Name: High-throughput parallelle Sequencing maatregel fitness van Leptospira interrogans Transposon invoeging mutanten tijdens Golden Syrische Hamster infectie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 50 s
Description: Leer een high-throughput transposon sequencing methode om fitness defecten van Leptospira interrogans mutanten te identificeren in hamsters. Deze techniek minimaliseert diergebruik en versnelt onderzoek naar virulentiegenen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door een veteranen zaken Merit Award (aan D.A.H.) en een National Institute of Health toekennen R01 AI 034431 (D.A.H.).

<ol><li>Murray, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+transposon+mutagenesis+in+pathogenic+Leptospira+species%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Genome-wide transposon mutagenesis in pathogenic Leptospira species.</a> Infect Immun. 77 (2), 810-816 (2009).</li>
<li>Adler, B., Lo, M., Seemann, T., Murray, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+leptospirosis%3A+the+influence+of+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of leptospirosis: the influence of genomics.</a> Vet Microbiol. 153 (1-2), 73-81 (2011).</li>
<li>Marcsisin, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+high-throughput+screen+to+identify+Leptospira+mutants+unable+to+colonize+the+carrier+host+or+cause+disease+in+the+acute+model+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of a high-throughput screen to identify Leptospira mutants unable to colonize the carrier host or cause disease in the acute model of infection.</a> J Med Microbiol. 62, 1601-1608 (2013).</li>
<li>van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tn-seq%3A+high-throughput+parallel+sequencing+for+fitness+and+genetic+interaction+studies+in+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms.</a> Nat Methods. 6 (10), 767-772 (2009).</li>
<li>van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+fitness+and+genetic+interactions+determined+by+Tn-seq%2C+a+high-throughput+massively+parallel+sequencing+method+for+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide fitness and genetic interactions determined by Tn-seq, a high-throughput massively parallel sequencing method for microorganisms.</a> Curr Protoc Microbiol. 36, 1E.3.1-1E.3.24 (2015).</li>
<li>Troy, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+barriers+to+Borrelia+burgdorferi+dissemination+during+infection+using+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Understanding barriers to Borrelia burgdorferi dissemination during infection using massively parallel sequencing.</a> Infect Immun. 81 (7), 2347-2357 (2013).</li>
<li>Wunder, E. A. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+PCR+reveals+rapid+dissemination+of+Leptospira+interrogans+after+intraperitoneal+and+conjunctival+inoculation+of+hamsters%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Real-time PCR reveals rapid dissemination of Leptospira interrogans after intraperitoneal and conjunctival inoculation of hamsters.</a> Infect Immun. 84 (7), 2105-2115 (2016).</li>
<li>Lourdault, K., Aviat, F., Picardeau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+quantitative+real-time+PCR+for+studying+the+dissemination+of+Leptospira+interrogans+in+the+guinea+pig+infection+model+of+leptospirosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of quantitative real-time PCR for studying the dissemination of Leptospira interrogans in the guinea pig infection model of leptospirosis.</a> J Med Microbiol. 58, 648-655 (2009).</li>
<li>Coutinho, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+Leptospira+interrogans+infection+in+hamsters+after+intradermal+and+subcutaneous+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Kinetics of Leptospira interrogans infection in hamsters after intradermal and subcutaneous challenge.</a> PLoS Negl Trop Dis. 8 (11), e3307(2014).</li>
<li>Athanazio, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rattus+norvegicus+as+a+model+for+persistent+renal+colonization+by+pathogenic+Leptospira+interrogans%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Trop%22%5BJournal%5D)">Rattus norvegicus as a model for persistent renal colonization by pathogenic Leptospira interrogans.</a> Acta Trop. 105 (2), 176-180 (2008).</li>
<li>Ratet, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+bioluminescent+Leptospira+interrogans+in+mice+reveals+renal+colonization+as+a+stealth+escape+from+the+blood+defenses+and+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Live imaging of bioluminescent Leptospira interrogans in mice reveals renal colonization as a stealth escape from the blood defenses and antibiotics.</a> PLoS Negl Trop Dis. 8 (12), e3359(2014).</li>
<li>Gutierrez, M. G., Yoder-Himes, D. R., Warawa, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+identification+of+virulence+factors+required+for+respiratory+melioidosis+using+Tn-seq+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comprehensive identification of virulence factors required for respiratory melioidosis using Tn-seq mutagenesis.</a> Front Cell Infect Microbiol. 5 (78), (2015).</li>
