Name: Overexpressie en zuivering van het menselijk Cis -prenyltransferase in Escherichia coli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Leer de overexpressie en zuivering van menselijk cis-prenyltransferase in Escherichia coli onder niet-denaturerende omstandigheden. Deze methode vergemakkelijkt onderzoek naar isoprenoïde synthese en retinitis pigmentosa.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door het Israëlic Science Foundation&#39;s Center for Research Excellence (I-CORE) in de Structurele Celbiologie (1775/12) en de Israëlic Science Foundation verleent 1721/16 en 2338/16 (YH) en 825/14 (DK ). De steun van de Fields Estate Foundation naar DK wordt zeer gewaardeerd. Dit werk werd uitgevoerd door Ilan Edri en Michal Goldenberg in gedeeltelijke vervulling van de MD thesis eisen van de Sackler Faculteit Geneeskunde, Tel Aviv University.

1. Klonen van cis -PT voor overexpressie in E. coli <ol><li> Verkrijg pET-32b expressievector, ontworpen voor klonen en expressie op hoog niveau van eiwitsequenties gefuseerd met het 109aa thioredoxine (TRX) eiwit 17 , en E. coli codon-geoptimaliseerde 18 coderende sequentie van cis -PT met volledige lengte. </li><li> Zorg ervoor dat een TEV-protease-splitsingsplaats (tabak etsvirus protease) is gesplitst (ENLYFQ / G, waar &quot;/&quot; het splitsingspunt aangeeft) 9 gevolgd door een korte flexibele linker (SGSGSG, om de toegankelijkheid van de splitsingsplaats te verbeteren) stroomopwaarts van de cis -PT-volgorde ( Figuur 1 A ). Voeg ook geschikte 5 &#39;en 3&#39; restrictieplaatsen toe voor het klonen. </li><li> Kloneer het gesynthetiseerde DNA-construct in de pET-32b vector door gebruik te maken van standaard ligatie technieken 10 . </li></ol> 2. OverexpreSsion van Human DHDDS in E. coli <ol><li> Transformeer E. coli T7 express bevoegde cellen met de TRX-fusion DHDDS construct volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Platte de getransformeerde cellen volgens de instructies van de fabrikant op LB-agar onder ampicilline selectieve condities (200 mg / L). </li><li> Inoculeer geselecteerde kolonies in 100 ml LB-medium in 250 ml flessen startculturen met 100 mg / L ampicilline en incubeer overnacht bij 37 ° C met constante schudden bij 200 rpm. </li><li> Inoculeer 80 ml van de kweek in twee 5 liter kolven (40 ml per fles), die elk 1,5 l 2x YT medium (16 g / l trypton, 10 g / l gist extract, 5 g / L NaCl) bevatten met 100 mg / L ampicilline. </li><li> Incubeer de cultuur bij 37 ° C met constante schudden bij 180 rpm totdat OD 600 nm = 0,5 bereikt wordt. </li><li> Verlaag de temperatuur tot 16 ° C en induceer de cellen door 0,5 mM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) toe te voegen. conInkuberen onder dezelfde conditie gedurende 16-20 uur voor eiwituitdrukking. </li><li> Oog de cellen door centrifugeren (10.000 x g gedurende 10 minuten). Opmerking: het protocol kan hier worden onderbroken; De cellenpelletjes dienen bij -80 ° C te worden gehouden tot zuivering. </li></ol> 3. Zuivering van menselijke DHDDS <ol><li> Resuspendeer de cellen in buffer A (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, 10 mM p-mercaptoethanol), 1 ug / ml DNase I en een proteaseremmersmengsel. </li><li> Homogeniseer de cellen met behulp van een glas-Teflon-homogenisator. </li><li> Ontwricht de cellen met behulp van een microfluidizer of equivalent bij 12.000 - 15.000 psi 11 . </li><li> Centrifugeer het cellysaat bij 40.000 xg gedurende 45 min bij 4 ° C. Herstel de supernatant, die de oplosbare fractie bevat. </li><li> Laad de supernatant op een 5 - 10 ml kobalt geïmmobiliseerde metaal affiniteit chromatografie (Co 2+ -IMAC) 12 kolom met 10MM imidazool, gevolgd door grondig wassen met buffer A en 10 mM imidazool om nonspecifieke eiwitbinding te verminderen. </li><li> Verwijder de overexpressieerde eiwitten met buffer A aangevuld