gedissocieerd zijn, voeg één milliliter xeno-vrij stamcelonderhoudsmedium toe aan elke put, om de dissociatie-enzymen te deactiveren. Trek de celsuspensie in een 50 milliliter conische buis en neem een kleine aliquot voor celtelling. Tel tijdens het centrifugeren de cellen en bepaal het volume voor hersuspensie dat nodig is om 60.000 cellen per milliliter suspensie te bereiken.
Verwijder voorzichtig het supernatant en hersuspendeer de cellen bij 60.000 cellen per milliliter in media met de rock-remmer. Gebruik een vijf milliliter pipette om de cellen voorzichtig vijf tot tien keer te mengen om een uniforme celsuspensie te verkrijgen. Voeg de celsuspensie onmiddellijk toe aan het reagent reservoir en gebruik een multikanaals p200 pipette om 150 microliter in elk putje van een ultra-lage hechtings U-bodem 96-wellplaat over te brengen.
Centrifugeer vervolgens de plaat gedurende één minuut bij 150 x G en plaats de plaat vervolgens in een incubator bij 37 graden Celsius. Laat de plaat 48 uur ongestoord staan. Vanaf dag twee, bereid 17 milliliter media voor met 17 microliter van de stock rock-remmer in een 50 milliliter conische buis.
Verwarm het mengsel tot 37 graden Celsius in een heetwaterbad. Haal de organoïdplaat uit de incubator en gebruik een multikanaals p200 pipette om langzaam 75 microliter medium vanaf de randen van de putjes in de eerste rij op te zuigen. Spuit het vervolgens snel terug in de put om losse cellen en organoïden op te tillen.
Herhaal dit dispersieproces voor elke rij. Wacht 15 seconden om ervoor te zorgen dat de organoïden naar de bodem van elke put zijn gezonken en aspirieer vervolgens langzaam en voorzichtig 75 microliter medium uit elke put met behulp van de multikanaals p200 pipette en spoel het in een afval reservoir. Breng vervolgens media met de rock-remmer over in een reagent reservoir, doseer 150 microliter media in elke organoïdput en incubeer de cellen vervolgens bij 37 graden Celsius.
Verwarm 17 milliliter vers kweekmedium tot 37 graden Celsius, dit keer zonder enige rock-remmer. Gebruik een multikanaals p200 pipette ingesteld op 100 microliter, herhaal het eerder getoonde dispersieproces en wacht 15 seconden om ervoor te zorgen dat de organoïden naar de bodem van hun putjes zijn gezonken. Aspirieer vervolgens voorzichtig 125 microliter medium uit elke put en vervang het met 150 microliter verwarmd media.
Plaats de plaat in de incubator bij 37 graden Celsius. Bereid het medium volgens het hier getoonde recept en filter de gemengde oplossing sterieel in een 500 milliliter filter. Vanaf dag vier tot de cellen geïnfecteerd zijn op ongeveer dag 24, voer regelmatig onderhoud uit om de dag met behulp van neuraalinductiemedium.
Na het filteren, verwarm 17 milliliter van het neuraalinductiemedium tot 37 graden Celsius en bewaar de rest op vier graden Celsius. Gebruik een multikanaals p200 pipette ingesteld op 100 microliter, doseer alle putjes van de organoïdplaat zoals eerder getoond. Wacht 15 seconden om ervoor te zorgen dat de organoïden naar de bodem van hun putjes zijn gezonken.
Aspirieer voorzichtig 125 microliter medium uit elke put en vervang het door 125 microliter vers neuraalinductiemedium. Herhaal deze neuraalinductie handeling om de dag totdat de organoïden klaar zijn voor zikavirusinfectie. Breng Earle's 1x gebalanceerde zout oplossing, 1x PBS en neuraalinductiemedium naar 37 graden Celsius in een heetwaterbad.
Verdun vervolgens zikavirus van een bekende concentratie in 1x Earle's oplossing tot de doelmultiplicitiet van infectie, die meestal tussen 0,1 en 10 ligt. Gebruik een p200 pipette om voorzichtig al het medium uit elk organoïdputje te verwijderen
Overzicht
Deze studie presenteert een protocol om Zika-virusinfectie in de zich ontwikkelende menselijke hersenen te modelleren met behulp van uit stamcellen afgeleide organoïden. Onderzoekers streven ernaar om te onderzoeken welke cellen vatbaar zijn voor infectie en de eiwitten die betrokken zijn bij de infectieroute, waardoor inzichten worden geboden in de mechanismen van Zika-virusinfectie en de link met microcefalie.
Belangrijke onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Virologie
- Stamcellenbiologie
Achtergrond
- Zika-virus kan leiden tot ernstige neurologische aandoeningen zoals microcefalie bij geïnfecteerde embryo's.
- Het begrijpen van de infectiemechanismen is cruciaal voor het ontwikkelen van therapeutische interventies.
- Uit stamcellen afgeleide cerebrale organoïden dienen als een effectief model voor vroege menselijke hersenontwikkeling.