<li>Gawronski, J. D., Wong, S. M., Giannoukos, G., Ward, D. V., Akerley, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+insertion+mutants+within+libraries+by+deep+sequencing+and+a+genome-wide+screen+for+Haemophilus+genes+required+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Tracking insertion mutants within libraries by deep sequencing and a genome-wide screen for Haemophilus genes required in the lung.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16422-16427 (2009).</li>
<li>Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+identification+of+resistance+functions+in+Pseudomonas+aeruginosa+using+Tn-seq%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq.</a> MBio. 2 (1), (2011).</li>
<li>Slamti, L., Picardeau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+library+of+random+mutants+in+the+spirochete+Leptospira+biflexa+using+a+mariner+transposon%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Construction of a library of random mutants in the spirochete Leptospira biflexa using a mariner transposon.</a> Methods Mol Biol. 859, (2012).</li>
<li>Picardeau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjugative+transfer+between+Escherichia+coli+and+Leptospira+spp.+as+a+new+genetic+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Conjugative transfer between Escherichia coli and Leptospira spp. as a new genetic tool.</a> Appl Environ Microbiol. 74 (1), 319-322 (2008).</li>
<li>Lourdault, K., Matsunaga, J., Haake, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+parallel+sequencing+to+measure+fitness+of+Leptospira+interrogans+transposon+insertion+mutants+during+acute+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">High-throughput parallel sequencing to measure fitness of Leptospira interrogans transposon insertion mutants during acute infection.</a> PLoS Negl Trop Dis. 10 (11), e0005117(2016).</li>
<li>Ellinghausen, H. C., McCullough, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrition+of+Leptospirapomona+and+growth+of+13+other+serotypes%3A+Fractionation+of+oleic+albumin+complex+and+a+medium+of+bovine+albumin+and+polysorbate+80%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Vet+Res%22%5BJournal%5D)">Nutrition of Leptospirapomona and growth of 13 other serotypes: Fractionation of oleic albumin complex and a medium of bovine albumin and polysorbate 80.</a> Am J Vet Res. 26, 45-51 (1965).</li>
<li>Johnson, R. C., Harris, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+pathogenic+and+saprophytic+letospires.+I.+Growth+at+low+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of pathogenic and saprophytic letospires. I. Growth at low temperatures.</a> J Bacteriol. 94 (1), 27-31 (1967).</li>
<li>Demarre, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+family+of+mobilizable+suicide+plasmids+based+on+broad+host+range+R388+plasmid+%28IncW%29+and+RP4+plasmid+%28IncPa%29+conjugative+machineries+and+their+cognate+Escherichia+coli+host+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A new family of mobilizable suicide plasmids based on broad host range R388 plasmid (IncW) and RP4 plasmid (IncPa) conjugative machineries and their cognate Escherichia coli host strains.</a> Res Microbiol. 156 (2), 245-255 (2005).</li>
<li>Vallenet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroScope%3A+a+platform+for+microbial+genome+annotation+and+comparative+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Database+%28Oxford%29%22%5BJournal%5D)">MicroScope: a platform for microbial genome annotation and comparative genomics.</a> Database (Oxford). , bap021(2009).</li>
<li>Goodman, A. L., Wu, M., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+microbial+fitness+determinants+by+insertion+sequencing+using+genome-wide+transposon+mutant+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Identifying microbial fitness determinants by insertion sequencing using genome-wide transposon mutant libraries.</a> Nat. Protocols. 6 (12), 1969-1980 (2011).</li>
<li>Miller, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+J+%22Spirochetes+in+body+fluids+and+tissues+manual+of+investigative+methods%22">Spirochetes in body fluids and tissues manual of investigative methods</a>. , 22-23 (1971).</li>
<li>Ristow, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+OmpA-like+protein+Loa22+is+essential+for+leptospiral+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence.</a> PLoS Pathog. 3 (7), (2007).</li>
<li>Croda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+in+pathogenic+Leptospira+species%3A+disruption+of+the+LigB+gene+does+not+affect+virulence+in+animal+models+of+leptospirosis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis in pathogenic Leptospira species: disruption of the LigB gene does not affect virulence in animal models of leptospirosis.</a> Infect Immun. 76 (12), 5826-5833 (2008).</li>