met 250 mM imidazool. </li><li> Verwijder imidazool door gebruik te maken van een 53 ml preparatieve ontzoutkolom geëquilibreerd met buffer A. </li><li> Voeg 6xHis-getagged TEV protease (1 mg TEV protease per 50 mg eiwit) toe aan de geëlueerde eiwitten om hun 6xHis-getagde TRX-fusie-eiwit bij 4 ° C overnacht te verwijderen. </li><li> Laad de gesplitste eiwitten op een Co 2+ -IMAC kolom, geëquilibreerd met buffer A aangevuld met 5 mM imidazool, om het gesplitste 6x His-getagde TRX-fusie-eiwit en TEV-protease te verwijderen. </li><li> Verzamel de doorstroming en concentreer op 3 - 4 ml met behulp van een 30 kDa molecuulgewicht afsnijcentrifugaalfilter. </li><li> Laad het geconcentreerde eiwit op een superdex-200 grootte-exclusion chromatografie kolom geëquilibreerd met buffer A voor de uiteindelijke zuivering. Het eiwit eluteert als een dimer (~ 76 kDa). </li&gt; <li> Selecteer relevante fracties door het elutieprofiel te vergelijken met een kolomkalibratiekromme. </li><li> Bepaal de zuiverheid van het preparaat met SDS-PAGE. </li><li> Bepaal de eiwitconcentratie die nodig is voor stroomafwaartse experimentatie en flash-bevriezen aliquots van gezuiverde, geconcentreerde eiwitten in vloeibare stikstof en opslaan bij -80 ° C tot gebruik. </li></ol> 4. Analytische grootte-uitsluiting chromatografie (SEC) <ol><li> Om het vermogen van het eiwit om de vries-ontdooicyclussen te verdragen, dient u een aliquot van de bevroren eiwitten te ontdooien en gedurende 10 minuten bij 21.000 x g te centrifugeren om onoplosbare aggregaten te verwijderen. Verzamel de supernatant. </li><li> Laad de eiwitten op een superdex-200 analytische kolom, vooraf geëquilibreerd met 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,02% Triton X-100, 10 mM P-mercaptoethanol, onder toepassing van een ultraprestaties vloeistofchromatografie systeem 13 , 14 . </li><li> Monitor tryptofaan fluorScence (λ ex = 280 nm, λ em = 350 nm) om het elutie-elutieprofiel van de eiwitten te detecteren. Zorg ervoor dat u een geldige kalibratiekromme hebt voor het bepalen van de molecuulgewicht. Deze curven zijn verkrijgbaar via de SEC-kolomfabrikanten. </li></ol> 5. Enzym Kinetiek - Tijdafhankelijke Activiteit 15 , 16 , 17 <ol><li> Om de activiteit van het gezuiverde eiwit te waarborgen, meng 5 uM gezuiverd DHDDS met 10 pM en 50 pM FPP 14C-IPP de reactie in buffer A te leiden met 0,5 mM MgCl2 bij 22 - 30 ° C. Opmerking: De exacte reactieomstandigheden kunnen variëren met preparaten van cis -PTs die verschillen van DHDDS. Bovendien hangt de activiteit van DHDDS ook af van de temperatuur en [Mg 2+ ]. Let op: 14 C-IPP is radioactief en dient volgens de plaatselijke stralingsveiligheidsvoorschriften te worden gebruikt. </li&gt; <li> 15 μL monsters uit de reactie op 0, 2, 4 en 6 uur opnemen, na onmiddellijke quenching van de reactie door toevoeging van 15 μl buffer A aangevuld 20 mM EDTA (tot een eindconcentratie van 10 mM EDTA). </li><li> Voeg 1 ml H2O-verzadigd 1-butanol en vortex grondig de reactieproducten te extraheren. Opmerking: het protocol kan hier gestopt worden en de monsters kunnen worden bewaard voor latere lezing. </li><li> Voeg scintillatiecocktail toe aan de monsters en, met behulp van een scintillatieteller, kwantificeer reactieproducten in de butanolfase 14 C, samen met de radioactiviteit van 15 ul uit het reactiemengsel, dat de totale radioactiviteit vertegenwoordigt. </li><li> Trek de achtergrondwaarden af, gemeten met behulp van de 0 h monsters van elk tijdstip en bereken het percentage van 14 C-IPP dat wordt gebruikt. </li><li> Bereken de netto 14 C-IPP-integratie op elk tijdstip door het percentage te berekenen dat wordt gebruikt uit het totaal van 14 </Sup&gt; C-IPP concentraties, en plot de resultaten als een functie van de tijd. Een stijging van de netto 14 C-IPP-integratie met de tijd wordt verwacht. </li></ol>

