Name: Assay ontwikkeling voor hoge inhoud kwantificering van Sod1 Mutant eiwit statistische vorming in levende cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-04T12:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Leer een assay ontwikkelen voor hoge-inhoud kwantificering van SOD1-mutant eiwitaggregatie in levende HEK-293 cellen. Deze methode ondersteunt screening van kleine moleculen voor neurodegeneratieve ziekten zoals ALS.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gesteund door een subsidie gefinancierd door de Koreaanse regering (MSIP) (NRF-2014K1A4A7A01074642) en het nationale onderzoek Stichting van Korea (NRF) individuele wetenschapper support program (NRF-2013M3A9B5076486/NRF-2015R1D1A1A09057239).

1. lentivirus productie Opmerking: de productie en manipulatie van lentivirale vectoren werd uitgevoerd volgens de richtlijnen van de National Institutes of Health (NIH) voor onderzoek waarbij recombinant DNA. Kim et al. de plasmide codering het wild-type en A4V mutant SOD1 gelabeld met verbeterde YFP (SOD1WT-YFP en SOD1A4V-YFP) worden beschreven. 11 beide gene fusion producten werden versterkt met behulp van de PCR primer paar 5 &#8242; - ATCGTCTAGACACCATGGCGACGAAGGTCGTGTGC - 3 &#8242; en 5 &#8242;-TAGCGG CCGCTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3 &#8242; en de pTRIP-delta U3 CMV ingevoegd plasmide 19 met behulp van XhoI en BsrGI beperkingsplaatsen. In eerdere experimenten speelden de HEK-293T-cellen bij een verhouding van 1:4 tot en met 1:6 om de twee dagen. Vermijden van meer dan 20 passages en onderhoud van de cellen bij minder 60% confluency helpt om goede transfectie efficiencyverbeteringen.
<ol><li>Op dag 1, HEK-293T cellen bij 30-40% samenvloeiing in een 10-cm doorsnede weefselkweek plaat (3 x 10 6 cellen/schotel) splitsen in cel kweekmedium (hoge-glucose DMEM met 10% FBS en 4 mM L-glutamine) voor virus productie 10 mL.</li>
	<li>Houden de 10-cm doorsnede weefselkweek plaat in een CO 2 incubator (37 ° C, 5% CO 2) 's nachts.</li>
	<li>Op dag 2, bereid een DNA transfectie oplossing met 10 µg van lentivirale vectoren (pTRIP-delta U3 CMV - SOD1WT-YFP of -SOD1A4V-YFP) samen met de lentivirale verpakking plasmiden (5 µg pVSVg; pCMV-dR8.71 10 µg) () figuur 2A) 20. Voeg 125 µL van 1 M CaCl 2 en pas het volume aan 500 µL met gedestilleerd water. Zachtjes Voeg 500 µL van 0,05 M HEPES in het mengsel en laat 10 minuten bij kamertemperatuur inwerken.</li>
	<li>Vervangen HEK-293T cellen medium met 10 mL voorverwarmde verse kweekmedium antibioticum-gratis gemengd met 1 mL DNA transfectie en na een nacht bebroeden bij 37 ° C, 5% CO 2.</li>
	<li>Op dag 3, vervangen door de cel supernatant verse kweekmedium.</li>
	<li>Op dag 4, oogsten de bovendrijvende substantie in een tube van 15 mL en Centrifugeer gedurende 5 min op 500 x g om de dode cellen en puin te verwijderen. Verder het supernatant te zuiveren door het passeren van een 0,45 µm filter door middel van een grote 60 mL spuit. Onmiddellijk afzien in eenmalig gebruik aliquots (300 µL), en opslaan bij-80 ° C. Maximale product om activiteiten te handhaven, te voorkomen dat een freeze-dooi cyclus.</li>
</ol> 2. Lentivirale transductie <ol><li>splitsen de cellijn besmet bij 60% samenvloeiing (HEK-293 cellen en SH-SY5Y; 5 x 10 5 cellen per putje en U2OS; 1 x 10 5 cellen per putje) in een bord 6-well weefselkweek in 2 mL zuiver DMEM media, aangevuld met 10% FBS.</li>