<li>Haake, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hamster+model+of+leptospirosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Hamster model of leptospirosis.</a> Curr Protoc Microbiol. 12, 2(2006).</li>
<li>Giardine, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galaxy%3A+a+platform+for+interactive+large-scale+genome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Galaxy: a platform for interactive large-scale genome analysis.</a> Genome Res. 15 (10), 1451-1455 (2005).</li>
<li>Goecks, J., Nekrutenko, A., Taylor, J., Galaxy, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galaxy%3A+a+comprehensive+approach+for+supporting+accessible%2C+reproducible%2C+and+transparent+computational+research+in+the+life+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences.</a> Genome Biol. 11 (8), R86(2010).</li>
<li>Blankenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galaxy%3A+a+web-based+genome+analysis+tool+for+experimentalists%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Galaxy: a web-based genome analysis tool for experimentalists.</a> Curr Protoc Mol Biol. (Chapter 19), 11-21 (2010).</li>
<li>Afgan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Galaxy+platform+for+accessible%2C+reproducible+and+collaborative+biomedical+analyses%3A+2016+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update.</a> Nucleic Acids Res. 8 (44), (2016).</li>
<li>McCoy, K. M., Antonio, M. L., van Opijnen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAGenTA%3B+a+Galaxy+implemented+tool+for+complete+Tn-Seq+analysis+and+data+visualization%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MAGenTA; a Galaxy implemented tool for complete Tn-Seq analysis and data visualization.</a> Bioinformatics. , 1367(2017).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biol. 10 (3), R25(2009).</li>
<li>Kamp, H. D., Patimalla-Dipali, B., Lazinski, D. W., Wallace-Gadsden, F., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+fitness+landscapes+of+Vibrio+cholerae+at+important+stages+of+its+life+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Gene fitness landscapes of Vibrio cholerae at important stages of its life cycle.</a> PLoS Pathog. 9 (12), e1003800(2013).</li>
<li>Poggi, D., Oliveira de Giuseppe, P., Picardeau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+resistance+markers+for+genetic+manipulations+of+Leptospira+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antibiotic resistance markers for genetic manipulations of Leptospira spp.</a> Appl Environ Microbiol. 76 (14), 4882-4885 (2010).</li>
<li>van Opijnen, T., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon+insertion+sequencing%3A+a+new+tool+for+systems-level+analysis+of+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms.</a> Nat Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).</li>
<li>Pappas, C. J., Picardeau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+gene+expression+in+Leptospira+spp.+by+Transcription+activator-like+effectors+demonstrates+a+potential+role+for+LigA+and+LigB+in+Leptospira+interrogans+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Control of gene expression in Leptospira spp. by Transcription activator-like effectors demonstrates a potential role for LigA and LigB in Leptospira interrogans virulence.</a> Appl Environ Microbiol. 81 (22), 7888-7892 (2015).</li>
<li>Koskiniemi, S., Sun, S., Berg, O. G., Andersson, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection-driven+gene+loss+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Selection-driven gene loss in bacteria.</a> PLoS Genet. 8 (6), e1002787(2012).</li>
<li>Troy, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Tn-seq+analysis+of+carbohydrate+utilization+and+vertebrate+infectivity+of+Borrelia+burgdorferi%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Global Tn-seq analysis of carbohydrate utilization and vertebrate infectivity of Borrelia burgdorferi.</a> Mol Microbiol. 101 (6), 1003-1023 (2016).</li>
<li>Ramsey, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+genetic+screen+identifies+previously+uncharacterized+Borrelia+burgdorferi+genes+important+for+resistance+against+reactive+oxygen+and+nitrogen+species%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">A high-throughput genetic screen identifies previously uncharacterized Borrelia burgdorferi genes important for resistance against reactive oxygen and nitrogen species.</a> PLoS Negl Trop Dis. 13 (2), e1006225(2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hoewel uit onze proefproject voor hamster uitgedaagd intraperitoneally met 42 L. interrogans mutanten17 resultaten zijn, verwachten we dat grotere zwembaden van mutanten kunnen worden gescreend door Tn-Seq. Omdat de frequentie van transconjugants laag is (100-200 transconjugants/paring), verschillende verparingen zijn noodzakelijk voor het genereren van een voldoende aantal mutanten voor grote Tn-Seq experimenten. Onderhouden van een groot aantal mutanten in vloeibare culturen biedt logis...

