Name: Evaluatie van de In Vitro DNA schade, met behulp van komeet Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Leer de komeet-assay om DNA-schade in kankercellen te meten met alkalische en neutrale methoden. Deze efficiënte techniek helpt onderzoekers bij het evalueren van genotoxische agentia en chemotherapeutische effecten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd gesteund door de intramurale Research Program van de NIH, NCI, en CCR. Alle auteurs ontvangen intramurale onderzoeksbeurs NIH, NCI, en CCR.

1. voorbereiden reagentia <ol><li>1 x PBS <ol><li>100 mL 10 x PBS met 900 mL dH 2 O Verdun en breng de pH op 7.4 met behulp van een pH-meter. Bewaren bij kamertemperatuur.</li>
	</ol></li> <li>Lysis oplossing (LS) <ol><li>bereiden 2.5 M NaCl, 100 mM Dinatrium-EDTA, 10 mM Tris base en 200 mM NaOH in 900 mL dH 2 O; het duurt gewoonlijk ongeveer 20 min te laat het mengsel volledig los. Breng de pH op 10 met behulp van een pH-meter. Voeg 1% sodium lauryl dat en 1% Triton X-100, en het uiteindelijke volume tot 1000 mL. Cool tot 4 ° C gedurende ten minste 30 minuten vóór gebruik.</li>
	</ol></li> <li>De Elektroforese van de alkaline oplossing (AES), pH &#62; 13 <ol><li>200 mM NaOH en 1 mM Dinatrium EDTA in 800 mL dH 2 O. aanpassen de pH te bereiden en ervoor te zorgen dat er pH &#62; 13. Het uiteindelijke volume tot 1000 mL. Maak vóór gebruik vers en koel hem af tot 4 ° C gedurende ten minste 30 minuten vóór gebruik.</li>
	</ol></li> <li>Neutraal elektroforese sollution (NES) <ol><li>bereiden 1.000 mL neutrale elektroforese buffer door het mengen van 100 mM Tris base en 300 mM Natriumacetaat naar 1000 mL dH 2 O. Adjust pH 9.0 met ijsazijn. Cool tot 4 ° C gedurende ten minste 30 minuten vóór gebruik.</li>
	</ol></li> <li>DNA neerslag oplossing (DPS) <ol><li>voorbereiding van 10 mL 7,5 M ammonium acetaat voorraad. Meng voor 50 mL DNA neerslag oplossing, 6,7 mL 7,5 M ammoniumacetaat met 43,3 mL 95% ethanol. Bewaren bij kamertemperatuur.</li>
	</ol></li> <li>Staining oplossing <ol><li>Voeg 1 µL 10.000 x groen fluorescent nucleïnezuur vlek (bijvoorbeeld, SYBR groen) in 30 mL Tris-EDTA-buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM Dinatrium-EDTA, pH 7.4) en winkel bij 4 ° C. Protect van licht.</li>
	</ol></li> <li>1% lage smelten agarose <ol><li>smelten van 1% laag punt agarose (1 g in 100 mL dH 2 O) in de magnetron te smelten. Swirl de agarose elke 15-20 s om ervoor te zorgen dat de agarose volledig gesmolten is. Plaats de agarose in het waterbad 37 ° C gedurende ten minste 20 minuten vóór gebruik.</li>
	</ol></li> <li>Vooraf warm Pipetteer tips <ol><li>afgesneden van de smalle uiteinden van P200 Pipetteer tips door 3 mm en warm bij 37 ° C vóór pipetteren agarose.</li>
	</ol></li></ol> 2. Bereiden Comet dia's <ol><li>Slide coating <ol><li>Melt 1% agarose (1 g in 100 mL dH 2 O) in de magnetron gedurende 2-3 minuten of totdat de agarose volledig gesmolten is. Dompel de dia's van glas, Microscoop in de agarose en één zijde van de dia met behulp van een pluisvrije doekje vegen.</li>
