Name: Een RANKL gebaseerde Osteoclast cultuur Assay van muis beenmerg te onderzoeken van de rol van mTORC1 in Osteoclast vorming (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Leer een RANKL-gebaseerde osteoclastkweekmethode met muizenbeenmerg om de rol van mTORC1 in osteoclastvorming te onderzoeken. Dit protocol genereert efficiënt grote osteoclasten binnen één week.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedanken Dr. Minghan Tong en S. Kato vriendelijk bieden reagentia en muizen. Wij danken de leden van de lab Zou voor nuttige discussies. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van 973 Program van het Chinese ministerie van wetenschap en technologie (MOST) [2014CB964704 en 2015CB964503], klinische Research Program van 9e People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Bedankt voor de hulp van Core faciliteit voor Core faciliteit voor chemische biologie, celbiologie en CAS Center for Excellence in de moleculaire cel Science, Shanghai Instituut voor Biochemie en celbiologie, Chinese Academie van Wetenschappen.

Alle procedures met betrekking tot de dieren werden uitgevoerd volgens het protocol goedgekeurd door het Stanford administratieve Panel op Laboratory Animal Care (APLAC) en zijn goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comité van het Shanghai Institute of Biochemistry en de cel Biologie.
1. voorbereiding
<ol><li>Genereren van osteoclast specifieke Raptor schrapping muizen (Raptorfl/fl; Ctsk-cre, hiernamaals RapCtsk) door de paring Raptorfl/fl muizen met Ctsk-cre muizen. Gebruik de Raptorfl/fl muizen als het besturingselement van de WT in deze studie.</li>
	<li>Het hebben van een container met ijs te houden geïsoleerd bot.</li>
	<li>
Bereiden kweekmedium.
	<ol>
<li>Bereiden α-MEM-kweekmedium door minimale essentiële middellange alpha (α-MEM) met 1 x glutamine, penicilline-streptomycine en foetaal kalfsserum 10% aan te vullen.</li>
		<li>Bereiden van beenmerg macrofaag inductie medium bestaande uit α-MEM medium en M-CSF 50 mL bij 20 ng/mL.</li>
		<li>Osteoclast inductie medium uit M-CSF en RANKL bij 20 ng/mL, respectievelijk, in 50 mL van α-MEM medium voor te bereiden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
De volgende buffers voorbereiden voordat u OVERVULLING kleuring.
	<ol>
<li>Fix oplossing bestaande van 6,5 mL aceton, 2,5 mL citraatoplossing en 0,8 mL van 37% (vol/vol) formaldehyde-oplossing te bereiden.</li>
		<li>TRAP kleurstofoplossing voor te bereiden.<ol>
<li>Prewarm gedeïoniseerd water tot 37 ° C.</li>
			<li>Voeg 100 µL van snel garnet GBC-basisoplossing en 100 µL van natrium nitriet oplossing in een microtube 1.5-mL en meng door zachte inversie 30 s. verlof het mengsel te staan gedurende 2 minuten.</li>
			<li>Prewarm 9 mL gedeïoniseerd water tot 37 ° C. Voeg 200 µL van diazotized snel garnet GBC basisoplossing uit stap 1.4.2.2, 100 µL van naftol AS-BI-oplossing, 400 µL van acetaat oplossing en 200 µL tartraatoplossing.</li>
			<li>Houden van de val kleurstofoplossing van het mengsel in een waterbad bij 37 ° C.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Voorbereiding van de volgende buffer voordat TRAP activiteit kwantificering van kweekmedium.