Identificatie van virulentiegenen voor sommige bacteriën, zoals Leptospira spp., is moeilijk vanwege het beperkte aantal genetische tools beschikbaar. Een veel gebruikte aanpak is het creëren van een collectie van mutanten door willekeurige transposon mutagenese, gevolgd door de identificatie van de site van de invoegpositie in elke mutant en virulentie testen van individuele transposon mutanten in een dierlijk model. Deze aanpak is tijdrovend, duur, en vereist een groot aantal dieren.
Wanneer willekeurige mutagenese werd voor het eerst ontwikkeld voor het pathogene agens Leptospira interrogans, werden genen die betrokken zijn in virulentie geïdentificeerd door het testen van afzonderlijke mutanten in een dierlijk model1. Mutanten werden geselecteerd op basis van criteria zoals hun potentiële rol in de signalering beweeglijkheid of hun voorspelde buitenmembraan of oppervlakte locatie. Als de meerderheid van de leptospiral genen coderen hypothetische proteïnen van onbekende functie2, selecteren mutanten op basis van deze criteria de mogelijkheid om te ontdekken van nieuwe leptospiral virulentiegenen.
Meer recentelijk, zwembaden van L. interrogans transposon mutanten waren gescreend voor infectiviteit in de hamster en muis modellen3. Elk dier werd aangevochten met een pool van maximaal 10 mutanten. Infectiviteit van een mutant werd gescoord als positief als het werd ontdekt door PCR van culturen verkregen uit bloed en de nieren. PCR testen was moeizaam, omdat het een individuele PCR reactie nodig voor elke mutant in het zwembad. Omdat de frequentie van elke mutant in de culturen was niet gekwantificeerd, was de aanpak bevooroordeeld naar identificatie van zeer verzwakte mutanten.
We beschrijven een transposon (Tn-Seq) techniek, als een strategie om efficiënter scherm voor virulentiegenen te rangschikken. TN-seq bestaat uit het creëren van een bibliotheek van mutanten door transposon mutagenese gevolgd door massale parallelle sequencing4,5,6. Kort, transposon mutanten zijn gebundeld, geënt in dieren, en later teruggevonden uit verschillende organen (uitgang zwembaden). Het DNA van de zwembaden van de uitvoer is geëxtraheerd en verteerd met enzymen van de beperking of geschoren met het ultrasoonapparaat. Twee rondes van PCR gericht op de kruispunten van de transposon invoeging sites worden uitgevoerd. Deze stap kan de toevoeging van de adapters nodig voor de sequencing. De resulterende PCR producten worden geanalyseerd door hoge gegevensdoorvoer sequentiebepaling te identificeren van de site transposon invoeging van elke mutant van het zwembad samen met hun relatieve overvloed, die wordt vergeleken met de oorspronkelijke samenstelling van de pool van mutant.
Het belangrijkste voordeel van deze aanpak is de mogelijkheid om gelijktijdig scherm een groot aantal mutanten met een klein aantal dieren. TN-Seq hoeft niet de voorkennis van de transposon invoeging sites die de kansen verhoogt van het ontdekken van nieuwe Leptospira-specifieke genen die betrokken zijn in virulentie met minder tijd en meer efficiëntie. Omdat leptospiral last in weefsels is relatief hoog in knaagdier modellen vatbaar voor dodelijke infectie (meestal 104 tot 108 bacteriën/g weefsel)7,8,9 zo goed zoals in reservoir hosts 10,11, weefsels kunnen rechtstreeks worden geanalyseerd zonder de behoefte aan cultuur, vermindering van vooroordelen als gevolg van in vitro groei.
In Tn-Seq studies met de meeste bacteriële pathogenen beschreven tot nu toe, de hoge frequentie van dat mutagenese toegestaan infectie met grote zwembaden met mutanten collectief hebben meerdere nauw-spaced transposon invoegingen binnen elk gen4 ,12,13,14. TN-Seq heeft ook ontwikkeld voor een bacterie waarvoor de mutagenese frequentie veel lagere6 is. Met Leptospira, kan een bibliotheek van transposon mutanten worden gegenereerd door de invoering van de transposon op een inzetbare plasmide door vervoeging zoals beschreven door Slamti et al.15. De frequentie van transposon mutagenese van L. interrogans is echter laag. Wanneer de Himar1 transposon werd geïntroduceerd op een conjugative plasmide, werd de frequentie van de transconjugant gemeld dat enige 8,5 x 10-8 per ontvanger cel met de Lai stam van L. interrogans16 en dreigt te worden ook arme met de meeste andere stammen van L. interrogans. Het protocol hier beschreven is in deel op basis van die ontwikkeld voor Borrelia burgdorferi, waarin ook de frequentie van transposon dat mutagenese lage6.
Voor onze pilot experiment met het protocol17voerden we transposon mutagenese met L. interrogans serovar Manilae stam L495 vanwege het succes van andere groepen in het isoleren van transposon insertiemutanten in de stam samen met de lage LD50 (letale dosis) voor virulentie1. We 42 mutanten door Tn-Seq gescreend en verschillende mutant kandidaten defect in virulentie, waaronder twee met invoegingen in een kandidaat-adenylaat cyclase gen geïdentificeerd. Individuele testen van de twee mutanten in hamsters bevestigd dat zij tekort aan virulentie17waren.