<ol><li>Grabinska, K. A., Park, E. J., Sessa, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cis-Prenyltransferase%3A+New+Insights+into+Protein+Glycosylation%2C+Rubber+Synthesis%2C+and+Human+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">cis-Prenyltransferase: New Insights into Protein Glycosylation, Rubber Synthesis, and Human Diseases.</a> J Biol Chem. 291 (35), 18582-18590 (2016).</li>
<li>Ogura, K., Koyama, T., Sagami, H. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/chapter/10.1007/978-1-4615-5901-6_3">Polyprenyl diphosphate synthases.</a> Subcell Biochem. 28, 57-87 (1997).</li>
<li>Ogura, K., Koyama, T. Enzymatic Aspects of Isoprenoid Chain Elongation. Chem Rev. 98 (4), 1263-1276 (1998).</li>
<li>Imperiali, B., O'Connor, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+N-linked+glycosylation+on+glycopeptide+and+glycoprotein+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Effect of N-linked glycosylation on glycopeptide and glycoprotein structure.</a> Curr Opin Chem Biol. 3 (6), 643-649 (1999).</li>
<li>Bukhtiyarov, Y. E., Shabalin, Y. A., Kulaev, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solubilization+and+characterization+of+dehydrodolichyl+diphosphate+synthase+from+the+yeast+Saccharomyces+carlsbergensis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Solubilization and characterization of dehydrodolichyl diphosphate synthase from the yeast Saccharomyces carlsbergensis.</a> J Biochem. 113 (6), 721-728 (1993).</li>
<li>Adair, W. L., Cafmeyer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+cis-prenyltransferase+required+for+dolichyl+phosphate+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Saccharomyces cerevisiae cis-prenyltransferase required for dolichyl phosphate biosynthesis.</a> Arch Biochem Biophys. 259 (2), 589-596 (1987).</li>
<li>Zelinger, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+missense+mutation+in+DHDDS%2C+encoding+dehydrodolichyl+diphosphate+synthase%2C+is+associated+with+autosomal-recessive+retinitis+pigmentosa+in+Ashkenazi+Jews%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">A missense mutation in DHDDS, encoding dehydrodolichyl diphosphate synthase, is associated with autosomal-recessive retinitis pigmentosa in Ashkenazi Jews.</a> Am J Hum Genet. 88 (2), 207-215 (2011).</li>
<li>Zuchner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-exome+sequencing+links+a+variant+in+DHDDS+to+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Whole-exome sequencing links a variant in DHDDS to retinitis pigmentosa.</a> Am J Hum Genet. 88 (2), 201-206 (2011).</li>
<li>Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+soluble+His%286%29-tagged+TEV+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease.</a> Methods Mol Biol. 498, 297-307 (2009).</li>
<li>Crouse, G. F., Frischauf, A., Lehrach, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+and+simplified+approach+to+cloning+into+plasmids+and+single-stranded+phages%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">An integrated and simplified approach to cloning into plasmids and single-stranded phages.</a> Methods Enzymol. 101, 78-89 (1983).</li>
<li>Middelberg, A. P. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/073497509502007P">Process-scale disruption of microorganisms.</a> Biotechnol Adv. 13 (3), 491-551 (1995).</li>
<li>Block, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilized-metal+affinity+chromatography+%28IMAC%29%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Immobilized-metal affinity chromatography (IMAC): a review.</a> Methods Enzymol. 463, 439-473 (2009).</li>
<li>Sachyani, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+a+Kv7.1+potassium+channel+gating+module%3A+studies+of+the+intracellular+c-terminal+domain+in+complex+with+calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural basis of a Kv7.1 potassium channel gating module: studies of the intracellular c-terminal domain in complex with calmodulin.</a> Structure. 22 (11), 1582-1594 (2014).</li>
<li>Shuart, N. G., Haitin, Y., Camp, S. S., Black, K. D., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+for+3%3A1+subunit+stoichiometry+of+rod+cyclic+nucleotide-gated+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism for 3:1 subunit stoichiometry of rod cyclic nucleotide-gated ion channels.</a> Nat Commun. 2, 457(2011).</li>
<li>Chang, S. Y., Tsai, P. C., Tseng, C. S., Liang, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refolding+and+characterization+of+a+yeast+dehydrodolichyl+diphosphate+synthase+overexpressed+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Refolding and characterization of a yeast dehydrodolichyl diphosphate synthase overexpressed in Escherichia coli.</a> Protein Expr Purif. 23 (3), 432-439 (2001).</li>
<li>Chang, S. Y., Ko, T. P., Liang, P. H., Wang, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalytic+mechanism+revealed+by+the+crystal+structure+of+undecaprenyl+pyrophosphate+synthase+in+complex+with+sulfate%2C+magnesium%2C+and+triton%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Catalytic mechanism revealed by the crystal structure of undecaprenyl pyrophosphate synthase in complex with sulfate, magnesium, and triton.</a> J Biol Chem. 278 (31), 29298-29307 (2003).</li>
<li>Guo, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structures+of+undecaprenyl+pyrophosphate+synthase+in+complex+with+magnesium%2C+isopentenyl+pyrophosphate%2C+and+farnesyl+thiopyrophosphate%3A+roles+of+the+metal+ion+and+conserved+residues+in+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Crystal structures of undecaprenyl pyrophosphate synthase in complex with magnesium, isopentenyl pyrophosphate, and farnesyl thiopyrophosphate: roles of the metal ion and conserved residues in catalysis.</a> J Biol Chem. 280 (21), 20762-20774 (2005).</li>
<li>Collins, F. S., Green, E. D., Guttmacher, A. E., Guyer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vision+for+the+future+of+genomics+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A vision for the future of genomics research.</a> Nature. 422 (6934), Institute, U.S.N.H.G.R. 835-847 (2003).</li>
<li>Freeze, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+human+glycosylation+disorders%3A+biochemistry+leads+the+charge%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Understanding human glycosylation disorders: biochemistry leads the charge.</a> J Biol Chem. 288 (10), 6936-6945 (2013).</li>
<li>LaVallie, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thioredoxin+gene+fusion+expression+system+that+circumvents+inclusion+body+formation+in+the+E.+coli+cytoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%28N+Y%29%22%5BJournal%5D)">A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm.</a> Biotechnology (N Y). 11 (2), 187-193 (1993).</li>
<li>Elena, C., Ravasi, P., Castelli, M. E., Peiru, S., Menzella, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+codon+optimized+genes+in+microbial+systems%3A+current+industrial+applications+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Expression of codon optimized genes in microbial systems: current industrial applications and perspectives.</a> Front Microbiol. 5, 21(2014).</li>
<li>Vincentelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+protein+expression+screening+and+purification+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput protein expression screening and purification in Escherichia coli.</a> Methods. 55 (1), 65-72 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het protocol dat hier wordt beschreven voor zuivering van functionele humane DHDDS in E. coli cellen is eenvoudig en efficiënt, waardoor men het eiwit over 3-4 dagen kan uitdrukken en zuiveren zodra een geschikt construct beschikbaar is. Dergelijke protocollen voor eiwitzuivering zijn van bijzondere betekenis gegeven door de doorbraken in genoomsequentiebepaling, die veel informatie verschaft over de genetica van vele ziekten 18 , waardoor de ontwikkeling van high-throughputmethoden vere...