	<ol>
<li>Bereiden tartraat buffer (50 mL): 2 mL van 0.33 M L-wijnsteenzuur, 48 mL van 0.33 M natriumkaliumtartraat dibasische uitdrogen. De pH-waarde tot 4,9 aanpassen.</li>
		<li>Fosfaatbuffer Dinatrium (pNPP) de 4-nitrofenyl (200 mL) bereiden: 1.502 g van glycine, 41 mg MgCl2, 27.2 mg ZnCl2en 180 mL gedeïoniseerd water. Pas de pH-waarde te 10.4 met 3 M NaOH en het volume tot 200 mL met gedeïoniseerd water.</li>
		<li>Voorbereiden pNPP buffer met fosfatase substraat (een 96-wells-plaat): 49.37 mg fosfatase substraat en 175 µL van pNPP buffer van stap 1.5.2.</li>
		<li>Substraat buffer (9 mL/96-wells-plaat) bereiden: 6.24 mL gedeïoniseerd water en 360 μL van acetaat oplossing 2.4 mL tartraatoplossing buffer. Meng door vortex en verwarm bij 37 ° C vóór gebruik.</li>
		<li>Voeg 90 l pNPP buffer met fosfatase substrate(1.5.3) 9 ml voorverwarmde substraat buffer(1.5.4) te maken van een mengsel van het substraat en vortex voor 10 s.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. dissectie (dag -1)
<ol><li>Euthanaseren 3 één-maand-oude vrouwelijke WT en RapCtsk muizen door CO2 afzonderlijk. Uitvoeren van CO2 inhalatie met geschikte apparatuur door geschoold personeel.</li>
	<li>Onderdompelen 6 muizen in een bekerglas met 100 mL 75% ethanol (vol/vol) voor 5 min ter voorkoming van bacteriële besmetting en vervolgens plaats op een bord van de dissectie in een liggende positie. Maken van een incisie in de distale van het scheenbeen verticaal en ontleden de huid langs de hind-limb met ophthalmic schaar.</li>
	<li>Snijd het articulaire ligament van het heupgewricht met een schaar en ontreddering van de ledematen van hind uit de kofferbak.</li>
	<li>Knip het articulaire ligament van het kniegewricht en zorgvuldig distantiëren van het scheenbeen en het dijbeen van het kniegewricht. Verwijder voorzichtig het zachte weefsel met een schaar.</li>
	<li>Plaats alle beenderen van één genotype in van een muis in ieder putje van een zes-well-plate met 2 mL van α-MEM op ijs. Opmerking: Om de levensvatbaarheid van de cellen te behouden, het been moet worden gehouden in deze omstandigheden voor minder dan 1 uur.</li>
</ol>3. isolatie (dag -1)
<ol><li>Vul één putje van de plaat van een zes-well met 75% ethanol (3 mL) en de andere 5 putten met α-MEM medium (3 mL).</li>
	<li>Zet alle beenderen van één genotype in de ethanol wassen voor 15 s en wassen botten 5 keer met α-MEM medium voor 10 s telkens.</li>
	<li>Afgesneden de epifyses met de schaar en invoegen van een 0,45 mm spuit-naald in de holte en flush beenmerg uit met α-MEM medium in een centrifugebuis van 50 mL.</li>
	<li>Spoel de holte van de bot gebruikend de zelfde methode uit het andere uiteinde van het bot. Herhaal dit ten minste tweemaal om te wassen de bot holte grondig totdat het been bleek is.</li>
	<li>Centrifugeer het beenmerg om te verkrijgen van een cel pellet bij 800 x g en 4 ° C gedurende 5 min. Aspirate het supernatant.</li>
	<li>Voeg 3 mL lysis-buffermengsel van rode bloedcellen in de centrifugebuis en pipet zachtjes aan resuspendeer de beenmerg. Houd de centrifugebuis op ijs gedurende 8 minuten lyse van rode bloedcellen.</li>
	<li>Voeg 6 mL van α-MEM medium in de centrifugebuis te stoppen van lysis van de cel. Centrifugeer bij 500 x g- en 4 ° C gedurende 10 minuten en het supernatant gecombineerd.</li>
	<li>Resuspendeer in 3 mL α-MEM-kweekmedium en plaats van de cellen in een zes-well plaat (over het algemeen één muis per putje).</li>
	<li>Incubeer bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator's nachts.</li>
</ol>4. plating (dag 0)