	<li>Houden de plaat 6-well weefselkweek in een incubator 37 ° C bij 5% CO 2 overnachting.</li>
	<li>Verwijderen van de bevroren lentivirus uit de diepvries-80 ° C en een aliquoot gedeelte op ijs vóór elk gebruik ontdooien; niet doen refreeze.</li>
	<li>Terwijl het virus is ontdooien, warm de cel-kweekmedium dat van het serum compatibel met de cellijn van belang. Zodra het virus is volledig ontdooid, bereiden een aantal verdunningen (1:3, 1:10, 1:30, en 1:100) in DMEM in een verse 1,5 mL microfuge buis.</li>
	<li>Het volume in de buizen tot 1 mL met verminderde serum media opvoeden.</li>
	<li>Toevoegen 2 µL van Polybrene (bij een voorraad van 4 µg/µL) tot 1 mL van virus/media. Meng goed door pipetteren en voeg 1 mL van het mengsel aan de cellen. Incubeer de cellen met het virus voor 24 h.</li>
	<li>De media van het virus te verwijderen en te vervangen met normale DMEM media aangevuld met 10% FBS. Handhaven van de cellen bij 37 ° C, 5% CO 2.</li>
	<li>De groei van de cellen controleren en wijzigen van de voedingsbodems om de twee dagen. Bij samenvloeiing, door de schotel 6-well uit te breiden in een 10-cm doorsnede weefselkweek plaat.</li>
	<li>Zodra de cellen voldoende zijn uitgebreid, gelabeld zaad 1.5 x 10 4 cellen per putje in 50 µL van DMEM media op 384-well assay platen te controleren van het niveau van de expressie van de YFP proteïne door microscopie. Als de YFP gelabeld cel eiwituitdrukking toont een signal-to-noise verhouding &#8805; 3, cel voorraad voorbereiden op de overeenkomstige cellijn.</li>
</ol> 3. Tijd afhankelijk effect van proteasoom-remmers op eiwit aggregatie Opmerking: uitvoeren met behulp van een geautomatiseerde Microscoop Beeldacquisitie (Zie materiaal).
<ol><li>Afzien van 0,25 µL van DMSO of proteasoom-remmer opgelost in 100% DMSO (ALLN, 2 mM) op 384-well platte bodem platen.</li>
	<li>Handmatig zaad 1.5 x 10 4 cellen per putje in 50 µL van DMEM media op dezelfde assay plaat. De eindconcentratie van de Inhibitor van de omwenteling (ALLN) proteasoom moet 10 µM.</li>
	<li>Instellen in de systeemeenheid omgevingsbeheersing Microscoop op 37 ° C en 5% CO 2. Een screenshot van de experimentele opstelling wordt getoond in Figuur 3.</li>
	<li>Werken de Microscoop in breed veld fluorescentie modus, met behulp van de software met de volgende instellingen: LWD 20 X doelstelling, niet-confocale modus, 4 velden per putje, met een opname-interval van een uur. Aan het einde van elke run, opnames worden automatisch geüpload naar de server.</li>
</ol> 4. Tijd lapse imaging voor YFP expressie in levende cellen, en beeld analyse (enkellijns) Opmerking: de volgende stappen beschrijven toepassing van de software (b.v., Columbus).
<ol><li>Selecteer de juiste algoritme segmenten van de primaire objecten (cytosol en aggregaten). Indien nodig, aanpassen achtergrond drempel en contrast parameters ( Figuur 4).</li>
	<li>Cellen tellen met behulp van &#39; cellen zoeken &#39; met een individuele drempel van 0,1 voor het YFP intensiteit kanaal. Bepalen van aggregaten met behulp van een &#39; vinden plekken &#39; algoritme met een relatieve YFP plek intensiteit &#62; 0,2 en een splitsing coëfficiënt voor 1.0.</li>
</ol> 5. Effect van het antwoord van proteasoom-remmers op eiwit aggregatie op levende cellen gekleurd voor hun kernen (twee kanalen) dosis Opmerking: uitvoeren met behulp van een geautomatiseerde Microscoop Beeldacquisitie. Het concentratiebereik van proteasoom-remmers (ALLN, Epoxomicin en MG132) op basis van de verwachte IC 50 waarde om een optimale kromme pasvorm bepalen.