Prenyltransferasen zijn een groep enzymen die de kettingverlenging van allylischifosfaat met behulp van isopentenyldifosfaat (IPP) katalyseren via meerdere condensatie reacties 1 , 2 . Z-type enzymen katalyseren de vorming van cis dubbele bindingen uit de condensatiereactie, terwijl E-type enzymen trans- dubbelbindingsvorming 3 katalyseren. cis -Prenyltransferases (cis -PT, Z-type enzymen) zijn klassiek geclassificeerd volgens hun product ketenlengte in korte keten (C15), middellange-keten (50-55) en lange-keten (70-120 ) 4 . DHDDS (dehydrodolichyl difosfaat synthase) een eukaryotische langketenige cis -PT die ketenverlenging katalyseert van farnesyl difosfaat (FPP, een allylisch difosfaat) via meerdere condensaties met isopentenyldifosfaat (IPP) 1, 5 , 6 . Dit resulteert in de vorming van dehydrodolichyldifosfaat, een C 55-100 polyprenyldifosfaat dat als voorloper voor dolichylpyrofosfaat, de glycosyldragermolecuul betrokken bij N-gekoppelde eiwitglycosylering 1 dient . Bij Ashkenazi-joden resulteert een missense niet-conservatieve mutatie (K42E) in DHDDS autosomale recessieve retinitis pigmentosa 7 , 8 . Daarom is het onderhavige protocol ontwikkeld om zuiverde DHDDS te verkrijgen die geschikt zijn voor mechanistische studies. Escherichia coli wordt beschouwd als de meest geschikte en kosteneffectieve gastheer voor recombinante eiwit expressie, en is daarom ook de meest gebruikte gastheer. Wanneer men echter eiwitten in E. coli heterologisch overexpresseert, moeten eiwitspecifieke overwegingen worden gemaakt. Verkrijgen van goed gevouwen, actiefE recombinante eiwitten uit E. coli , is niet een eenvoudige kwestie door de verschillende eigenschappen van verschillende eiwitten. Er zijn talrijke aanpak ontwikkeld om deze hindernissen te overwinnen. Hierbij werd het gebruik van eiwitfusie, geoptimaliseerde kweekomstandigheden en codonoptimalisatie gebruikt om de overexpressie en zuivering van functioneel actieve humane DHDDS in E. coli toe te staan . Van te voren was een eerdere poging om gist cis -PT te overexpressen zonder eiwitfusie mislukt door volledige onoplosbaarheid zelfs in aanwezigheid van detergent 12 . Het beschreven protocol is eenvoudig, kosteneffectief, tijdbesparend en maakt het mogelijk om DHDDS preparaten te verkrijgen die geschikt zijn voor mechanistische studies. Gezien de homologie van cis -PT tussen verschillende soorten, raden we aan dat dit protocol ook toegepast kan worden op andere eukaryotische cis -PT.