- Deze studie onderzoekt de voordelen van high throughput assays en genetische technieken zoals CRISPR.
Doel van het onderzoek
- Om Zika-virusinfectie in de zich ontwikkelende menselijke hersenen te modelleren.
- Om geïnfecteerde celtypen te identificeren en de infectieroute te verkennen.
- Om een platform te ontwikkelen voor medicijnscreening en het begrijpen van neurologische effecten.
Gebruikte methoden
- De studie gebruikt uit stamcellen afgeleide cerebrale organoïden als het primaire platform.
- Stamcellenlijnen worden gemanipuleerd om organoïden te produceren voor infectiestudies.
- Er worden geen multiomics workflows genoemd; de focus ligt op de dynamische celinfectie.
- Belangrijke stappen omvatten het voorbereiden van organoidculturen, het onderhouden van groei en het introduceren van virale infectie.
- Er worden regelmatige mediumverversingen uitgevoerd om optimale groeicondities gedurende de experimentele tijdlijn te garanderen.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol maakt observatie van Zika-virusinfectiemechanismen in organoïden mogelijk.
- Initiële beoordelingen benadrukken celinfectieroutes en responsmechanismen.
- Er worden inzichten verkregen in celdifferentiatie en kwetsbaarheid voor virale factoren.
- De studie biedt fundamentele inzichten voor toekomstige therapeutische evaluaties tegen Zika-virus.
Conclusies
- Deze studie maakt een gedetailleerde verkenning van de impact van Zika-virus op zich ontwikkelende hersenen mogelijk.
- Het begrip van infectiemechanismen kan toekomstige therapeutische strategieën informeren om virale effecten op hersenontwikkeling te bestrijden.
- De implicaties breiden zich uit tot bredere onderzoeken naar modellen van neurodevelopmentele ziekten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Modeling Zika virus infection in human cerebral organoids provides a species-matched system to evaluate neurotropic mechanisms and assess antiviral interventions. This approach supports target validation by identifying susceptible neural progenitor cells and infection pathways relevant to neurodevelopmental risk. The model enables mechanistic de-risking in early discovery by linking viral exposure to phenotypic outcomes such as cell death and microcephaly-like phenotypes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Identifies neural progenitor cells as primary targets of Zika virus infection, supporting hypothesis testing of viral tropism.
- Operational Value: Enables interrogation of infection mechanisms using stem cell-derived systems that reflect human-specific biology.
- Strategic Value: Supports target confidence by clarifying which cell types and proteins are involved in the infection pathway.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a three-dimensional platform for quantifying viral load and cytopathic effects over time.
- Operational Value: Compatible with high-throughput formats and genetic perturbation tools like CRISPR for pathway interrogation.
- Strategic Value: Enables scalable screening of compounds that modulate viral entry, replication, or host response.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models microcephaly-associated phenotypes including organoid size reduction and cellular debris accumulation post-infection.
- Operational Value: Supports longitudinal assessment of infection outcomes from early exposure to later developmental stages.
- Strategic Value: Improves predictive confidence in preclinical models by recapitulating human-specific cortical layering and gliogenesis timing.
Pipeline & Workflow Integration
The cerebral organoid model fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical assessment of neurotropic compounds.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of which cells are infectable and which proteins mediate viral entry and pathogenesis.
- Screening: Supports assay readiness through standardized organoid generation, maintenance, and infection protocols in ultra-low attachment plates.
- Analytics: Generates quantitative readouts including organoid size, cell death markers, and viral antigen expression for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects early infection events to downstream phenotypes like disrupted cortical structure and gliogenesis, supporting biomarker-aligned evaluation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying other neurotropic viruses or genetic modifiers of viral susceptibility.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct observation of virus-host interactions in a human-relevant system.
- Operational Value: Standardized differentiation and infection workflows reduce variability and support cross-experiment reproducibility.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing early insight into neurological liability of viral pathogens or therapeutic candidates.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of antiviral compounds based on efficacy in preventing organoid dysplasia and cell loss.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture, organoid generation, and virology under biosafety-level appropriate conditions.
- Dependent on ultra-low attachment plates, enzymatic dissociation tools, and controlled incubation systems for organoid formation.
- Necessitates standardization of media changes, rock inhibitor use, and neural induction timing across batches.
- Adaptation to other models may require optimization of infection timing and multiplicity based on differential progenitor susceptibility.
- Practical limitations include organoid variability and the need for careful handling to avoid mechanical disruption during medium exchange.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:43
Creating Cerebral Organoids from iPSC / hESC 2D Culture (Day 0)
3:30
Cerebral Organoid Maintenance (Day 2)
4:37
Cerebral Organoid Maintenance (Day 3)
5:14
Cerebral Organoid Maintenance (Day 4+)
6:13
Organoid Infection with ZIKV (~Day 24)
7:45
Results: Characterization of ZIKB-infected Organic Degradation
8:47
Conclusion