<ol><li>Voorbereiden seriële verdunningen van verbindingen op een 384-well opslag polypropyleen plaat standaard verdunningsreeks van 1:3. Zorg ervoor dat u de samengestelde verdunningen meng goed om ervoor te zorgen dat de samengestelde concentraties kloppen.</li>
	<li>Doseer 0,25 µL van proteasoom-remmers op lege flat-onderste zwarte 384-well assay platen. We gebruiken een vloeibare handler uitgerust met een 384-capillair hoofd staat van de overdracht van de volumes.</li>
	<li>Zaad 1.5 x 10 4 cellen per putje 50 µL van DMEM Media op assay platen. Incubeer de platen assay bij 37 ° C en 5% CO 2 voor 24 h.</li>
	<li>Voeg 10 µL van DMEM Media (vooraf opgewarmd bij 37 ° C) met een kleurstofoplossing (Hoechst 33342 bij een voorraad van 10 mg/mL) en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten</li>
	<li>Lanceren de microshoofd besturingssoftware. Een screenshot van de experimentele opstelling wordt getoond in Figuur 6. Selecteer de &#34; configuratie &#34; tab en selecteer 20 X de doelstelling en de juiste plaat type. Zorgen &#34; kraag &#34; is ingesteld op de juiste waarde op de juiste focus waardoor met verschillende plaat typen objectieve.</li>
	<li>Selecteer de &#34; Microscoop &#34; tab. definiëren blootstelling 1 als YFP (488 laser) en blootstelling 2 als Hoechst (405 laser). Activeren van het filter op beide posities en blootstelling 1 toewijzen aan camera 1 en Gasbedwelming met 2 camera 2. Belichtingstijden ingesteld op ~ 800 ms voor blootstelling 1 en ~ 40 ms voor blootstelling 2.</li>
	<li>Selecteer blootstelling 1. Focus hoogte ingesteld op 0 µm. Selecteer &#34; Focus &#34;. Zodra gericht, bloot camera 1. Aanpassen van de hoogte van de focus optimaliseren van het vliegtuig van de blootstelling en klik op &#34; hoogte &#34;. Wijzigen van de belichtingstijden en macht te geven een maximale pixel intensiteit van ~ 3.000 laser. Sla blootstelling parameters. Herhaal dit voor blootstelling 2.</li>
	<li>Selecteer &#34; Experiment definitie &#34; tab. Maak een lay-out en sublayout. Slepen en neerzetten van de relevante lay-out, belichting, referentiebeeld, skewcrop bestand en sublayout. Opslaan van het experiment.</li>
	<li>Selecteer &#34; automatische Experiment &#34; tab en beelden te verwerven. Aan het einde van elke run, opnames worden automatisch geüpload naar de server.</li>
</ol> 6. Afbeelding van de analyse van de twee afbeeldingen van het kanaal <ol><li>selecteert het algoritme van de software om te segmenteren van de primaire objecten (kernen cytosol en aggregaten) ( Figuur 7).</li>
	<li>Selecteer de methode die segmenten van de kernen nauwkeurig door visuele inspectie van de gesegmenteerde objecten. Hoechst gebeitste objecten in kanaal 1 (Ch1) zal worden gebruikt om te bepalen van het aantal cellen. De YFP kleuring van de mutant SOD1-A4V in kanaal 2 (Ch2) worden gebruikt voor het bepalen van de hoeveelheid aggregaten.</li>
	<li>Cellen tellen met behulp van de &#39; kernen vinden &#39; algoritme als Hoechst-kleuring regio's &#62; 20 µm 2, met een split-factor van 7.0, een individuele drempel van 0,40 en een contrast &#62; 0.10.</li>
	<li>Maken de gegevenstabel en EG 50 bepalen voor elk van de verbindingen met behulp van de &#39; Non-lineaire regressie &#39; vergelijking in de grafische software.</li>
</ol>