<ol><li>Het supernatant overbrengen in een centrifugebuis 15 mL voor het verzamelen van de niet-vastgemaakte cellen de volgende ochtend.</li>
	<li>Centrifugeer bij 800 x g- en 4 ° C gedurende 5 minuten en het supernatant gecombineerd.</li>
	<li>Resuspendeer in 4 mL α-MEM-kweekmedium.</li>
	<li>Neem 20 µL van de cel-oplossing en meng met 20 µL van Trypan Blue. 10 µL van het mengsel aan de tellen kamer toevoegen en het aantal cellen per mL van de oplossing te verkrijgen.</li>
	<li>Het toevoegen van een passende omvang van α-MEM-kweekmedium aan het verkrijgen van een mobiele oplossing van 500.000 cellen/mL.</li>
	<li>Voeg toe 500 µL en 50 µL van het beenmerg macrofaag inductie medium in elk putje van een 24-well plaat en 96-wells-plaat, respectievelijk.</li>
	<li>Voeg toe 500 µL en 50 µL van cell oplossing in ieder putje van een 24-well plaat en 96-wells-plaat, respectievelijk.</li>
	<li>Incubeer bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator voor 3 dagen.</li>
</ol>5. differentiatie (3-7 dagen)
<ol><li>Drie dagen na de beplating, 50 µL medium verzamelen van elk putje van de 96-well-plate bevriezen bij-20 ° C en vervolgens gecombineerd het residuele medium.</li>
	<li>Voeg 1 mL en 100 µL osteoclast inductie medium in elk putje van de plaat van een 24-well en een 96-wells-plaat, respectievelijk.</li>
	<li>Incubeer bij 37 ° C gedurende 2 dagen.</li>
	<li>Verzamelen elk putje 50 µL van medium en het resterende medium gecombineerd.</li>
	<li>Osteoclast inductie medium in elk putje toevoegen.</li>
	<li>Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 dag. Opmerking: Op dit punt van tijd, grote, multinucleaire osteoclasten moeten worden gezien onder een omgekeerde Microscoop (figuur 2A).</li>
	<li>Als osteoclasten niet worden gezien, wijzigt u het osteoclast inductie medium en dagelijks observeren totdat osteoclasten worden gezien.</li>
	<li>Verzamel 50 µL van medium van elk putje van de 96-wells-plaat nadat osteoclasten hebben gevormd.</li>
</ol>6. tartraat resistente zure fosfatase (TRAP) kleuring
Opmerking: Volwassen osteoclasten mag na 6-7 dagen van in vitro cultuur (stap 4).
<ol><li>Medium gecombineerd en spoel zachtjes 3 keer met 1 x PBS.</li>
	<li>Bevestigen van de cellen in elk putje van de 96-wells-plaat met 100 µL van fix oplossing voor 30 s bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Na fixatie, de fix-oplossing gecombineerd en zachtjes 3 keer te wassen met gedeïoniseerd water voorverwarmde tot 37 ° C. Gecombineerd gedeïoniseerd water.</li>
	<li>Voeg 100 µL van de TRAP vlek in elk putje van de 96-wells-plaat en plaats van de plaat in een incubator bij 37 ° C voor 30 min en schild van licht.</li>
	<li>Na kleuring, gecombineerd de TRAP vlek en voorzichtig wassen 3 keer met gedeïoniseerd water.</li>
	<li>Afbeelding osteoclasten met behulp van een omgekeerde Microscoop op 40 X vergroting.</li>
</ol>7. TRAP activiteit kwantificering van kweekmedium
<ol><li>Verzamelen 30 µL cultuur supernatant van elk putje van de 96-wells-plaat uit stap 5.1, 5.4 en 5.8; Gebruik 30 µL van niet-gekweekte osteoclast inductie medium als de negatieve controle. Leg de monsters in een nieuwe 96-wells-plaat.</li>
	<li>Voeg 90 μL van substraat mixture(1.5.5) in elk putje van de 96-wells-plaat.</li>
	<li>Plaats de plaat in een incubator bij 37 ° C voor 1 h en schild van licht.</li>
	<li>Zet de reactie stop door 50 µL van 3 M NaOH in elk putje van de 96-wells-plaat toe te voegen.</li>
	<li>Meten van theabsorbance bij de golflengte van 405 nm.</li>
</ol>8. westelijke bevlekken
Opmerking: Na 6-7 dagen van in vitro cultuur in de 24-well plaat, volwassen osteoclasten zichtbaar moeten zijn.
