Voorbereiding van primaire Acute lymfatische leukemie cellen in verschillende celcyclus fasen door centrifugaal Elutriation

Het algemene doel van deze procedure is om cellen in verschillende celcyclusfasen te isoleren met behulp van centrifugale elutriëring. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van kankertherapie. Omdat de isolatie van cellen in afzonderlijke fasen, maakt het mogelijk om de fase-afhankelijke effecten van antikankerverbindingen te onderzoeken.

Het grote voordeel van deze techniek is dat het mogelijk is om cellen in specifieke fasen te scheiden met behulp van fysische eigenschappen, in plaats van chemische verstoringen. Om het experiment te starten, installeert u de strobe-assemblage in de centrifuge zodat de stroomkabel uit de kamer wordt gevoerd via de poort aan de linkerkant. Stel de strobe-flitslamp zo in dat deze in lijn komt met het kijkvenster wanneer de centrifuge is gesloten.

Bevestig de assemblage op zijn plaats door twee Phillips-schroeven aan de bovenkant van elke beugel vast te draaien. Draai vervolgens de duimschroeven aan de onderkant van de beugel vast. Sluit de stroomkabel aan op de strobe-stroompoort, aan de achterkant van de centrifuge.

Plaats vervolgens de rotors recht naar beneden op de centrifugeaandrijving en bevestig deze stevig met een T-handgreephexsleutel. Plaats vervolgens de assemblage die de elutriëringskamer, het contragewicht, het roterende afdichtingsassemblage en een montageplaat bevat, op de rotor. Duw gelijkmatig naar beneden, met één hand op de elutriëringskamer en de andere hand op het contragewicht, totdat de bouten op de rotor op hun plaats klikken.

Plaats de pin, die zich aan het ene uiteinde van de kabel bevindt, in het gat in het roterende afdichtingsassemblage. En bevestig de oogholte aan het andere uiteinde met een van de Phillips-schroeven, bevestigd aan de beugel om de verankeringskabel te verbinden. Om het flowsysteem te assembleren, om buffer in en uit de elutriëringskamer te pompen, verbind u slangmaat 16 met een variabele snelheidspomp.

Voer een vrije uiteinden van deze slang door een poort aan de bovenkant links van de centrifugekamer, zodat deze de kamer binnenkomt. Bevestig een fitting aan het vrije uiteinde van deze buis en steek vervolgens de fitting in de invoeropening van het roterende afdichtingsassemblage. Ten slotte steekt u de uitvoerslang door een poort om deze aan te sluiten op de overdrachtsbuis aan de bovenkant van het roterende afdichtingsassemblage.

Zodra het elutriëringssysteem is geassembleerd, steriliseert u het door de andere vrije uiteinden van de invoerslang in een fles van 500 milliliter te plaatsen, gevuld met 5%bleach. En plaats de uitvoerslang in een lege afvalfles van een liter. Zet vervolgens de pomp aan en laat de bleekvloeistof door het elutriëringssysteem stromen totdat deze in de afvalfles wordt gepompt.

Zet nu de centrifuge aan en laat deze de maximale aangegeven snelheid bereiken om luchtbellen en terugdruk te elimineren. Zodra de ingestelde snelheid is bereikt, stopt u de centrifuge. Nadat de rotor volledig is gestopt, opent u het deksel en inspecteert u de kamer op eventuele lekken.

Vervolgens, op een vergelijkbare manier als eerder beschreven, laat u 10 minuten steriel water door het systeem lopen. Na het spoelen met water, vervangt u de waterreservoir door een steriele glazen fles gevuld met 100 milliliter elutriëringsbuffer. Plaats de invoerslang in deze fles, zodat deze zich helemaal onderaan bevindt.

Start de centrifuge en laat de buffer door het systeem stromen. Nadat de reservoirfles bijna leeg is en het water volledig uit het systeem is gespoeld, verplaatst u de uitvoerslang van de afvalfles naar het reservoir, zodat de buffer continu door het systeem wordt gerecycled. Schakel ten slotte de strobelamp in en draai de elutriëringsknopbuitenshuis naar links.

Stel nu het kijkvenster in door langzaam de knop naar rechts te draaien, zodat de elutriëringskamer duidelijk zichtbaar is en de strobelicht in sync is met de snelheid van de rotor. Bereid het celmonster voor zoals beschreven in het tekstprotocol. Voeg de resuspendeerde cellen toe aan de reservoirfles met de recycleerbare elutriëringsbuffer.

Laat de cellen het systeem binnengaan en evenwicht bereiken in de elutriëringskamer. Om ervoor te zorgen dat alle cellen in de kamer worden vastgehouden, neemt u een druppel van de eluent op een glazen plaat en bekijkt u deze onder een microscoop. Als het monster geen intacte cellen bevat, bevestigt dit de retentie in de kamer.

Zodra alle cellen in de kamer zijn gegaan en een duidelijke grens bij het witste deel van de kamer, met cellen en evenwicht, wordt gezien, begint u met het verzamelen van fracties. Verplaats de uitvoerslang naar een voorgekoelde 50 milliliter conische buis, gelabeld W1. Verzamel 50 milliliter elutriëringsbuffer in deze buis en bewaar op ijs. Kort nadat de W1-fractie is verzameld, verlaagt u de centrifugesnelheid tot 821 G. En verplaats de uitvoerslang naar de conische buis, gelabeld W2, en verzamel 50 milliliter meer op deze snelheid.

Ga door met het veranderen van de snelheid en het verzamelen van fracties. Zorg ervoor dat er medium in de reservoirtank is en bewaar de verzamelde fracties altijd op ijs. Nadat alle fracties zijn verzameld, stopt u de centrifuge en verzamelt u 50 milliliter in een conische buis, gelabeld stop.

Pellet-cellen verzameld in elk van de fracties en gebruik downstream-analyse, zoals flowcytometrie of westernblot, indien nodig. Een lijngrafiek die de gemiddelde diameter van cellen in opeenvolgende elutriëringsfracties toont, wordt getoond. Merk op dat hoe groter de celdiameter, hoe hoger het fractienummer waarop het elueert.

Resultaten van fluorescentie-geactiveerde celsorteringsanalyse tonen het DNA-gehalte van cellen in elk van de 20 elutriëringsfracties. Vroege fracties, F1 tot F5, bevatten bijna uitsluitend cellen met 2N DNA-inhoud die cellen in de G1-fase vertegenwoordigen. Een mengsel van cellen in G1