<table><tbody><tr><td>Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K4000</td><td></td></tr><tr><td>2,6-diaminopimelic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1377</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4014</td><td></td></tr><tr><td>Axio Lab A1 microscope with a darkfieldcondenser</td><td>Zeiss</td><td>490950-001-000</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy blood and tissue kit</td><td>Qiagen</td><td>69504/69506</td><td></td></tr><tr><td>MinElute PCR Purification</td><td>Qiagen</td><td>28004/28006</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR purification kit</td><td>Qiagen</td><td>28104/28106</td><td></td></tr><tr><td>Model 505 Sonic Dismembrator</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB-505</td><td></td></tr><tr><td>2.5" Cup horn</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB-4625</td><td></td></tr><tr><td>Bead Ruptor 24</td><td>Omni International</td><td>19-010</td><td>Stap 3.1.2.4</td></tr><tr><td>Terminal deoxynucleotidyl transferase</td><td>Promega</td><td>M828C</td><td></td></tr><tr><td>Master mix Phusion</td><td>Thermo Scientific</td><td>F531</td><td>Bereiding van genomische bibliotheken, stap 3.4.</td></tr><tr><td>DreamTaq Master Mix</td><td>Thermo Scientific</td><td>K9011/K9012</td><td>Identificatie van de transposon-invoegplaats, stap 1.2.</td></tr><tr><td>dCTP</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0151</td><td></td></tr><tr><td>ddCTP</td><td>Affymetrix/ USBProducts</td><td>77112</td><td></td></tr><tr><td>T100 Thermal cycler</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 fluorometer</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td>stap 3.6.</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS assay kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851/Q32854</td><td>stap 3.6.</td></tr><tr><td>Qubit assay tubes</td><td>life technologies</td><td>Q32856</td><td>stap 3.6.</td></tr><tr><td>PBS pH 7.2 (1X)</td><td>Gibco</td><td>20012-027 20012-050</td><td></td></tr><tr><td>Disposable scalpel No10</td><td>Feather</td><td>2975#10</td><td></td></tr><tr><td>Plastic K2 EDTA 2 ml tubes</td><td>BD vacutainer</td><td>367841</td><td></td></tr><tr><td>syringe U-100 with 26G x &frac12;&rdquo; needle</td><td>BD vacutainer</td><td>329652</td><td>IP-uitdaging, stap 2.2.1.</td></tr><tr><td>3 mL Luer-Lok tip syringe</td><td>BD vacutainer</td><td>309657</td><td>Hartpunctie, stap 2.4.2.</td></tr><tr><td>25G X 5/8&rdquo; needle</td><td>BD vacutainer</td><td>305901</td><td>Hartpunctie, stap 2.4.2.</td></tr><tr><td>25 mm fritted glass base with stopper</td><td>EMD Millipore</td><td>XX1002502</td><td>Filtratie-eenheidssysteem, stap 1.1.7.</td></tr><tr><td>25 mm aluminium veerklem</td><td>EMD Millipore</td><td>XX1002503</td><td>Filtratie-eenheidssysteem, stap 1.1.7.</td></tr><tr><td>15 ml borosilicaat glas trechter</td><td>EMD Millipore</td><td>XX1002514</td><td>Filtratie-eenheidssysteem, stap 1.1.7.</td></tr><tr><td>125 ml side-arm Erlenmeyer kolf</td><td>EMD Millipore</td><td>XX1002505</td><td>Filtratie-eenheidssysteem, stap 1.1.7.</td></tr><tr><td>Acetaat-cellulose filter VVPP (pore grootte 0.1 mm; diameter 25 mm)</td><td>EMD Millipore</td><td>VVLP02500</td><td></td></tr></tbody></table>