<ol><li>Schulte, J., Sepp, K. J., Wu, C., Hong, P., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-content+chemical+and+rnai+screens+for+suppressors+of+neurotoxicity+in+a+huntington%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">High-content chemical and rnai screens for suppressors of neurotoxicity in a huntington's disease model.</a> PLoS ONE. 6 (8), e23841(2011).</li>
<li>Honarnejad, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+implementation+of+a+high-throughput+compound+screening+assay+for+targeting+disrupted+ER+calcium+homeostasis+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Development and implementation of a high-throughput compound screening assay for targeting disrupted ER calcium homeostasis in Alzheimer's disease.</a> PLoS ONE. 8 (11), 1-12 (2013).</li>
<li>Burkhardt, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cellular+model+for+sporadic+ALS+using+patient-derived+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A cellular model for sporadic ALS using patient-derived induced pluripotent stem cells.</a> Mol Cell Neurosci. 56, 355-364 (2013).</li>
<li>Mattiazzi, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Content+Screening+for+Quantitative+Cell+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">High-Content Screening for Quantitative Cell Biology.</a> Trends Cell Biol. 26 (8), 598-611 (2016).</li>
<li>Kato, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyotrophic+lateral+sclerosis+models+and+human+neuropathology%3A+Similarities+and+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Amyotrophic lateral sclerosis models and human neuropathology: Similarities and differences.</a> Acta Neuropathologica. 115 (1), 97-114 (2008).</li>
<li>Strong, M. J., Kesavapany, S., Pant, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathobiology+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%3A+a+proteinopathy%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+neuropathol+exp+neurol%22%5BJournal%5D)">The pathobiology of amyotrophic lateral sclerosis: a proteinopathy?</a> J neuropathol exp neurol. 64 (8), 649-664 (2005).</li>
<li>Cleveland, D. W., Rothstein, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Charcot+to+Lou+Gehrig%3A+deciphering+selective+motor+neuron+death+in+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">From Charcot to Lou Gehrig: deciphering selective motor neuron death in ALS.</a> Nat rev Neurosci. 2 (11), 806-819 (2001).</li>
<li>Bruijn, L. I., Miller, T. M., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+Mechanisms+Involved+in+Motor+Neuron+Degeneration+in+Als%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Unraveling the Mechanisms Involved in Motor Neuron Degeneration in Als.</a> Annu Rev Neurosci. 27 (1), 723-749 (2004).</li>
<li>Vassall, K. a, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+stability+and+increased+formation+of+soluble+aggregates+by+immature+superoxide+dismutase+do+not+account+for+disease+severity+in+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Decreased stability and increased formation of soluble aggregates by immature superoxide dismutase do not account for disease severity in ALS.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (6), 2210-2215 (2011).</li>
<li>Hwang, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonamyloid+aggregates+arising+from+mature+copper%2Fzinc+superoxide+dismutases+resemble+those+observed+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonamyloid aggregates arising from mature copper/zinc superoxide dismutases resemble those observed in amyotrophic lateral sclerosis.</a> J Biol Chem. 285 (53), 41701-41711 (2010).</li>
<li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimerization%2C+Oligomerization%2C+and+Aggregation+of+Human+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis+Copper%2FZinc+Superoxide+Dismutase+1+Protein+Mutant+Forms+in+Live+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Dimerization, Oligomerization, and Aggregation of Human Amyotrophic Lateral Sclerosis Copper/Zinc Superoxide Dismutase 1 Protein Mutant Forms in Live Cells.</a> J Biol Chem. 289 (21), 15094-15103 (2014).</li>
<li>Shaw, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detergent-insoluble+aggregates+associated+with+amyotrophic+lateral+sclerosis+in+transgenic+mice+contain+primarily+full-length%2C+unmodified+superoxide+dismutase-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Detergent-insoluble aggregates associated with amyotrophic lateral sclerosis in transgenic mice contain primarily full-length, unmodified superoxide dismutase-1.</a> J Biol Chem. 283 (13), 8340-8350 (2008).</li>
<li>Banci, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOD1+and+amyotrophic+lateral+sclerosis%3A+Mutations+and+oligomerization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">SOD1 and amyotrophic lateral sclerosis: Mutations and oligomerization.</a> PLoS ONE. 3 (2), 1-8 (2008).</li>