		<li>Leggen de dia's op een vlakke ondergrond om te drogen of warmte bij 50 ° C voor sneller drogen; een transparante agarose film moet worden gevormd na het drogen. Plaats de gecoate dia's in 37 ° C vóór gebruik.</li>
	</ol></li> <li>Voorbereiding van eencellige schorsingen <ol><li>cultuur en behandelen de glioma cel <ol><li>cultuur van de cellen van de U251 MG in DMEM-Ham F-12 medium aangevuld met 10% FBS, 100 U/mL penicilline en 10 µg Fe/mL streptomycine op 37 & # 176; C met 5% CO 2.</li>
			<li>Verteren de cellen met behulp van 1 mL trypsine gedurende 3 minuten, en neutraliseren met behulp van DMEM-Ham F-12 medium met FBS trypsine. Verzamelen in de tube van 15 mL, draaien op 300 x g voor 4 min, gecombineerd het medium en schorten cellen bij 2 x 10, 5 cellen/mL in 1 x PBS. 
			Opmerking: Het monster van de cel onmiddellijk voordat de bepaling moet worden voorbereid en alle monsters moeten worden behandeld in de omgeving van een donker of lichter gekleurd weergegeven om te voorkomen dat DNA-beschadiging van licht.</li>
			<li>De celsuspensie combineren met 1% agarose van de gesmolten lage smeltpunt (bij 37 ° C) bij een verhouding 1:10 (v/v), meng zachtjes op en neer waarbij en onmiddellijk Pipetteer 30 µL op een dia. Gebruik de zijkant van de het uiteinde van de pipet te verspreiden het mengsel agarose/cel om ervoor te zorgen de vorming van een laagje.</li>
			<li>Plaatst de dia plat bij 4 ° C in het donker voor 10 min. steeds meer gelerend aan 30 min verbetert de hechting van monsters in omgevingen met hoge luchtvochtigheid.</li>
			<li>Onderdompelen van de dia in 4 ° C LS in het donker voor 1 h naar girale.</li>
		</ol></li></ol></li></ol> 3. Enkele cel elektroforese <ol><li>Ga verder naar alkalisch (stap 3.2) of neutraal (stap 3.3) komeet assay</li> <li>voor alkalische komeet assay <ol><li>zachtjes dia's te verwijderen van de LS, afvoer van overtollige buffer en zachtjes onderdompelen in AES gedurende 1 uur bij 4 ° C om DNA tot rust te komen. Houd de dia's in het donker.</li>
		<li>De vooraf gekoeld AES toevoegen in de lade met het dia elektroforese overschrijd niet 0,5 cm boven de dia's (dit hangt af van de grootte van de elektroforese eenheden), plaatst u de dia's binnen en bedek met een cap. Het netspanningsvoltage instelt op 1 V/cm (de lengte tussen de elektroden) en u gedurende 30 minuten bij 4 ° C.</li>
		<li>Afvoer overtollige elektroforese oplossing van dia. Voorzichtig Dompel dia's tweemaal in dH 2 O gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Onderdompelen zachtjes dia's in 70% ethanol gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Ga verder met stap 4.</li>
	</ol></li> <li>Voor neutrale komeet assay <ol><li>zachtjes het verwijderen van de dia's uit de LS, afvoer van overtollige buffer en zachtjes onderdompelen in NES gedurende 30 minuten bij 4 ° C. Houd de dia in het donker.</li>
		<li>Toevoegen vooraf gekoeld neutrale elektroforese buffer in de lade met het dia elektroforese overschrijd niet 0,5 cm boven dia's (dit hangt af van de grootte van de elektroforese eenheden), plaatst u de dia's binnen en bedek met een cap. Het netspanningsvoltage instelt op 1 V/cm (de lengte tussen de elektroden) en u voor 45 min bij 4 ° C.</li>