high-throughput parallelle sequencing maatregel fitness van leptospira interrogans transposon invoeging mutanten tijdens golden syrische hamster infectie

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

In dit manuscript beschrijven we een transposon sequencing (Tn-Seq) techniek om te identificeren en kwantificeren van Leptospira interrogans mutanten gewijzigd in fitness tijdens infectie van Golden Syrische hamsters. Willekeurige transposon mutagenese combineert TN-Seq met de kracht van high-throughput sequencing technologie. Dieren worden uitgedaagd met een pool van transposon mutanten (ingang zwembad), gevolgd door het oogsten van bloed en weefsels een paar dagen later te identificeren en kwantificeren van het aantal mutanten in elk orgaan (uitgang zwembaden). De uitvoer zwembaden worden vergeleken met de ingang zwembad te beoordelen van de geschiktheid in vivo van elke mutant. Deze aanpak maakt het mogelijk screening van een groot zwembad van mutanten in een beperkt aantal dieren. Met kleine aanpassingen, kan dit protocol worden uitgevoerd met elke diermodel van leptospirose, reservoir host zoals ratten en acute infectie modellen zoals hamsters, evenals in vitro studies. TN-Seq biedt een krachtige tool om scherm voor mutanten met in vivo en in vitro fitness defecten.

Oprichting van een bibliotheek van transposon mutanten in L. interrogans door vervoeging vereist een filtratie-eenheid, zoals afgebeeld in Figuur 1. We worden verhaald 100-200 transconjugants elke paring.
De site van transposon invoeging is geïdentificeerd in elke mutant door de sequencing van het PCR-product dat is gegenereerd door semi-willekeurige PCR die zich richt op het einde van de t...

Hier beschrijven we een techniek die transposon mutagenese met hoge gegevensdoorvoer sequencing combineert te identificeren en kwantificeren van transposon leptospiral mutanten in weefsels na een uitdaging van hamsters. Dit protocol kan worden gebruikt voor scherm mutanten voor overleving en verspreiding in dieren en kan ook worden toegepast op in vitro studies.