<li>Johnston, J. a, Dalton, M. J., Gurney, M. E., Kopito, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+high+molecular+weight+complexes+of+mutant+Cu%2C+Zn-superoxide+dismutase+in+a+mouse+model+for+familial+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Formation of high molecular weight complexes of mutant Cu, Zn-superoxide dismutase in a mouse model for familial amyotrophic lateral sclerosis.</a> Proc Natl Acad Sci. 97 (23), 12571-12576 (2000).</li>
<li>Niwa, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disulfide+bond+mediates+aggregation%2C+toxicity%2C+and+ubiquitylation+of+familial+amyotrophic+lateral+sclerosis-linked+mutant+SOD1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Disulfide bond mediates aggregation, toxicity, and ubiquitylation of familial amyotrophic lateral sclerosis-linked mutant SOD1.</a> J Biol Chem. 282 (38), 28087-28095 (2007).</li>
<li>Juneja, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognosis+in+familial+amyotrophic+lateral+sclerosis%3A+progression+and+survival+in+patients+with+glu100gly+and+ala4val+mutations+in+Cu%2CZn+superoxide+dismutase%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Prognosis in familial amyotrophic lateral sclerosis: progression and survival in patients with glu100gly and ala4val mutations in Cu,Zn superoxide dismutase.</a> Neurology. 48 (1), 55-57 (1997).</li>
<li>Kaur, S. J., McKeown, S. R., Rashid, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+SOD1+mediated+pathogenesis+of+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Mutant SOD1 mediated pathogenesis of Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> Gene. 577 (2), 109-118 (2016).</li>
<li>de Bruyns, A., Geiling, B., Dankort, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Modular+Lentiviral+Vectors+for+Effective+Gene+Expression+and+Knockdown%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Construction of Modular Lentiviral Vectors for Effective Gene Expression and Knockdown.</a> Methods Mol Biol. 1448, 3-21 (2016).</li>
<li>Sirven, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Transgene+Expression+in+Cord+Blood+CD34%2B-Derived+Hematopoietic+Cells%2C+Including+Developing+T+Cells+and+NOD%2FSCID+Mouse+Repopulating+Cells%2C+Following+Transduction+with+Modified+TRIP+Lentiviral+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Enhanced Transgene Expression in Cord Blood CD34+-Derived Hematopoietic Cells, Including Developing T Cells and NOD/SCID Mouse Repopulating Cells, Following Transduction with Modified TRIP Lentiviral Vectors.</a> Mol Ther. 3 (4), 438-448 (2001).</li>
<li>Wu, C., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-titre+retroviral+vector+system+for+efficient+gene+delivery+into+human+and+mouse+cells+of+haematopoietic+and+lymphocytic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22J+gen+virol%22%5BJournal%5D)">High-titre retroviral vector system for efficient gene delivery into human and mouse cells of haematopoietic and lymphocytic lineages.</a> J gen virol. 91 (Pt 8), 1909-1918 (2010).</li>
<li>Irshad, H., Veillard, A., Roux, L., Racoceanu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+nuclei+detection%2C+segmentation%2C+and+classification+in+digital+histopathology%3A+A+review-current+status+and+future+potential%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Methods for nuclei detection, segmentation, and classification in digital histopathology: A review-current status and future potential.</a> IEEE Rev Biomed Eng. 7, 97-114 (2014).</li>
<li>Purschke, M., Rubio, N., Held, K. D., Redmond, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototoxicity+of+Hoechst+33342+in+time-lapse+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol+Sci%22%5BJournal%5D)">Phototoxicity of Hoechst 33342 in time-lapse fluorescence microscopy.</a> Photochem Photobiol Sci. 9 (12), 1634-1639 (2010).</li>
<li>Jaskova, K., Pavlovicova, M., Jurkovicova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+transporters+and+their+role+in+the+development+of+neuronal+disease+and+neuronal+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Gen+physiol+biophys%22%5BJournal%5D)">Calcium transporters and their role in the development of neuronal disease and neuronal damage.</a> Gen physiol biophys. 31 (4), 375-382 (2012).</li>
<li>Kieran, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+with+arimoclomol%2C+a+coinducer+of+heat+shock+proteins%2C+delays+disease+progression+in+ALS+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Treatment with arimoclomol, a coinducer of heat shock proteins, delays disease progression in ALS mice.</a> Nat Med. 10 (4), 402-405 (2004).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Er zijn twee belangrijkste benaderingen voor het genereren van stabiele cellijnen. De eerste duurt enkele weken en voorbijgaande transfectie en weerstand selectie van de genomic geïntegreerde plasmide DNA vectoren vereist. De tweede is een kwestie van uren door het gebruik van lentivirus, maken van dit protocol vatbaar voor de effectieve uitdrukking van doel eiwit in meerdere cellijnen met beperkte inspanning. De reis-CMV vector19 was een aanhoudende vector te gebruiken, met geconserveerde transdu...