<table><tbody><tr><td>pET-32b</td><td>Novagen</td><td>69016-3</td><td></td></tr><tr><td>T7 Express&nbsp;lysY&nbsp;Competent&nbsp;E. coli&nbsp;(High Efficiency)</td><td>NEB</td><td>C3010I</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>TALON-superflow hars</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9574-99</td><td></td></tr><tr><td>HiPrep 26/10 ontzouting kolom&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>17508701</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 16/60 superdex-200&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>28989335</td><td></td></tr><tr><td>superdex-200 increase 5/150 GL&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>28990945</td><td></td></tr><tr><td>14C-Isopentenyl pyrofosfaat</td><td>Perkin-Elmer</td><td>NEC773050UC&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>trans,trans-Farnesyl pyrofosfaat</td><td>Sigma</td><td>44270-10MG</td><td></td></tr></tbody></table>

overexpressie en zuivering van het menselijk cis -prenyltransferase in escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) zijn een groep enzymen die de kettingverlenging van allylic difosfaat met behulp van isopentenyldifosfaat (IPP) katalyseren via meerdere condensatie reacties. DHDDS (dehydrodolichyl difosfaat synthase) een eukaryotische langketenige cis -PT (vorming van cis-dubbele bindingen van de condensatiereactie) die ketenverlenging van farnesyl difosfaat (FPP, een allylisch difosfaat) katalyseert via meerdere condensaties met isopentenyldifosfaat (IPP). DHDDS is van biomedisch belang, aangezien een niet-conservatieve mutatie (K42E) in het enzym resulteert in retinitis pigmentosa , wat uiteindelijk tot blindheid leidt. Daarom is het onderhavige protocol ontwikkeld om grote hoeveelheden gezuiverde DHDDS te verkrijgen, geschikt voor mechanistische studies. Hierbij werd het gebruik van eiwitfusie, geoptimaliseerde kweekomstandigheden en codonoptimalisatie gebruikt om de overexpressie en zuivering van functioneel actieve humane DHDDS in <em&gt; E. Coli. Het beschreven protocol is eenvoudig, kosteneffectief en tijdbesparend. De homologie van cis -PT tussen verschillende soorten suggereert dat dit protocol ook toegepast kan worden op andere eukaryotische cis -PT, zoals die welke betrokken zijn bij synthetische synthetische rubber.