High-throughput parallelle Sequencing maatregel fitness van Leptospira interrogans Transposon invoeging mutanten tijdens Golden Syrische Hamster infectie

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness ...

Het algemene doel van deze transposon-sequentietechniek met hoge doorvoer is om transposon-mutanten te identificeren en kwantificeren met in vivo en in vitro fitnessdefecten, en daarmee Leptospira-genen te identificeren die betrokken zijn bij virulentie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het Leptospira-veld, zoals het identificeren van genen die betrokken zijn bij kolonisatie, verspreiding en overleving van de bacteriën in de gastheer. Het grote voordeel van deze techniek is dat een groot aantal mutanten kan worden gescreend met een beperkt aantal dieren.Hoewel deze methode werd ontworpen om de fitness van Leptospira interrogans-mutanten in het hamstermodel met acute leptospirose te onderzoeken, kan deze ook worden toegepast via chronische infectiemodellen, in vitro-onderzoeken en andere stammen van Leptospira. De procedure zal worden gedemonstreerd door Kritel Lourdault en Karen Evangelista, beiden post-docs uit mijn laboratorium. Eerst, monteer een filtratie-eenheid.Plaats de basis op een 125 milliliter zijarm Erlenmeyer-kolf. Plaats een acetaatcellulosefilter op de basis en klem een trechter op de basis. Verbind de filtratie-eenheid met een v

high-throughput-parallel-sequencing-to-measure-fitness-leptospira

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Enterobacter sp. YSU groeit in glucose minimale zouten medium. Auxotrofen worden gegenereerd door transformatie met een transposome die willekeurig plaatst zichzelf in het gastheergenoom. Mutanten worden gevonden door replica plating van complexe medium tot minimaal medium. Onderbroken genen worden geïdentificeerd door gen-rescue en sequencing.

Generatie Enterobacter Sp. YSU auxotrofen behulp Transposon Mutagenesis

Coxiella burnetii is een obligaat intracellulaire Gram-negatieve bacterie die verantwoordelijk is voor de zoönose Q-koorts. Hier beschrijven we werkwijzen voor het genereren van Coxiella fluorescent transposon mutanten en de geautomatiseerde identificatie en analyse van de verkregen internalisatie, replicatie en cytotoxische fenotypes.

Generatie en Multi-fenotypische High-inhoud Screening van<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutants

Hier is een eenvoudige methode voor het maken van een bibliotheek van high-density transposon invoeging in Escherichia coli of Shigella flexneri met behulp van bacteriële Woordherkomst en-opbouw. Dit protocol kan de oprichting van een verzameling van honderden duizenden van unieke mutanten in bacteriën door de willekeurige genomic invoeging van een transposon.

Oprichting van een dichte Transposon invoeging bibliotheek met behulp van bacteriële Woordherkomst en-opbouw in de Enterobacterial stammen zoals Escherichia Coli of Shigella flexneri

Pronuclear (PN) injectie van de geclusterde interspaced regelmatig korte palindromische herhaalt (CRISPR) en CRISPR-geassocieerde proteïne-9 nuclease (CRISPR/Cas9)-systeem is een zeer efficiënte methode voor de productie van genetisch gemanipuleerde gouden Syrische hamsters. Hierin beschrijven we het gedetailleerde PN injectie protocol voor de productie van gene knockout hamsters met het systeem CRISPR/Cas9.

Productie van genetisch gemanipuleerde gouden Syrische Hamsters door Pronuclear injectie van het Complex van de CRISPR/Cas9

Deze moleculair gebaseerde aanpak voor het bepalen van bacteriële fitness vergemakkelijkt nauwkeurige en nauwkeurige detectie van micro-organismen met behulp van unieke genomische DNA-barcodes die worden gekwantificeerd via digitale PCR. Het protocol beschrijft de berekening van de concurrerende index voor salmonella stammen; de technologie is echter gemakkelijk aan te passen aan protocollen die absolute kwantificering van enig genetisch-smeedbaar organisme vereisen.

