Assay ontwikkeling voor hoge inhoud kwantificering van Sod1 Mutant eiwit statistische vorming in levende cellen

Het algemene doel van dit experiment is om een test te ontwikkelen voor het bestuderen van de effecten van kleine moleculen bij het moduleren van de aggregatie van misgevouwen eiwitten op een tijd- en dosisafhankelijke manier. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van de belangrijkste vragen voor de ontwikkeling van cellulaire tests, en het gebruik ervan is voor high-content screeningtechnieken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een eenvoudige methode biedt om eiwitaggregatie te detecteren en te kwantificeren die optreedt bij verschillende neurodegeneratieve aandoeningen.

De implicatie van deze techniek strekt zich uit naar potentiële therapie van neurodegeneratieve ziekten, zoals ALS, omdat het een eenvoudige methode voorstelt die het mogelijk maakt om cellulaire testen te ontwikkelen en screening uit te voeren voor kleine molecuulmoderatoren. Om de virusproductie te starten, verdeel de HEK-293 T-cellen bij 30 tot 40% confluency in een 10 centimeter weefselkweekschaal met 10 milliliter celkweekmedium. Incubeer de kweekplaat in een 5% koolstofdioxide incubator bij 37 graden Celsius een nacht lang.

De volgende dag, bereid de DNA-transfectieoplossing met verpakkingsplasmiden lentiviraal vector, 125 microliter van één molaire calciumchloride en voeg gedistilleerd water toe om het volume aan te passen tot 500 microliter. Voeg voorzichtig 500 microliter van 0,05 molaire HEPS-buffer toe en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Vervang daarna het HEK-293 T-celmedium met 10 milliliter voorverwarmd antibioticumvrij vers kweekmedium gemengd met één milliliter DNA-transfectieoplossing.

Incubeer bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide incubator een nacht lang. Vervang het celsupernatant met vers kweekmedium de volgende dag en incubeer weer een nacht lang. Ten slotte, oogst het supernatant de volgende dag en breng het over naar een 15 milliliter buis.

Om de dode cellen en het puin te verwijderen, centrifugeer de buis gedurende vijf minuten bij 500 keer g. Om het supernatant verder te zuiveren, laat het door een 0,45 micrometer filter lopen met behulp van een 60-milliliter spuit. Verdeel vervolgens het gefilterde supernatant onmiddellijk in 300-microliter porties voor eenmalig gebruik.

Om de cellen voor transductie voor te bereiden, verdeel ze om geïnfecteerd te worden bij 60% confluency in een zes-putjes weefselkweekplaat in twee milliliter DMAM aangevuld met 10% FBS. Incubeer de cellen in een 37-graad Celsius incubator bij 5% koolstofdioxide een nacht lang. De volgende dag, ontdooi één aliquot van het ingevroren lentivirus op ijs voor elke gebruik.

Ondertussen, verwarm het celkweekmedium dat compatibel is met de cellijn van belang. Zodra het virus volledig ontdooid is, verdun het in DMEM in nieuwe 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes. Pas vervolgens het volume aan tot één milliliter met gereduceerd serum medium.

Voeg vervolgens twee microliter polybreen toe aan één milliliter virus per medium en meng goed door middel van pipetten. Voeg één milliliter van deze mengsel toe aan de cellen en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende 24 uur. Na incubatie, verwijder het virus bevattende medium en vervang het met normaal DMEM aangevuld met 10% FBS en plaats de cellen terug in de incubator.

Bewaak de celgroei en ververs het medium om de twee dagen. Wanneer de cellen confluency bereiken, breid elke put van de zes-putjesschaal uit tot een 10 centimeter weefselkweekplaat. Verplaats de schalen naar de incubator. Ten slotte, sla 1,5 keer 10 tot de 4e cellen per put en 50 microliter DMEM op op 384-putjes testplaten.

Controleer vervolgens het expressieniveau van het YFP-getagde eiwit onder de microscoop. Als de expressie een signaal-ruisverhouding van gelijk aan of groter dan drie vertoont, bereid celvoorraad voor voor de corresponderende cellijn. Voor de verbindingsoverdracht, voeg op een 384-putjes opslag polypropyleen plaat seriële verdunningsreeksen van verbindingen toe volgens de standaard een tot drie verdunningsreeksen.

Vervolgens, gebruik een vloeistofhandler uitgerust met een 384-kapillarenkop, verdeel 0,25 microliter van proteasoomremmers op lege, platte bodem zwarte 384-putjes testplaten. Zaai vervolgens 1,5 keer 10 tot de 4e cellen op deze platen. Incubeer bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende 24 uur.

Voor het beeldvormen van de cellijn behandeld met proteasoomremmers, voeg 10 microliter van voorverwarmd DMEM met kleuroplossing toe en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Na kleuring, start de geautomatiseerde microscoopbesturingssoftware door het microscooptabblad te selecteren. Selecteer eerst het configuratietabblad en selecteer vervolgens 20 keer objectief in het juiste plaattype.

Om een goede focus mogelijk te maken met verschillende plaattypen, zorg ervoor dat de aanroeper ingesteld is op de juiste waarde op het objectief. Selecteer vervolgens blootstelling een. Stel de focushoogte op nul micrometer, selecteer vervolgens focus.

Eenmaal gefocust, leg camera een bloot. Om de belichtingsvlak te optimaliseren, pas de focushoogte aan en klik op hoogte nemen. Wijzig de belichtingstijden en laservermogen voor een maximale pixelintensiteit van ongeveer 3000 en sla de belichtingsparameters op.

Selecteer experimentdefinitietabblad, maak een layout en sublay-out. Sleep vervolgens de relevante layout blootstelling, referentieafbeelding, scheef cropbestand en sublay-out. Sla vervolgens het experiment op.

Selecteer ten slotte automatisch experimenttabblad en verwerf afbeeldingen. Voor afbeeldingen met twee kanalen, selecteer eerst het softwarealgoritme om de primaire objecten te segmenteren, zoals kernen, cytosol en aggregaten. Verdeel eerst 0,25 microliter van proteasoomremmer opgelost in 100% DMSO of DMSO op 384-putjes vlakbodemplaten.

Op dezelfde plaat, zaai handmatig 1,5 keer 10 tot de 4e cellen per put in 50-microliter DMEM. Stel vervolgens de microscoopsysteem omgevingscontrole-eenheid