Algemeen overzicht van het hier gebruikte constructie en het zuiveringsproces worden getoond in Figuur 1 . De bij elke zuiveringsstap verkregen monsters worden getoond in figuur 2 . Deze SDS-PAGE analyse toont de stapsgewijze zuivering van DHDDS, wat resulteert in een sterk gezuiverd product. Figuur 3 toont de resultaten van analytische SEC van het gezuiverde enzym, waarbij wordt gebleken dat het ei...

Een eenvoudig protocol voor overexpressie en zuivering van codon-geoptimaliseerde, humane cis -prenyltransferase, onder niet-denaturerende omstandigheden, van Escherichia Coli , wordt beschreven, samen met een enzymatische activiteitstest. Dit protocol kan worden genegaliseerd voor de productie van andere cis- prenyltransferase eiwitten in hoeveelheid en kwaliteit geschikt voor mechanistische studies.

Overexpressie en zuivering van het menselijk Cis -prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Het algemene doel van dit protocol is om codon-geoptimaliseerde humane cis-prenyltransferase onder niet-denaturerende omstandigheden te overexpresseren en te zuiveren en om de enzymatische activiteit ervan te meten. De procedure wordt gedemonstreerd met de eukaryote lange-keten cis-prenyltransferase dehydrodolichyl difosfaat synthase, of DHDDS. Deze methode kan ons begrip van isoprenoïdsynthese verbeteren en belangrijke inzichten bieden in het pathofysiologische mechanisme van retinitis pigmentosa gerelateerd aan mutaties in DHDDS.De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het eenvoudig, kosteneffectief en tijdbesparend is. Het kan ook worden gegeneraliseerd voor de productie van grote hoeveelheden andere cis-prenyltransferase-eiwitten. Begin deze procedure met het klonen van een expressie van humane DHDDS, zoals beschreven in het tekstprotocol.Resuspendeer de cellen in buffer A, één microgram per milliliter DNase I en een mengsel van proteaseremmers. Homogeniseer vervolgens de gesuspendeerde cellen met behulp van een glazen Teflon-homogenisator. Verstoren de cellen met een Microfluidizer of equivalent bij 12.000 tot 15.000 psi.Centrifugeer vervolgens het cellysaat gedurende 45 minuten bij 40.000 keer g en vier graden Celsius. Verzamel het supernatant dat de oplosbare fractie bevat. Laad het supernatant op een cobalt-geïmmobiliseerde metaalaffiniteitschromatografiekolom van vijf tot tien millimeter met 10 millimolair imidazool.Na het laden in een fast protein liquid chromatography-apparaat, voer een grondige wassing van de kolom uit met buffer A in 10 millimolair imidazool om niet-specifieke eiwitbinding te verminderen. Begin het FPLC-programma. Elueren de overgeëxprimeerde eiwitten met buffer A aangevuld met 250 millimolair imidazool.Na elutie, verwijder het imidazool met behulp van 53 milliliter van een preparatieve ontzoutingskolom geëquilibreerd met buffer A. Voeg vervolgens hexahistidine-gelabelde TEV-protease toe aan de geëlueerde eiwitten om hun hexahistidine-gelabelde thioredoxine DHDDS-fusie te verwijderen. Incubeer het mengsel gedurende één nacht bij vier graden Celsius. Laad vervolgens de gekloven eiwitten op een cobalt-geïmmobiliseerde metaalaffiniteitschromatografiekolom geëquilibreerd met buffer A aangevuld met vijf millimolair imidazool.Verzamel het flowthrough om de gekloven hexahistidine-gelabelde thioredoxine en TEV-protease te verwijderen. Concentreer het flowthrough tot tussen de drie en vier milliliter met behulp van een 30 kilodalton moleculair gewicht