		<li>Afvoer overtollige buffer van de dia's. Voorzichtig Dompel onder dia's in DPS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Voorzichtig Dompel de dia's in 70% ethanol gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Ga verder met stap 4.</li>
	</ol></li></ol> 4. Vlekken van komeet dia's <ol><li>droge dia's bij 37 ° C gedurende 10-15 min. in het donker.</li>
	<li>Plaats 50-100 µL groen fluorescent nucleïnezuur kleurstofoplossing op elk gedroogde agarose en vlek gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker.</li>
	<li>Spoel van de dia's kort in dH 2 O en droog volledig bij 37 ° C in het donker. Ga naar image aquisition en analyse.</li>
</ol> 5. Verwerving en analyse van het beeld Opmerking: de visualisatie en de kwantificering van DNA-einden zijn gebaseerd op epifluorescence microscopie en de komeet assay software (Zie Tabel van materialen) 12 .
<ol><li>De dia's op de microscoop met de houder van een dia plaatsen. Zorg ervoor dat de agarose gel is kijkend naar het objectief. Willekeurig opnamen uit de gekleurde komeet dia's met behulp van een fluorescentie Microscoop met een objectief van 10 x. De randen en de gebieden rond alle luchtbellen voorkomen.</li>
	<li>Zorg ervoor dat elke staart van de komeet is horizontaal verdeeld. Komeet hoofden zouden afkomstig moeten zijn uit de linker- en de staart vanaf de rechterkant.</li>
	<li>Elke afbeelding opslaan in een binaire TIF-indeling met heldere vlek van DNA en donkere achtergrond. Afbeeldingen voor het gebruik van de software laden de &#34; Selecteer bestanden om te analyseren &#34; knop, die aan de linkerkant van de werkbalk ligt. Het venster van de weergave van een afbeelding moet worden weergegeven ( Figuur 1).</li>
	<li>Een frame van de meting op het scherm tekent en de omvang ervan overeenkomstig de komeet van de cel aan te passen. Klik op de &#34; aanpassen &#34; knop voor het instellen van de drempel van het hoofd, comet en staart volgens de afbeelding en klik vervolgens op de &#34; Start van de metingen &#34; knop ( Figuur 1).</li>
	<li>Selecteer een cel met behulp van het frame en de meting activeren door te klikken met de muis op de &#34; Assay de komeet &#34; knop; een intensiteit beeld verschijnt op het &#34; profielen &#34; venster met de parameters van de geselecteerde meting. De resultaten kunnen worden opgeslagen door te klikken op de &#34; resultaat opslaan &#34; knop ( Figuur 1). 
	Opmerking: De software berekent de parameters met inbegrip van de lengte van de staart van de komeet, het percentage van de staart DNA, het moment van de staart (TM) en het moment staart Olive (OTM). De staart momenten door de formules worden berekend als volgt: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56450/56450eq1.jpg" /> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56450/56450eq2.jpg" /></li> <li>analyseren van ten minste 50 cellen per behandeling.</li>
</ol>