<ol><li>Het medium gecombineerd.</li>
	<li>Voorzichtig wassen met vooraf gekoeld 1 x PBS 3 keer.</li>
	<li>Gecombineerd PBS.</li>
	<li>Voeg 100 µL van 1 x SDS lysis buffer met proteaseinhibitor cocktail.</li>
	<li>Warmte lysates bij 105 ° C gedurende 10 minuten en centrifuge op 12.000 × g- en 4 ° C voor 10 min. verzamelen het supernatant die eiwitten bevatten.</li>
	<li>Scheid de lysates 30 µg eiwit bevattende 10% SDS-pagina11 en vervolgens overbrengen naar een membraan Polyvinylideenfluoride (PVDF) fluoride.</li>
	<li>Het blokkeren van de membranen met 5% nonfat melk gedurende 30 minuten.</li>
	<li>Incubeer de membranen met anti-Raptor anti-P-S6, S6-anti, anti-β-actine bij 1:1,000 verdunning in de nonfat melk 5% bij 4 ° C's nachts.</li>
	<li>Het wassen van de membranen met Tris gebufferde zoutoplossing met Tween-20 (TBST) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Herhaal stap 8,9 tweemaal.</li>
	<li>Incubeer de membranen met horseradish peroxidase (HRP)-geconjugeerd anti-muis of konijn IgG antilichamen bij 1:5,000 verdunning in de nonfat melk 5% gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Het wassen van de membranen 3 keer met TBST gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Voor de chemiluminescentie detectie, voeg westerse chemiluminescentie HRP substraat op de membranen en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Afvoer van het overtollige substraat en bloot de vlekken X-ray film.</li>
</ol>

<ol><li>Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+differentiation+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Osteoclast differentiation and activation.</a> Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).</li>
<li>Jaenisch, R., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+gene+expression%3A+how+the+genome+integrates+intrinsic+and+environmental+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals.</a> Nature Genetics. 33, 245-254 (2003).</li>
<li>Feng, X., McDonald, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disorders+of+bone+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pathol%22%5BJournal%5D)">Disorders of bone remodeling.</a> Annu Rev Pathol. 6, 121-145 (2011).</li>
<li>Boyce, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+osteoclast+biology+reveal+potential+new+drug+targets+and+new+roles+for+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Advances in osteoclast biology reveal potential new drug targets and new roles for osteoclasts.</a> J Bone Miner Res. 28 (4), 711-722 (2013).</li>
<li>Ibbotson, K. J., Roodman, G. D., McManus, L. M., Mundy, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+osteoclast-like+cells+and+their+progenitors+in+cultures+of+feline+marrow+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of osteoclast-like cells and their progenitors in cultures of feline marrow mononuclear cells.</a> J Cell Biol. 99 (2), 471-480 (1984).</li>
<li>Lacey, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoprotegerin+ligand+is+a+cytokine+that+regulates+osteoclast+differentiation+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation.</a> Cell. 93 (2), 165-176 (1998).</li>
<li>Wong, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRANCE+is+a+novel+ligand+of+the+tumor+necrosis+factor+receptor+family+that+activates+c-Jun+N-terminal+kinase+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">TRANCE is a novel ligand of the tumor necrosis factor receptor family that activates c-Jun N-terminal kinase in T cells.</a> J Biol Chem. 272 (40), 25190-25194 (1997).</li>
<li>Zoncu, R., Efeyan, A., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR%3A+from+growth+signal+integration+to+cancer%2C+diabetes+and+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">mTOR: from growth signal integration to cancer, diabetes and ageing.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (1), 21-35 (2011).</li>
<li>Bhaskar, P. T., Hay, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+TORCs+and+Akt%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">The two TORCs and Akt.</a> Dev Cell. 12 (4), 487-502 (2007).</li>