cut-off centrifugaalfilter. Laad vervolgens het geconcentreerde eiwit op een Superdex 200 grootte-exclusiechromaatografiekolom geëquilibreerd met buffer A voor de laatste zuivering.Plaats de monsters in een 96-well rack in een fractiecollector. Het eiwit elueert als een dimeer. Selecteer relevante fracties door de elutieprofiel te vergelijken met een kolomkalibratiecurve.Op dit punt beoordeel de zuiverheid van de bereiding met behulp van SDS-PAGE. Bepaal tenslotte de eiwitconcentratie die nodig is voor downstream-experimenten en vries aliquots van gezuiverd geconcentreerd eiwit in vloeibare stikstof snel in. Bewaar de aliquots bij min 80 graden Celsius tot gebruik.Om de mogelijkheid van het eiwit om vries-doodcycli te weerstaan te waarborgen, ontdooi een aliquot van de bevroren eiwitten. Centrifugeer het aliquot gedurende 10 minuten bij 21.000 keer g om onoplosbare aggregaten te verwijderen. Verzamel na centrifugatie het supernatant.Laad vervolgens de eiwitten op een Superdex 200 analytische kolom, vooraf geëquilibreerd met TNXB, met behulp van een ultra performance liquid chromatography systeem. Volg de tryptofaanfluorescentie om het elutieprofiel van het eiwit te detecteren. Zorg ervoor dat u een geldige kalibratiecurve heeft voor moleculairgewichtsbeoordeling, die beschikbaar is via de SEC-kolomfabrikanten.Om de activiteit van het gezuiverde eiwit te waarborgen, meng eerst vijf micromolair gezuiverde DHDDS met tien micromolair FPP en vijftig micromolair C14 IPP. Start de reactie in buffer A met 0,5 millimolair magnesiumchloride bij 22 tot 30 graden Celsius. Neem 15 microliter monsters van de reactie bij nul, twee, vier en zes uur na directe beëindiging van de reactie door de toevoeging van 15 microliter buffer A aangevuld met 20 millimolair EDTA.Voeg vervolgens een milliliter waterverzadigd 1-butanol toe en klop grondig door om de reactieproducten te extraheren. Het protocol kan hier worden gestopt en de monsters kunnen later worden gelezen. Voeg vervolgens het scintillatiecocktail toe aan de monsters.Gebruik een scintillatieteller om reactieproducten in de butanolfase die C14 omvat samen met de radioactiviteit van 15 microliters van de reactie te kwantificeren, wat de totale radioactiviteit vertegenwoordigt. Bereken tenslotte de netto C14 IPP-incorporatie bij elk tijdstip door het percentage te berekenen dat is gebruikt van de totale C14 IPP-concentraties en zet de resultaten uit als functie van de tijd. Er wordt een toename van de netto C14 IPP-incorporatie verwacht met de tijd.De monsters verkregen bij elke zuiveringsstap worden hier getoond. Deze SDS-PAGE-analyse toont de stapsgewijze zuivering van DHDDS, wat resulteert in een hoog gezuiverd product. Dit chromatogram vertegenwoordigt de resultaten van analytische grootte-exclusiechromatografie van het gezuiverde enzym, waaruit blijkt dat het eiwit alleen wordt waargenomen als een homodimeer.Hier geeft de pijl het doodvolume aan. Een representatieve tijdsafhankelijke activiteitstest onthult dat C14 IPP-incorporatie duidelijk stijgt gedurende zes uur, wat bevestigt dat het gezuiverde enzym functioneel is. Eenmaal beheerst, kan deze eenvoudige voorbereiding in twee tot drie dagen worden uitgevoerd, wat resulteert in een zeer zuiver en actief enzym.Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u humane cis-prenyltransferase uit E.coli kunt overexpresseren en zuiveren en om zijn activiteit op een tijdsafhankelijke manier te meten.