Digitale PCR-gebaseerde competitieve index voor high-throughput analyse van de geschiktheid in salmonella

Wederzijdse hemizygosity via sequencing (RH-SEQ) is een krachtige nieuwe methode om de genetische basis van een eigenschap verschil tussen soorten in kaart te worden. Pools van hemizygotes worden gegenereerd door transposon mutagenese en hun fitheid wordt bijgehouden door concurrerende groei met behulp van High-through sequencing. Analyse van de resulterende gegevens wijst genen aan die aan de eigenschap ten grondslag liggen.

Genetische mapping van Thermotolerance verschillen tussen soorten Saccharomyces gist via genoom-brede wederzijdse Hemizygosity analyse

We beschrijven een methode om verzadigende transposon mutantbibliotheken te genereren in gramnegatieve bacteriën en de daaropvolgende voorbereiding van DNA-ampliconbibliotheken voor hoge doorvoersequenties. Als voorbeeld richten we ons op de ESKAPE-ziekteverwekker, Acinetobacter baumannii,maar dit protocol is vatbaar voor een breed scala aan gramnegatieve organismen.

Transposon Insertion Libraries genereren in gram-negatieve bacteriën voor high-throughput sequencing

Hier wordt de toepassing van CRISPR-interferentie (CRISPRi) voor specifieke genuitschakeling bij Leptospira-soorten beschreven. Leptospiracellen worden getransformeerd door vervoeging met plasmiden die dCas9 (katalytisch "dode" Cas9) en een single-guide RNA (sgRNA) uitdrukken, verantwoordelijk voor base pairing naar het gewenste genomische doel. Methoden om genuitschakeling te valideren worden gepresenteerd.

Toepassing van CRISPR-interferentie (CRISPRi) voor genuitschakeling bij pathogene soorten leptospira

Dit is een aangepaste methode voor het identificeren van kandidaat-insectenkolonisatiefactoren in een Burkholderia gunstige symbiont. De kevergastheer is geïnfecteerd met een willekeurige mutantenbibliotheek gegenereerd via transposonmutagenese en de complexiteit van de bibliotheek na kolonisatie wordt vergeleken met een controle die in vitrois gekweekt.

Transposon-insertion Sequencing als een hulpmiddel om bacteriële kolonisatiefactoren in een Burkholderia gladiolen symbiont van Lagria villosa Kevers op te helderen

Hier presenteren we een longitudinale evaluatie van goudhamsters die intraperitoneaal (IP) of via intragingivaal (IG) zijn geïnfecteerd met L. infantum-Luc door middel van bioluminescente beeldvorming en door PCR. Hamsters werden 1 dag na infectie (1 dpi), 1 week na infectie (8 dpi) en 3 weken na infectie (22 dpi) geëvalueerd en geëuthanaseerd op de 50edpi en 8 maanden na infectie.

In vivo Beeldvorming van met Leishmania infantum geïnfecteerde hamsters door gingiva-inoculatie van axenische amastigoten die luciferase tot expressie brengen

Dit protocol levert een modulaire BSL-2 workflow die kristal-violet biomassa-assays, time-lapse fase-contrast kinetiek, confocale 3D/matrix mapping, SEM-ultrastructuur en een in vivo hamsterinfectiemodule combineert om de functionele rol van Leptospira biofilm te cultiveren, kwantificeren, karakteriseren en onderzoeken, waardoor gestandaardiseerde evaluatie van mutanten en anti-biofilminterventies in laboratoria mogelijk is.

Een modulaire workflow voor kwantitatieve, structurele en functionele analyse van leptospira-biofilms

Leer een high-throughput transposon sequencing methode om fitness defecten van Leptospira interrogans mutanten te identificeren in hamsters. Deze techniek minimaliseert diergebruik en versnelt onderzoek naar virulentiegenen.

High-throughput parallelle Sequencing maatregel fitness van Leptospira interrogans Transposon invoeging mutanten tijdens Golden Syrische Hamster infectie (Video) | JoVE Journal

High-throughput parallelle Sequencing maatregel fitness van Leptospira interrogans Transposon invoeging mutanten tijdens Golden Syrische Hamster infectie

Meer video's verkennen