Aggregatie van eiwitten is een biologisch proces waarbij eiwitten groep misfolded omhoog en kan fungeren als oorzakelijke agens in neurodegeneratieve ziekten (amyloidose). Karakterisering van de aggregatie van eiwitten is essentieel in het begrip van de rol van aggregaten in cellulaire disfunctie zo goed zoals het vergemakkelijken van de ontdekking van nieuwe factoren die invloed hebben op het ontstaan van de pathologie. De visualisatie van fluorescentie-gelabelde proteïnen in levende cellen is een krachtige methode die kan helpen bij de ontwikkeling van tests op hoog gehalte screening (HCS)1,,2,,3,4van toepassing.
Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) wordt beschouwd als een ziekte van de proteopathic veroorzaakt door de aanwezigheid van misfolded eiwitten met de neiging om statistische en zich ophopen in de motorische neuronen in familiale ALS (fALS) zowel de sporadische ALS (sALS)5,6 . Een subset van ~ 20% van de gevallen van de fALS worden geassocieerd met dominante mutaties in het gen codering het cytosolische anti-oxidant enzym koper-zink superoxide dismutase type 1 (SOD1)7,8. Verschillende mogelijke oorzaken voor dit genetisch afgeleide dysfunctie zijn voorgesteld, met inbegrip van wijzigingen in de structuur en functie van SOD1 varianten, zoals de afwijkende stabiliteit, toegenomen ontvouwen tarief en neiging tot statistische9, 10. Met name de enige gecontroleerde en potentieel toxische eigenschap gedeeld door beide ALS alternerende SOD1-varianten en wild-type (WT) SOD1 is een verhoogde neiging tot het vormen van de verzuilde eiwit-aggregaten of eiwithoudende insluitsels11,12 . Misfolded mutant SOD1, is aanhoudend polyubiquitinated en afgebroken door het ubiquitin-proteasoom-systeem. Dientengevolge, leidt een laag niveau van remming van het proteasoom activiteit tot de opeenstapeling van mutant die sod113,14 aggregaten, welke vorm amorf structuren bestaat uit oplosbare onderdelen die kunnen worden uitgewisseld met oplosbare mutant SOD1 in het cytosol15. In bepaalde, SOD1 mutant A4V (alanine op codon 4 gewijzigd in valine) is de meest voorkomende ALS-veroorzakende mutatie, en leidt tot snelle neurodegeneratie met een gemiddelde overlevingstijd van minder dan 2 jaar na ziekte begin16. Biochemically, heeft SOD1-A4V een verhoogde neiging tot monomerize, statistische en vormen van amyloïde pores; de porie-achtige aggregaten zijn vergelijkbaar met amyloïde poriën van andere ziekte-linked mutant vormen, zoals synuclein-α en β-amyloid proteïne17. Studeren de dynamiek van SOD1-aggregaat accumulatie, blijven de methoden voor de controle van oplosbare en onoplosbare SOD1 statistische formulieren worden ontwikkeld.
Wij hebben eerder getoond, met behulp van live-cel imaging en HEK-293 cellen transfected Transient met TL proteïne-gelabeld SOD1, dat ALS-geassocieerde mutaties SOD1 dimerisatie en aggregatie11schaden. Hoewel Transiënte expressiesystemen nuttige informatie over de biologische uitkomst van kortlopende overexpressie van het gen bieden kunnen, is er wellicht methoden leveren stabiele integratie van gewenste genen voor test ontwikkeling de voorkeur. Als zodanig, bieden lentivirale vectoren de mogelijkheid om op lange termijn en gereglementeerde genexpressie op zoogdiercellen 18verlenen. In deze studie, richtten we ons op de generatie van stabiele cellijnen getransduceerde met recombinant lentivirus, rekening houdend met WT en mutant SOD1 gemarkeerd met gele fluorescerende eiwit (YFP). Met behulp van live-cel imaging microscopie en geautomatiseerde kwantificering van SOD1 aggregatie, wij geactiveerd en gekwantificeerd SOD1 aggregatie gebeurtenissen op remming van het proteasoom.

