Evaluatie van de In Vitro DNA schade, met behulp van komeet Assay
October 11th, 2017
De bepaling van de komeet is een efficiënte methode om op te sporen DNA schade met inbegrip van single- en double-stranded DNA breekt. We beschrijven alkalisch en neutraal komeet testen voor het meten van DNA-beschadiging in kankercellen het therapeutische effect van chemotherapie te beoordelen.
Het algemene doel van dit experiment is om de effectiviteit van genotoxische middelen in kankercellen te onderzoeken met behulp van een enkelcellig elektroforese-assay, ook wel de comet-assay genoemd. Deze procedure is een manier om de vier genetische toxicologische studies te meten. En het is toepasbaar op verschillende evaluaties, zoals eerdere selectie van geneesmiddelkandidaten en fundamenteel onderzoek naar DNA-schade en reparatie.
Deze techniek biedt een directe manier om de DNA-schade kwantitatief te evalueren. En het is efficiënt, gemakkelijk uit te voeren en relatief goedkoop. Bereid de agarose voor het bedekken van de dia's door een procent agarose in een magnetron te smelten gedurende twee tot drie minuten of totdat de agarose volledig gesmolten is.
Dompel een glazen microscoopglaasje in de agarose en gebruik een pluisvrije doek om één zijde van het glas te vegen. Leg de dia op een vlakke ondergrond om te laten drogen. Er moet een transparante agarosefilm gevormd worden na het drogen.
Plaats de beklede dia's in 37 graden Celsius voor gebruik. Het therapeutische effect van chemotherapie wordt geëvalueerd in U251 glioomcellen gekweekt in DMEM/Ham F-12 medium aangevuld met 10% FBS, 100 eenheden per milliliter penicilline en 10 microgram per milliliter streptomycine. Verwerk de cellen met behulp van één milliliter trypsine gedurende drie minuten en neutraliseer vervolgens het trypsine met behulp van DMEM/Ham F-12 medium met FBS.
Verzamel de cellen in een 15 milliliter buis. En centrifugeer gedurende vier minuten bij 300 keer G. Zuig het medium af.
En suspendeer de cellen bij twee keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter in 1x PBS. Cellen moeten onmiddellijk worden voorbereid voordat de assay begint. En ze moeten in het donker worden behandeld.
Alles in dim licht om schade te voorkomen. Combineer de cellensuspensie met een procent gesmolten, lage smeltpunt agarose in een volumeverhouding van een tot 10. Meng voorzichtig door middel van pipetteren op en neer.
En pipet onmiddellijk 30 microliter op een dia. Gebruik de zijde van de pipettentip om het agarosemengsel te verspreiden om de vorming van een dunne laag te garanderen. Plaats de dia's plat op vier graden Celsius, in het donker, gedurende 10 minuten.
Dompel de dia's in een oplossing van vier graden Celsius lysis, in het donker gedurende één uur tot overnacht. Voor de alkalische comet-assay, verwijder voorzichtig de dia's uit de lysisoplossing, giet overtollig vocht af en dompel de dia's voorzichtig in AES, in het donker op vier graden Celsius gedurende één uur om DNA-ontwinding mogelijk te maken. Voeg voorgekoelde AES toe in de elektroforese dialade.
Ga niet meer dan 0,5 centimeter boven de dia's uit. Plaats de dia's erin en dek af met een dop. Stel de voedingsspanning in op één volt per centimeter en laat deze gedurende 30 minuten op vier graden Celsius lopen.
Wanneer de elektroforese voltooid is, giet overtollig AES van de dia's. Dompel de dia's twee keer voorzichtig gedurende vijf minuten in gedestilleerd water op kamertemperatuur. Daarna dompel de dia's voorzichtig in 70% ethanol op kamertemperatuur gedurende vijf minuten.
Voor de neutrale comet-assay, verwijder voorzichtig de dia's uit de lysisoplossing, giet overtollig vocht af en dompel voorzichtig gedurende 30 minuten in NES in het donker, op vier graden Celsius. Voeg voorgekoelde NES toe in de elektroforese dialade, niet meer dan 0,5 centimeter boven de dia's uit.
Plaats de dia's erin en dek af met een dop. Stel de voedingsspanning in op één volt per centimeter en laat deze gedurende 45 minuten op vier graden Celsius lopen. Giet overtollig buffer van de dia's. Dompel de dia's voorzichtig gedurende 30 minuten in DNA-precipitatieoplossing op kamertemperatuur.
Na 30 minuten dompel de dia's voorzichtig gedurende 30 minuten in 70% ethanol op kamertemperatuur. Begin deze procedure door de dia's in het donker te drogen bij 37 graden Celsius gedurende 10-15 minuten. Plaats vervolgens 50-100 microliter groen fluorescerend nucleïnezuurkleuringsoplossing op het gedroogd agarose van elke dia en kleed gedurende 15 minuten op kamertemperatuur in het donker.
Spoel de dia's kort in gedestilleerd water en droog volledig bij 37 graden Celsius in het donker. Voer onmiddellijk na het kleuren van de comet-dia's beeldverwerving en -analyse uit. Plaats een dia onder een fluorescentiemicroscoop met een diahouder.