overexpression-purification-human-cis-prenyltransferase-escherichia

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Deze vijfdaagse protocol beschrijft alle stappen, apparatuur en aanvullende software voor het maken en uitvoeren van een efficiënte endogene Escherichia coli op basis TX-TL-cel-vrije expressie systeem vanaf nul. Met reagentia, het protocol duurt 8 uur of minder voor het inrichten van een reactie, verzamelen en verwerken van gegevens.

Protocollen voor implementatie van een Escherichia coli Op basis TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Een gestroomlijnde benadering screening op de expressie van recombinant membraaneiwitten in Escherichia coli gebaseerd op fusie met groen fluorescent proteïne gepresenteerd.

Green Fluorescent Protein gebaseerd Expression Screening van membraaneiwitten in<em&gt; Escherichia coli</em

Eiwit co-expressie is een krachtige alternatief voor de reconstitutie in vitro van eiwitcomplexen, en helpt bij het uitvoeren van biochemische en genetische tests in vivo. Hier rapporteren we over het gebruik van eiwit co-expressie in Escherichia coli om eiwitcomplexen te verkrijgen en om de mutatiefrequentie van cellen af te stemmen.

De veelzijdige voordelen van Protein Co-expressie in<em&gt; Escherichia coli</em

Zinkvinger domeinen zijn intrinsiek cel permeabel en geschikt mediëren eiwit plaatsing in een breed scala aan zoogdier celtypen. Hier wordt een uitvoerige stap-voor-stap-protocol voor de uitvoering van zink-vinger-technologie voor intracellulaire eiwit levering gepresenteerd.

Direct Eiwit Levering aan zoogdiercellen behulp van Cell-permeabel Cys<sub&gt; 2</sub&gt; -Zijn<sub&gt; 2</sub&gt; Zinkvinger Domeinen

Dit is een snel, kosteneffectief protocol voor de productie van uitgescheiden, geglycoseerde zoogdier-eiwitten en daaropvolgende eenstapszuivering met voldoende opbrengsten van homogeen eiwit voor röntgenkristallografie en andere biofysische studies.

Efficiënte zoogdiercelexpressie en Single-step Zuivering van extracellulaire Glycoproteïnen voor kristallisatie

De productie op laboratoriumschaal van eukaryote eiwitten met passende post-translationele modificatie vormt een belangrijke barrière. Hier is een robuust protocol met snelle implementatie en doorlooptijd voor eiwitexpressie met behulp van een zoogdier-expressiesysteem. Dit systeem ondersteunt selectieve aminozuren, selectieve markering van eiwitten en kleine moleculaire modulatoren van glyconsamenstelling.

High Yield Expressie van recombinante humane eiwitten met de Transient Transfectie van HEK293 cellen in suspensie

Biochemische en structurele analyses van geglycosyleerde eiwitten vereist relatief grote hoeveelheden van homogene monsters. Hier presenteren we een efficiënte chemische methode voor site-specifieke glycosylatie van recombinante eiwitten gezuiverd van bacteriën door zich te richten van reactieve Cys thiolen.

Cysteïne thiolen richtend voor in Vitro site-specifieke glycosylatie van recombinante eiwitten

Synthetische biologie waardoor de engineering van eiwitten met ongekende eigenschappen met behulp van het co-translational inbrengen van niet-canonieke aminozuren. Hier, presenteerden we hoe een spectraal rood-verschoven variant van een GFP-type fluorophore met roman fluorescentie spectroscopische eigenschappen, genoemd "goud" fluorescent proteïne (GdFP), wordt geproduceerd in E. coli via selectieve druk opneming (SPI).

Engineering 'Golden' fluorescentie door selectieve druk opneming van niet-canonieke aminozuren en eiwit analyse door massaspectrometrie en fluorescentie

Dit protocol beschrijft technieken gebruikt om te bepalen van ion kanaal structuren door cryo-elektronenmicroscopie, met inbegrip van een systeem van de baculovirus gebruikt om genen in zoogdiercellen met minimale inspanning en toxiciteit, eiwit winning, zuivering, efficiënt en kwaliteit controleren, Raster monstervoorbereiding en screening, evenals gegevensverzameling en verwerking.

Meningsuiting en zuivering van de TRPC3 mens lipide-gevoelige catie kanaal voor structurele bepaling door Single-deeltje Cryo-elektronenmicroscopie

We beschrijven een methode voor de karakterisering van protonen-gedreven membraan transporteurs in membraan vesikel preparaten geproduceerd door heterologeuze expressie in E. coli en Lysis van cellen met behulp van een Franse pers.

Karakterisering van membraan transporters door Heterologeuze expressie in E. coli en productie van membraan blaasjes

Dit artikel beschrijft een methodologie voor het tot overexpressie brengen van recombinant Nsp15, een toxische nuclease, in een C41(DE3) expressiesysteem, gevolgd door zuivering van het gelabelde eiwit met behulp van affiniteits- en grootte-uitsluitingschromatografie. Deze protocollen kunnen worden aangepast voor andere uitdagende giftige eiwitten.

Overexpressie en zuivering van een toxische nuclease van Escherichia coli

Leer de overexpressie en zuivering van menselijk cis-prenyltransferase in Escherichia coli onder niet-denaturerende omstandigheden. Deze methode vergemakkelijkt onderzoek naar isoprenoïde synthese en retinitis pigmentosa.

Overexpressie en zuivering van het menselijk Cis -prenyltransferase in Escherichia coli

Meer video's verkennen