Evaluatie van de In Vitro DNA schade, met behulp van komeet Assay
11 oktober 2017
De bepaling van de komeet is een efficiënte methode om op te sporen DNA schade met inbegrip van single- en double-stranded DNA breekt. We beschrijven alkalisch en neutraal komeet testen voor het meten van DNA-beschadiging in kankercellen het therapeutische effect van chemotherapie te beoordelen.
Het algemene doel van dit experiment is om de effectiviteit van genotoxische middelen in kankercellen te onderzoeken met behulp van een enkelcellig elektroforese-assay, ook wel de comet-assay genoemd. Deze procedure is een manier om de vier genetische toxicologische studies te meten. En het is toepasbaar op verschillende evaluaties, zoals eerdere selectie van geneesmiddelkandidaten en fundamenteel onderzoek naar DNA-schade en reparatie.
Deze techniek biedt een directe manier om de DNA-schade kwantitatief te evalueren. En het is efficiënt, gemakkelijk uit te voeren en relatief goedkoop. Bereid de agarose voor het bedekken van de dia's door een procent agarose in een magnetron te smelten gedurende twee tot drie minuten of totdat de agarose volledig gesmolten is.
Dompel een glazen microscoopglaasje in de agarose en gebruik een pluisvrije doek om één zijde van het glas te vegen. Leg de dia op een vlakke ondergrond om te laten drogen. Er moet een transparante agarosefilm gevormd worden na het drogen.
Plaats de beklede dia's in 37 graden Celsius voor gebruik. Het therapeutische effect van chemotherapie wordt geëvalueerd in U251 glioomcellen gekweekt in DMEM/Ham F-12 medium aangevuld met 10% FBS, 100 eenheden per milliliter penicilline en 10 microgram per milliliter streptomycine. Verwerk de cellen met behulp van één milliliter trypsine gedurende drie minuten en neutraliseer vervolgens het trypsine met behulp van DMEM/Ham F-12 medium met FBS.
Verzamel de cellen in een 15 milliliter buis. En centrifugeer gedurende vier minuten bij 300 keer G. Zuig het medium af.
En suspendeer de cellen bij twee keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter in 1x PBS. Cellen moeten onmiddellijk worden voorbereid voordat de assay begint. En ze moeten in het donker worden behandeld.
Alles in dim licht om schade te voorkomen. Combineer de cellensuspensie met een procent gesmolten, lage smeltpunt agarose in een volumeverhouding van een tot 10. Meng voorzichtig door middel van pipetteren op en neer.
En pipet onmiddellijk 30 microliter op een dia. Gebruik de zijde van de pipettentip om het agarosemengsel te verspreiden om de vorming van een dunne laag te garanderen. Plaats de dia's plat op vier graden Celsius, in het donker, gedurende 10 minuten.
Dompel de dia's in een oplossing van vier graden Celsius lysis, in het donker gedurende één uur tot overnacht. Voor de alkalische comet-assay, verwijder voorzichtig de dia's uit de lysisoplossing, giet overtollig vocht af en dompel de dia's voorzichtig in AES, in het donker op vier graden Celsius gedurende één uur om DNA-ontwinding mogelijk te maken. Voeg voorgekoelde AES toe in de elektroforese dialade.
Ga niet meer dan 0,5 centimeter boven de dia's uit. Plaats de dia's erin en dek af met een dop. Stel de voedingsspanning in op één volt per centimeter en laat deze gedurende 30 minuten op vier graden Celsius lopen.
Wanneer de elektroforese voltooid is, giet overtollig AES van de dia's. Dompel de dia's twee keer voorzichtig gedurende vijf minuten in gedestilleerd water op kamertemperatuur. Daarna dompel de dia's voorzichtig in 70% ethanol op kamertemperatuur gedurende vijf minuten.
Voor de neutrale comet-assay, verwijder voorzichtig de dia's uit de lysisoplossing, giet overtollig vocht af en dompel voorzichtig gedurende 30 minuten in NES in het donker, op vier graden Celsius. Voeg voorgekoelde NES toe in de elektroforese dialade, niet meer dan 0,5 centimeter boven de dia's uit.