<table><tbody><tr><td>ALLN (C20H37N3O4)</td><td>Millipore</td><td>208719</td><td></td></tr><tr><td>MG132 (C26H41N3O5)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2211</td><td></td></tr><tr><td>Epoxomicin (C28H50N4O7)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3652</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H-3570</td><td></td></tr><tr><td>Opera</td><td>Perkin Elmer</td><td>OP-QEHS-01</td><td></td></tr><tr><td>Opera EvoShell software</td><td>Perkin Elmer</td><td>Ver 1.8.1</td><td></td></tr><tr><td>Operetta</td><td>Perkin Elmer</td><td>OPRT1288</td><td></td></tr><tr><td>Harmony Imaging software</td><td>Perkin Elmer</td><td>Ver 3.0.0</td><td></td></tr><tr><td>Columbus Image analysis software</td><td>Perkin Elmer</td><td>Ver 2.3.2</td><td></td></tr><tr><td>CyBi Hummingwell liquid handling</td><td>CyBio AG</td><td>OL 3387 3 0110</td><td></td></tr></tbody></table>

assay ontwikkeling voor hoge inhoud kwantificering van sod1 mutant eiwit statistische vorming in levende cellen

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is een fatale neurodegeneratieve ziekte die kan worden veroorzaakt door erfelijke mutaties in het gen coderen koper-zink superoxide dismutase 1 (SOD1). De structurele instabiliteit van SOD1 en de opsporing van SOD1-positieve inclusies in familiale-ALS patiënten ondersteunt een mogelijke oorzakelijke rol weggelegd voor misfolded en/of geaggregeerde SOD1 ALS pathologie. In deze studie beschrijven we de ontwikkeling van een cel-gebaseerde test ontworpen te kwantificeren van de dynamiek van SOD1 aggregatie in levende cellen door hoog gehalte screening benaderingen. Met behulp van lentivirale vectoren, wij stabiele cellijnen uiting van wild-type en mutant A4V SOD1 gelabeld met gele fluorescerende eiwit en vond dat beide eiwitten werden uitgedrukt in het cytosol zonder enig teken van aggregatie gegenereerd. Interessant, alleen SOD1 A4V stabiel uitgedrukt in HEK-293, maar niet in U2OS of SH-SY5Y cellijnen, gevormd aggregaten op proteasoom remmer behandeling. We laten zien dat het mogelijk is te kwantificeren van de samenvoeging op basis van de dosis / respons-analyse van diverse proteasoom-remmers, en voor het bijhouden van aggregaat-vorming kinetiek door time-lapse microscopie. Onze benadering introduceert de mogelijkheid van kwantificering van het effect van de mutaties ALS over de rol van SOD1 in statistische vorming, alsmede het screenen voor kleine moleculen waardoor SOD1 A4V aggregatie.

Stabiele cellijn genereren met behulp van lentivirus: De algemene strategie voor SOD1-eiwit-aggregaten toezicht wordt geïllustreerd in Figuur 1. In een eerste stap, we genereerden een vector lentivirale expressie voor SOD1 stabiele gene levering in cellijnen (stap 1). Twee lentivirale vectoren codering SOD1-WT YFP-gelabeld en SOD1-A4V (SOD1WT-YFP en SOD1A4V-YFP, respectievelijk) met de verpakking en envelop plasmiden werden voorbereid (<stron...

Beschrijven we een methode om te kwantificeren van de samenvoeging van misfolded eiwitten. Onze gegevens-protocol lentivirale geïnduceerde stabiele cel lijn generatie, geautomatiseerde confocal beeldvorming en beeldanalyse van eiwit-aggregaten. Als een illustratieve toepassing onderzocht we het effect van kleine molecules biij SOD1 aggregatie op een tijd - en dosis-afhankelijke manier.

Assay ontwikkeling voor hoge inhoud kwantificering van Sod1 Mutant eiwit statistische vorming in levende cellen

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

Het algemene doel van dit experiment is om een test te ontwikkelen voor het bestuderen van de effecten van kleine moleculen bij het moduleren van de aggregatie van misgevouwen eiwitten op een tijd- en dosisafhankelijke manier. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van de belangrijkste vragen voor de ontwikkeling van cellulaire tests, en het gebruik ervan is voor high-content screeningtechnieken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een eenvoudige methode biedt om eiwitaggregatie te detecteren en te kwantificeren die optreedt bij verschillende neurodegeneratieve aandoeningen.De implicatie van deze techniek strekt zich uit naar potentiële therapie van neurodegeneratieve ziekten, zoals ALS, omdat het een eenvoudige methode voorstelt die het mogelijk maakt om cellulaire testen te ontwikkelen en screening uit te voeren voor kleine molecuulmoderatoren. Om de virusproductie te starten, verdeel de HEK-293 T-cellen bij 30 tot 40% confluency in een 10 centimeter weefselkweekschaal met 10 milliliter celkweekmedium. Incubeer de kweekplaat in een 5% koolstofdioxide incubator bij 37 graden Celsius een nacht lang.De volgende dag, bereid de DNA-transfectieoplossing met ve

assay-development-for-high-content-quantification-sod1-mutant-protein

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Dit manuscript beschrijft drie aanvullende protocollen voor de beoordeling van de toxiciteit van polyglutamine (polyQ)-uitbreiding van eiwitten in de...

Groei Testen om de polyglutamine toxiciteit in gist beoordelen

In this video, we demonstrate a cell-based protein aggregation assay using proteasome inhibitors, which block proteasome activity, preventing misfolded, mutant proteins, fused to a fluorescent label, from undergoing ubiquitin-dependent proteasomal degradation, leading to their accumulation within the cell cytoplasm. The protein aggregates are then visualized and quantified by fluorescence microscopy.