<ol><li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrophoretic+study+of+radiation-induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 123 (1), 291-298 (1984).</li>
<li>Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.</a> Exp Cell Res. 175 (1), 184-191 (1988).</li>
<li>Tice, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+gel%2Fcomet+assay%3A+guidelines+for+in+vitro+and+in+vivo+genetic+toxicology+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Mol+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Single cell gel/comet assay: guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing.</a> Environ Mol Mutagen. 35 (3), 206-221 (2000).</li>
<li>Shah, A. J., Lakkad, B. C., Rao, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotoxicity+in+lead+treated+human+lymphocytes+evaluated+by+micronucleus+and+comet+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Genotoxicity in lead treated human lymphocytes evaluated by micronucleus and comet assays.</a> Indian J Exp Biol. 54 (8), 502-508 (2016).</li>
<li>Azqueta, A., Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essential+comet+assay%3A+a+comprehensive+guide+to+measuring+DNA+damage+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Toxicol%22%5BJournal%5D)">The essential comet assay: a comprehensive guide to measuring DNA damage and repair.</a> Arch Toxicol. 87 (6), 949-968 (2013).</li>
<li>Goldstein, M., Kastan, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+damage+response%3A+implications+for+tumor+responses+to+radiation+and+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">The DNA damage response: implications for tumor responses to radiation and chemotherapy.</a> Annu Rev Med. 66, 129-143 (2015).</li>
<li>Gavande, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+repair+targeted+therapy%3A+The+past+or+future+of+cancer+treatment%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">DNA repair targeted therapy: The past or future of cancer treatment?</a> Pharmacol Ther. 160, 65-83 (2016).</li>
<li>Torgovnick, A., Schumacher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+repair+mechanisms+in+cancer+development+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">DNA repair mechanisms in cancer development and therapy.</a> Front Genet. 6, 157(2015).</li>
<li>Weston, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PARP+inhibitor+olaparib+induces+significant+killing+of+ATM-deficient+lymphoid+tumor+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The PARP inhibitor olaparib induces significant killing of ATM-deficient lymphoid tumor cells in vitro and in vivo.</a> Blood. 116 (22), 4578-4587 (2010).</li>
<li>Brown, J. S., O'Carrigan, B., Jackson, S. P., Yap, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+DNA+Repair+in+Cancer%3A+Beyond+PARP+Inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Targeting DNA Repair in Cancer: Beyond PARP Inhibitors.</a> Cancer Discov. 7 (1), 20-37 (2017).</li>
<li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemosensitivity+of+IDH1-Mutated+Gliomas+Due+to+an+Impairment+in+PARP1-Mediated+DNA+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Chemosensitivity of IDH1-Mutated Gliomas Due to an Impairment in PARP1-Mediated DNA Repair.</a> Cancer Res. 77 (7), 1709-1718 (2017).</li>
<li>Konca, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cross-platform+public+domain+PC+image-analysis+program+for+the+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">A cross-platform public domain PC image-analysis program for the comet assay.</a> Mutat Res. 534 (1-2), 15-20 (2003).</li>
<li>Valverde, M., Rojas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+and+occupational+biomonitoring+using+the+Comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Environmental and occupational biomonitoring using the Comet assay.</a> Mutat Res. 681 (1), 93-109 (2009).</li>
<li>Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay+for+DNA+damage+and+repair%3A+principles%2C+applications%2C+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations.</a> Mol Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).</li>
<li>Karbaschi, M., Cooke, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+method+for+the+high-throughput+processing+of+slides+for+the+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Novel method for the high-throughput processing of slides for the comet assay.</a> Sci Rep. 4, 7200(2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De bepaling van de komeet is een doeltreffend instrument voor het meten van enkele en dubbele streng DNA-einden op cellulair niveau. De bepaling is algemeen toegepast als een "gouden standaard" in studies met betrekking tot genotoxiciteit en biomonitoring13, variërend van basis laesies, DNA crosslinks Geneesmiddelenontwikkeling en alkali-gevoelige plaatsen. In de huidige studie toonden we twee verschillende stapsgewijze protocollen voor alkalisch en neutraal komeet testen, respectievelijk. Combina...