Plaats de dia's erin en dek af met een dop. Stel de voedingsspanning in op één volt per centimeter en laat deze gedurende 45 minuten op vier graden Celsius lopen. Giet overtollig buffer van de dia's. Dompel de dia's voorzichtig gedurende 30 minuten in DNA-precipitatieoplossing op kamertemperatuur.
Na 30 minuten dompel de dia's voorzichtig gedurende 30 minuten in 70% ethanol op kamertemperatuur. Begin deze procedure door de dia's in het donker te drogen bij 37 graden Celsius gedurende 10-15 minuten. Plaats vervolgens 50-100 microliter groen fluorescerend nucleïnezuurkleuringsoplossing op het gedroogd agarose van elke dia en kleed gedurende 15 minuten op kamertemperatuur in het donker.
Spoel de dia's kort in gedestilleerd water en droog volledig bij 37 graden Celsius in het donker. Voer onmiddellijk na het kleuren van de comet-dia's beeldverwerving en -analyse uit. Plaats een dia onder een fluorescentiemicroscoop met een diahouder.
Selecteer de 10X objectieflens en zorg ervoor dat de agarosegel naar de objectieflens gericht is. Vanuit elk gekleurde comet-dia worden willekeurig beelden vastgelegd. Vermijd de randen en de gebieden rond eventuele luchtbellen.
Zorg ervoor dat elke cometstaart horizontaal verdeeld is. De cometkoppen moeten van links afkomstig zijn en de staart van rechts. Sla elk beeld op in een binair formaat met heldere DNA-kleuring en een donkere achtergrond.
Voor beeldanalyse, laad eerst alle beelden naar de comet-assay software, door gebruik te maken van de Selecteer bestanden om te analyseren knop, die zich aan de linkerkant van de werkbalk bevindt. Er zou een beeldweergavevenster moeten verschijnen. Teken een meetframe op het scherm en pas de grootte aan volgens de comet van de cel.
Klik op aanpassen om de drempelwaarde van het hoofd, de comet en de staart in te stellen, volgens het beeld. Klik vervolgens op Start met meten. Selecteer een cel met behulp van het frame en activeer de meting door op de Comet meten knop te klikken.
Er zal een intensiteitsbeeld verschijnen op het profielenvenster, met de geselecteerde meetparameters. Sla de resultaten op door op de Resultaten opslaan knop te klikken. Analyseer ten minste 50 cellen per behandeling.
Resultaten van de alkalische en neutrale comet-assays tonen aan dat de cometstaarten van doxorubicine-behandelde UT51-cellen langer waren en een hogere DNA-intensiteit hadden, wat wijst op een substantiële accumulatie van gefragmenteerd DNA. Kwantitatieve analyse voor de alkali
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
De comet-assay is een waardevolle techniek voor het detecteren van DNA-schade, waaronder enkel- en dubbelstrengs breuken. Dit artikel beschrijft zowel alkalische als neutrale comet-assays om DNA-schade in kankercellen te beoordelen, in het bijzonder in de context van chemotherapiebehandelingen.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschapsgebied
- Genotoxiciteit
- Kankeronderzoek
- Beoordeling van DNA-schade
Achtergrond
- De comet-assay maakt het mogelijk om DNA-schade op enkelcelniveau te evalueren.
- Deze is toepasbaar in diverse contexten, waaronder de selectie van potentiële geneesmiddelen.
- Deze methode is efficiënt, eenvoudig en kosteneffectief.
- Het biedt kwantitatieve metingen van DNA-schade.
Doel van de studie
- Om de effectiviteit van genotoxische agentia in kankercellen te onderzoeken.
- Om de therapeutische effecten van chemotherapie op de DNA-integriteit te evalueren.
- Om het begrip van DNA-schade en herstelmechanismen te vergroten.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van agarose voor het coaten van objectglazen.
- Uitvoering van alkalische en neutrale comet-assays.
- Kwantitatieve evaluatie van DNA-schade.