Selecteer de 10X objectieflens en zorg ervoor dat de agarosegel naar de objectieflens gericht is. Vanuit elk gekleurde comet-dia worden willekeurig beelden vastgelegd. Vermijd de randen en de gebieden rond eventuele luchtbellen.
Zorg ervoor dat elke cometstaart horizontaal verdeeld is. De cometkoppen moeten van links afkomstig zijn en de staart van rechts. Sla elk beeld op in een binair formaat met heldere DNA-kleuring en een donkere achtergrond.
Voor beeldanalyse, laad eerst alle beelden naar de comet-assay software, door gebruik te maken van de Selecteer bestanden om te analyseren knop, die zich aan de linkerkant van de werkbalk bevindt. Er zou een beeldweergavevenster moeten verschijnen. Teken een meetframe op het scherm en pas de grootte aan volgens de comet van de cel.
Klik op aanpassen om de drempelwaarde van het hoofd, de comet en de staart in te stellen, volgens het beeld. Klik vervolgens op Start met meten. Selecteer een cel met behulp van het frame en activeer de meting door op de Comet meten knop te klikken.
Er zal een intensiteitsbeeld verschijnen op het profielenvenster, met de geselecteerde meetparameters. Sla de resultaten op door op de Resultaten opslaan knop te klikken. Analyseer ten minste 50 cellen per behandeling.
Resultaten van de alkalische en neutrale comet-assays tonen aan dat de cometstaarten van doxorubicine-behandelde UT51-cellen langer waren en een hogere DNA-intensiteit hadden, wat wijst op een substantiële accumulatie van gefragmenteerd DNA. Kwantitatieve analyse voor de alkali
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
De komeettest is een waardevolle techniek voor het detecteren van DNA-schade, inclusief enkel- en dubbelstrengse breuken. Dit artikel beschrijft zowel alkalische als neutrale komeettests om DNA-schade in kankercellen te beoordelen, met name in de context van chemotherapiebehandeling.
Belangrijke studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Genotoxiciteit
- Kankeronderzoek
- Beoordeling van DNA-schade
Achtergrond
- De komeettest maakt de evaluatie van DNA-schade op enkelcellige niveau mogelijk.
- Het is toepasbaar in verschillende contexten, inclusief de selectie van kandidaat-geneesmiddelen.
- Deze methode is efficiënt, eenvoudig en kosteneffectief.
- Het biedt kwantitatieve metingen van DNA-schade.
Doel van de studie
- Om de effectiviteit van genotoxische agentia in kankercellen te onderzoeken.
- Om de therapeutische effecten van chemotherapie op DNA-integriteit te evalueren.
- Om het begrip van DNA-schade en reparatiemechanismen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Bereiding van agarose voor het coaten van de dia.
- Uitvoering van alkalische en neutrale komeettests.
- Kwantitatieve evaluatie van DNA-schade.
- Toepassing van de komeettest in kankercelstudies.
Belangrijkste resultaten
- De komeettest detecteert effectief DNA-schade in kankercellen.
- Zowel alkalische als neutrale tests bieden betrouwbare metingen.
- De techniek toont de impact van chemotherapie op DNA-integriteit.
- Resultaten ondersteunen het gebruik ervan bij de evaluatie van kandidaat-geneesmiddelen.
Conclusies
- De komeettest is een robuuste methode voor het beoordelen van DNA-schade.
- Het is nuttig voor onderzoek in kankertherapie.
- Verdere studies kunnen de toepassingen ervan in genotoxiciteitstests uitbreiden.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of DNA damage is critical for evaluating genotoxic agents during early oncology drug discovery and preclinical development. The comet assay enables direct, single-cell measurement of DNA strand breaks, supporting mechanistic de-risking and predictive confidence in candidate selection. Its reproducibility and efficiency make it a valuable tool for portfolio triage and translational research alignment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of genotoxic mechanisms in candidate compounds.
- Supports functional target validation by quantifying DNA damage response.
- Facilitates mechanistic de-risking and prioritization of oncology assets.
Screening & Assay Development
- Provides a validated, quantitative readout for DNA damage in cell-based assays.
- Enables standardization and reproducibility across compound screening campaigns.
- Supports scalable evaluation of genotoxicity for lead optimization workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical DNA damage endpoints with translational biomarker strategies.
- Enables continuity from in vitro discovery to in vivo validation of genotoxic effects.
- Supports risk-adjusted advancement decisions for combination therapies.
Pipeline & Workflow Integration
The comet assay integrates into the discovery-to-preclinical continuum, providing actionable DNA damage data for early-stage oncology programs and supporting lead identification and mechanistic studies.
- Discovery Biology: Quantifies DNA strand breaks to clarify genotoxic mechanisms and validate therapeutic hypotheses.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound comparison and assay standardization.
- Analytics: Enables statistical analysis of DNA damage intensity and tail length across treatment groups.
- Translational Research: Bridges in vitro DNA damage findings with preclinical biomarker development.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly applicable platform for genotoxicity assessment across diverse cell models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in genotoxicity studies.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable DNA damage quantification.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency in oncology portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of drug candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, electrophoresis, and fluorescence imaging.
- Needs access to fluorescence microscopy and image analysis software.
- Demands cross-team standardization for assay reproducibility and data comparability.
- Adaptable to various eukaryotic cell types and experimental conditions.
- Practical limitations include handling hazardous reagents and ensuring consistent sample preparation.