De komeet assay werd in 1984 voor het eerst ontwikkeld door Ostling en Johanson door aan te tonen dat de migratie van DNA fragmenten van kernen onder een neutrale voorwaarde1. De techniek werd later ontwikkeld door Singh et al., waaruit blijkt dat een alkalische toestand aanzienlijk verhoogd de specificiteit en de reproduceerbaarheid van de test2. Sindsdien, de neutrale komeet bepaling wordt meestal gebruikt om op te sporen double-stranded DNA breekt, terwijl de alkalische komeet assay gevoeliger voor kleinere hoeveelheden DNA schade is, met inbegrip van enkele en dubbele streng DNA, alkali-labiele sites, DNA-DNA breekt of DNA-eiwit dwarsbinding en DNA single-strand einden gekoppeld aan onvolledige excisie repareren sites3,4. Beide testen visualisatie van gefragmenteerde DNA, verlenen en een eenvoudige manier om te kwantitatief DNA-schade te evalueren. De komeet bepaling wordt beschouwd als een gevoelige methode voor in vitro en in vivo genetische toxicologische studies en is van toepassing op de verschillende onderzoekgebieden, zoals vroege drug-kandidaat selectie, milieubewaking, menselijke biomonitoring, en fundamenteel onderzoek op DNA-beschadiging en repareren van5.
Het principe van de test is dat onder een elektrisch veld, gefragmenteerde DNA migreert uit het nucleoïde lichaam (ook bekend als de "komeet-head") en vormt een vlek van DNA in de agarose gel (ook bekend als de "komeet-staart"). Met de nucleotide kleuring, kan de omvang van de schade van DNA door het analyseren van "kometen" gevormd door deze eencellige elektroforese worden gekwantificeerd. Berekening van het moment van de staart kan verder helpen aan het vergelijken van DNA-beschadiging onder verschillende experimentele groepen. Vergeleken met traditionele methoden van opsporing van DNA schade, is de bepaling van de komeet directe, gevoelige, goedkope en relatief eenvoudig.
Radiotherapie en chemokuren zijn gemeenschappelijke strategieën voor de behandeling van kanker door het genereren van enkele streng en dubbele streng DNA breekt in chromosomen6. De recente vooruitgang in DNA-reparatie-remmers laat een meer effectieve genotoxische werking door combinatie chemotherapie, en daarom, vermindert potentieel systemische bijwerkingen zoals bloedarmoede, infectie en het beenmerg onderdrukken7, 8. in deze studie, toonden we het onderzoek van een poly (ADP-ribose) polymerase (PARP)-remmer, olaparib (Ola)9. PARP is een overvloedige nucleaire eiwit en is verantwoordelijk voor DNA base excision repair door de vorming van een poly (ADP-ribose) polymeer10. Temozolomide (TMZ) is een oraal beschikbaar alkylerend agent en is wijd verbeid gebruikt voor glioma patiënten behandeling. Met behulp van de bepaling van de komeet te kwantificeren van DNA-beschadiging, we laten zien dat de DNA-beschadiging in glioma cellen, hetgeen olaparib/temozolomide combinatietherapie is een effectieve strategie suggereert voor de behandeling van glioma, als combineren olaparib met temozolomide diep verbetert vergeleken met temozolomide alleen11.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x PBS(Ca++, Mg++ free)</td><td>TEKnova</td><td>P0196</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>TEKnova</td><td>E0308</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>Sodium lauryl sarcosinate</td><td>Sigma</td><td>L7414</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate</td><td>Sigma</td><td>32318</td><td></td></tr><tr><td>Glacial acetic acid</td><td>Sigma</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium acetate</td><td>Sigma</td><td>A1542</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Low melting point agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16520</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500</td><td></td></tr><tr><td>95% ethanol</td><td>WARNER-GRAHAM</td><td>#64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>GIBICO</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Verbruiksartikelen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glazene weefselplaatjes</td><td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td><td>63422-11</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>KIMberly-Clark</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Microcentrifugebuisjes</td><td>DENVILLE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettips</td><td>SHARP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microgolfoven</td><td>Avanti</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waterbad</td><td>PRECISION</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Horizontale elektroforesekamer</td><td>TREVIGEN</td><td>Cometassay ES II</td><td></td></tr><tr><td>Voeding</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Quincy Lab</td><td>Model 12-140E</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentiemicroscoop</td><td>Zeiss</td><td>LSM700</td><td></td></tr><tr><td>Micropipettor</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