Protein Aggregate Formation Assay: A Method to Detect and Quantify Protein Aggregation in Cultured Cells upon Induction by Proteasome Inhibitor

This video describes a degradation assay for misfolded proteins using cycloheximide treatment along with detergent fractionation. This method aids in studying the dynamics of misfolded proteins and uncovering the in-depth mechanisms of protein turnover.

Misfolding-Prone Protein Degradation Assay: A Technique to Monitor Misfolded Protein Degradation Using Cycloheximide Treatment and Detergent Fractionation

This video demonstrates imaging and quantification of protein aggregates in genetically modified Drosophila brains. Brains are fixed, washed, and treated with an antifading agent before mounting. Images are captured using a confocal microscope and quantified to observe the transmission of mutant protein aggregates.

Imaging and Quantification of Protein Aggregates in Genetically Modified Drosophila Brains

Dit rapport beschrijft protocollen voor het meten van degradatiesnelheden van verkeerd gevouwen eiwitten door middel van western blot of fluorescentie-gebaseerde assays. De methoden kunnen worden toegepast op de analyse van andere verkeerd gevouwen eiwitten en voor high-throughput screening.

Assays voor de afbraak van Misfolded Eiwitten in Cellen

Cellulaire senescentie is de belangrijkste factor in de ontwikkeling van chronische leeftijdsgebonden pathologieën. Identificatie van therapeutische middelen die gericht zijn op senescentie cellen tonen belofte voor het verlengen van gezonde veroudering. Hier presenteren we een nieuwe assay voor de identificatie van senotherapeutica op basis van meting van senescentie geassocieerde β-galactosidase activiteit in enkelvoudige cellen.

Op SA-β-galactosidase gebaseerde screeningstest voor de identificatie van Senotherapeutische geneesmiddelen

Metingen van de drug target betrokkenheid staan centraal in effectieve Geneesmiddelenontwikkeling en chemische sonde validatie. Hier, detail we een protocol voor het meten van de drug-target engagement met behulp van hoge inhoud imaging in een microplate-compatibele adaptie van de cellulaire thermische shift test (CETSA).

Met behulp van hoog gehalte Imaging om te kwantificeren Target Engagement in Adherente cellen

We beschreven hier, een hoge-inhoud beeldvorming methode om te kwantificeren van het vervoer van rodopsine mutanten retinitis pigmentosa is gekoppeld. Een meerdere-golflengte scoren analyse werd gebruikt voor het kwantificeren van rodopsine eiwitten op het celoppervlak of in de hele cel.

Een kwantitatieve analyse van rodopsine, vervoer door High-Content Imaging analyse

We introduceren hier een procedure om eiwit oligomeren en aggregatie in cellysaat en levende cellen te meten met behulp van fluorescentiecorrelatiespectroscopie.

Detectie van eiwitaggregatie met behulp van fluorescentiecorrelatiespectroscopie

Hier wordt een methode gepresenteerd voor de analyse van eiwitaggregatiekinetiek in de nematode Caenorhabditis elegans. Dieren uit een leeftijdsgesynchroniseerde populatie worden op verschillende tijdstippen afgebeeld, gevolgd door semi-geautomatiseerde inclusietelling in CellProfiler en passend bij een wiskundig model in AmyloFit.

Monitoring eiwitaggregatiekinetiek in vivo met behulp van geautomatiseerde inclusietelling bij Caenorhabditis elegans

Een in vivo fysiologisch model van α-synucleïne is nodig om de pathogenese van de ziekte van Parkinson te bestuderen en te begrijpen. We beschrijven een methode om de cytotoxiciteit en geaggregeerde vorming van α-synucleïne te monitoren met behulp van een gehumaniseerd gistmodel.

Een methode om α-synucleïnetoxiciteit en -aggregatie te bestuderen met behulp van een gehumaniseerd gistmodel

Leer een assay ontwikkelen voor hoge-inhoud kwantificering van SOD1-mutant eiwitaggregatie in levende HEK-293 cellen. Deze methode ondersteunt screening van kleine moleculen voor neurodegeneratieve ziekten zoals ALS.

Assay ontwikkeling voor hoge inhoud kwantificering van Sod1 Mutant eiwit statistische vorming in levende cellen

Meer video's verkennen