- Toepassing van de comet-assay in studies naar kankercellen.
Belangrijkste resultaten
- De comet-assay detecteert effectief DNA-schade in kankercellen.
- Zowel alkalische als neutrale assays leveren betrouwbare metingen op.
- De techniek demonstreert de impact van chemotherapie op de DNA-integriteit.
- De resultaten ondersteunen het gebruik ervan bij de evaluatie van potentiële geneesmiddelen.
Conclusies
- De comet-assay is een robuuste methode voor het beoordelen van DNA-schade.
- Het is nuttig voor onderzoek naar kankertherapie.
- Verdere studies kunnen de toepassingen ervan in genotoxiciteitstesten uitbreiden.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor executives
Kwantitatieve beoordeling van DNA-schade is cruciaal voor het evalueren van genotoxische agentia tijdens de vroege fase van oncologische geneesmiddelenontwikkeling en preklinische ontwikkeling. De comet-assay maakt directe meting van DNA-strengbreuken op enkelcelniveau mogelijk, wat bijdraagt aan mechanische risicoreductie en voorspellend vertrouwen bij de selectie van kandidaten. De reproduceerbaarheid en efficiëntie maken het een waardevolle tool voor portfoliotriage en de afstemming van translationeel onderzoek.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt directe analyse van genotoxische mechanismen in kandidaatverbindingen mogelijk.
- Ondersteunt functionele targetvalidatie door de DNA-schaderespons te kwantificeren.
- Faciliteert mechanische risicovermindering en prioritering van oncologie-assets.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Biedt een gevalideerde, kwantitatieve uitlezing van DNA-schade in celgebaseerde assays.
- Maakt standaardisatie en reproduceerbaarheid mogelijk over verschillende screeningscampagnes van verbindingen heen.
- Ondersteunt schaalbare evaluatie van genotoxiciteit voor workflows voor lead-optimalisatie.
Translationeel en preklinisch onderzoek
- Rijst preklinische eindpunten voor DNA-schade af op translationele biomarkerstrategieën.
- Maakt continuïteit mogelijk van in vitro ontdekking naar in vivo validatie van genotoxische effecten.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen voor de verdere ontwikkeling van combinatietherapieën.
Pipeline- en workflowintegratie
De comet assay is geïntegreerd in het continuüm van ontdekking naar preklinisch onderzoek, waarbij bruikbare gegevens over DNA-schade worden geleverd voor oncologieprogramma's in een vroeg stadium en ondersteuning wordt geboden bij de identificatie van lead-verbindingen en mechanistische studies.
- Discovery Biology: Kwantificeert DNA-strengbreuken om genotoxische mechanismen te verduidelijken en therapeutische hypothesen te valideren.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten voor de vergelijking van verbindingen en de standaardisatie van assays.
- Analytics: Maakt statistische analyse mogelijk van de intensiteit van DNA-schade en de staartlengte over verschillende behandelingsgroepen.
- Translational Research: Slaat een brug tussen in vitro bevindingen over DNA-schade en de preklinische ontwikkeling van biomarkers.
- Enterprise Reuse: Biedt een breed toepasbaar platform voor genotoxiteitsbeoordeling in diverse celmodellen.
Operationele & Bedrijfsmatige Impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in genotoxiciteitsstudies.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare en schaalbare kwantificering van DNA-schade.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen en verhoogt de kapitaalefficiëntie in oncologieportfolio's.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risicogecorrigeerde prioritering en het verder ontwikkelen van geneesmiddelkandidaten.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in celkweek, elektroforese en fluorescentie-imaging.
- Toegang tot fluorescentiemicroscopie en software voor beeldanalyse is noodzakelijk.
- Standaardisatie tussen teams is vereist voor de reproduceerbaarheid van assays en de vergelijkbaarheid van gegevens.
- Aanpasbaar aan diverse eukaryote celtypen en experimentele condities.
- Praktische beperkingen omvatten het omgaan met gevaarlijke reagentia en het waarborgen van een consistente monstervoorbereiding.