evaluatie van de in vitro dna schade, met behulp van komeet assay

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

DNA-beschadiging is een gemeenschappelijk fenomeen voor elke cel tijdens zijn levensduur, en wordt gedefinieerd als een wijziging van de chemische structuur van genomic DNA. Kankertherapieën, zoals radio- en chemotherapie, introduceren enorme hoeveelheid extra DNA-beschadiging, leidt tot de arrestatie van de celcyclus en apoptosis te beperken van de progressie van kanker. Kwantitatieve beoordeling van DNA-beschadiging tijdens de experimentele kankertherapie is een belangrijke stap ter rechtvaardiging van de effectiviteit van een genotoxische agent. In deze studie, richten we ons op een eencellige elektroforese assay, ook bekend als de komeet assay, die enkele kwantificeren kan en dubbele streng DNA breekt in vitro. De bepaling van de komeet is een DNA schade kwantificering methode die efficiënt en gemakkelijk uit te voeren, en heeft weinig tijd/begroting eisen en hoge reproduceerbaarheid. Hier, wijzen wij op het nut van de komeet assay voor een preklinische studie door de beoordeling van het effect van de genotoxische van olaparib/temozolomide combinatietherapie naar U251 glioma cellen.

Dit protocol beschrijft een stapsgewijze workflow voor de uitvoering van de bepaling van de komeet en data-analyse (Figuur 1). Resultaten van de alkalische en neutrale komeet testen bleek dat de staart van de komeet van Doxorubicine-behandeld U251 cellen (1 µM, 20 h) langer was en had hogere intensiteit van het DNA, suggereren een aanzienlijke accumulatie van gefragmenteerde DNA als gevolg van chemotherapie (Figuur 2).
<p cla...

De bepaling van de komeet is een efficiënte methode om op te sporen DNA schade met inbegrip van single- en double-stranded DNA breekt. We beschrijven alkalisch en neutraal komeet testen voor het meten van DNA-beschadiging in kankercellen het therapeutische effect van chemotherapie te beoordelen.

Evaluatie van de In Vitro DNA schade, met behulp van komeet Assay

DNA damage is a common phenomenon for each cell during its lifespan, and is defined as an alteration of the chemical structure of genomic DNA. Cancer ...

Het algemene doel van dit experiment is om de effectiviteit van genotoxische middelen in kankercellen te onderzoeken met behulp van een enkelcellig elektroforese-assay, ook wel de comet-assay genoemd. Deze procedure is een manier om de vier genetische toxicologische studies te meten. En het is toepasbaar op verschillende evaluaties, zoals eerdere selectie van geneesmiddelkandidaten en fundamenteel onderzoek naar DNA-schade en reparatie.Deze techniek biedt een directe manier om de DNA-schade kwantitatief te evalueren. En het is efficiënt, gemakkelijk uit te voeren en relatief goedkoop. Bereid de agarose voor het bedekken van de dia's door een procent agarose in een magnetron te smelten gedurende twee tot drie minuten of totdat de agarose volledig gesmolten is.Dompel een glazen microscoopglaasje in de agarose en gebruik een pluisvrije doek om één zijde van het glas te vegen. Leg de dia op een vlakke ondergrond om te laten drogen. Er moet een transparante agarosefilm gevormd worden na het drogen.Plaats de beklede dia's in 37 graden Celsius voor gebruik. Het therapeutische effect van chemotherapie wordt geëvalueerd in U251 glioomcellen gekweekt in DMEM/Ham F-12 medium aangevuld met 10%

evaluating-in-vitro-dna-damage-using-comet-assay

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

In this video, we demonstrate an alkaline single-cell electrophoresis assay to quantify both single- and double-strand DNA breaks in doxorubicin-treated cells. Alkaline conditions disrupt the hydrogen bonds between DNA base pairs, resulting in the complete unwinding and separation of DNA strands. This allows differential migration of undamaged and damaged DNA fragments in agarose gel upon electrophoresis, revealing a comet-shaped structure of slowly migrating undamaged DNA forming the circular...

Alkaline Single Cell Gel Electrophoresis: A Sensitive Technique for Quantitative Estimation of DNA Damage in Individual Cancer Cells Following Chemotherapy

The video demonstrates the comet assay for detecting DNA damage following exposure to harmful agents. Under alkaline conditions, the DNA unwinds and denatures, and upon electrophoresis, the undamaged and damaged DNA migrate differently in the agarose gel, forming a comet-shaped structure. The slowly migrating undamaged DNA forms the circular comet head, while the rapidly migrating damaged DNA fragments form the elongated comet tail.

Comet Assay for DNA Damage Detection in Cells

De komeet assay is een efficiënte manier voor het opsporen enkel-en dubbel-breuken, met inbegrip van alkali-labiele sites en DNA-DNA/DNA-protein cross-links op het DNA in alle cellen met inbegrip van hippocampale neuronen. De methode maakt gebruik van de differentiële migratie van DNA in een elektrisch veld als gevolg van verschillen in hoeveelheid DNA schade.

Analyseren DNA schade in hippocampale neuronen Met behulp van de Comet Assay

We beschrijven hier een platform dat comet assay detectie van DNA-schade met ongekende doorvoer toestaat. De inrichting patronen zoogdiercellen in een microarray en maakt parallelle verwerking van 96 monsters. De benadering maakt analyse van basisniveau DNA schade, blootstelling DNA schade en DNA herstel kinetiek.

CometChip: Een High-throughput 96-Well Platform voor het meten van DNA-schade in Microarrayed menselijke cellen

Comet assay meet DNA-breuken, veroorzaakt door verschillende factoren. Als alle elementen (behalve oxidatieve stress) veroorzaakt DNA beschadiging constant worden gehouden, de hoeveelheid DNA schade een goede indirecte parameter van oxidatieve stress. Het doel van dit protocol is het comet assay gebruikt voor indirecte meting van oxidatieve stress.

Comet Assay als een indirecte maat van Systemische oxidatieve stress

De alkalische komeet-assay meet DNA-strengbreuken in eukaryotische cellen. Door een digestiestap met Endonuclease III of humane 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase toe te voegen, kan de assay efficiënt oxidatieve DNA-schade detecteren. We beschrijven methoden voor het gebruik van deze assays om DNA-schade in rattenlever te detecteren.

In vivo Alkaline Comet Assay en Enzyme-gemodificeerde Alkaline Comet Assay voor het meten van DNA-breuken en oxidatieve DNA-schade in Rat Liver

Dit protocol beschrijft verschillende procedures voor het voorbereiden van hoogwaardige bevroren weefselmonsters op het moment van obductie voor gebruik in de komeettest om DNA-schade te beoordelen: 1) gehakt weefsel, 2) geschraapte epitheelcellen uit het maag-darmkanaal en 3) in blokjes gelopen weefsel monsters, die homogenisatie vereisen met behulp van een weefselhakkende apparaat.

Gebruik van bevroren weefsel in de Komeet Assay voor de evaluatie van DNA-schade

De komeettest is een populair middel om DNA-schade op te sporen. Deze studie beschrijft een benadering van het uitvoeren van dia's in representatieve varianten van de komeettest. Deze aanpak verhoogde het aantal monsters aanzienlijk, terwijl de looptijd van de test, het aantal diamanipulaties en het risico op schade aan gels afnam.

Een high-throughput comet assay-benadering voor het beoordelen van cellulaire DNA-schade

Dit protocol beschrijft een effectieve methode voor het kwantificeren van het verschil in DNA-schade veroorzaakt door type I- en type II-remmers in FLT3-mutante cellen door de toepassing van de komeettest.

Komeettest om DNA-schade te kwantificeren in FLT3-cellen die mutant tot expressie brengen van 32D na blootstelling aan type I en type II FLT3-remmers

Dit protocol beschrijft een omgekeerde verticale invasie-bepaling die kan worden gebruikt om het kwantificeren van de mogelijkheden voor migratie en invasie van cellen in een driedimensionale omgeving met behoud van de cel-communicatie. Deze test is geschikt voor zeldzame en/of gevoelige cellen.

Verplaatsen naar boven: Een eenvoudig en flexibel In Vitro driedimensionale invasie Assay Protocol

Leer de komeet-assay om DNA-schade in kankercellen te meten met alkalische en neutrale methoden. Deze efficiënte techniek helpt onderzoekers bij het evalueren van genotoxische agentia en chemotherapeutische effecten.

Evaluatie van de In Vitro DNA schade, met behulp van komeet Assay

Meer video's verkennen