<li>Dai, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+Regulatory-associated+Protein+of+mTOR+%28Raptor%29%2FMammalian+Target+of+Rapamycin+Complex+1+%28mTORC1%29+Signaling+in+Osteoclasts+Increases+Bone+Mass+by+Inhibiting+Osteoclast+Differentiation+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Inactivation of Regulatory-associated Protein of mTOR (Raptor)/Mammalian Target of Rapamycin Complex 1 (mTORC1) Signaling in Osteoclasts Increases Bone Mass by Inhibiting Osteoclast Differentiation in Mice.</a> J Biol Chem. 292 (1), 196-204 (2017).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. , Cold spring harbor laboratory press. (1989).</li>
<li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+Marrow-Derived+Macrophages+%28BMM%29%3A+Isolation+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li>
<li>Bradley, E. W., Oursler, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+culture+and+resorption+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Osteoclast culture and resorption assays.</a> Methods Mol Biol. 455, 19-35 (2008).</li>
<li>Tevlin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+derivation+from+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Osteoclast derivation from mouse bone marrow.</a> J Vis Exp. (93), e52056(2014).</li>
<li>Xing, L., Boyce, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RANKL-based+osteoclastogenic+assays+from+murine+bone+marrow+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">RANKL-based osteoclastogenic assays from murine bone marrow cells.</a> Methods Mol Biol. 1130, 307-313 (2014).</li>
<li>Hsu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor+receptor+family+member+RANK+mediates+osteoclast+differentiation+and+activation+induced+by+osteoprotegerin+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor receptor family member RANK mediates osteoclast differentiation and activation induced by osteoprotegerin ligand.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (7), 3540-3545 (1999).</li>
<li>Underwood, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+where+comes+the+osteoclast%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">From where comes the osteoclast?</a> J Pathol. 144 (4), 225-226 (1984).</li>
<li>Wein, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+bone+resorption+in+mice+by+Schnurri-3%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Control of bone resorption in mice by Schnurri-3.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8173-8178 (2012).</li>
</ol>

Alle auteurs vermelden dat ze geen conflicten van interesse hebben.

De bepaling van de osteoclastogenic is de wijdst gebruikte methode cultuur osteoclasten in vitro12,13te isoleren. Terwijl verscheidene RANKL gebaseerde osteoclast inducties beschreven13,14,15 zijn, wordt in de huidige studie een protocol met enkele aanpassingen op basis van de bovenstaande methoden beschreven.
In de vorige studie, war...

Bot is een orgaan steeds veranderende en is gerenoveerd door botcellen en osteoclasten gedurende het hele leven. Osteoclasten zijn verantwoordelijk voor gemineraliseerde matrix resorptie en botcellen synthetiseren en afscheiden van nieuw bot matrices1. Het evenwicht tussen resorptie van het been en been vorming is van cruciaal belang voor de gezondheid van de botten met inbegrip van onderhoud van bot massa en respons op stimulatie en schade. Als dit evenwicht is verstoord, kan een reeks van metabole ziekten bot optreden, met inbegrip van osteoporose en parodontale ziekten. In deze ziekten overschrijdt massale botverlies als gevolg van osteoclastic bot resorptie het bot vormen capaciteit van botcellen2,3. Het is dus, teneinde farmaceutische doelstellingen voor de behandeling van skeletstoornissen zoals osteoporose, kritiek te begrijpen van de generatie en de biologie van osteoclasten4.
Osteoclasten zijn unieke giant multinucleaire cellen zich op of in de buurt van het oppervlak van bot en behoren tot de familie van monocyt/macrofaag1. Ibbotson K. J. et al. een methode voor het genereren van osteoclast-achtige cellen in vitro met medium met 1,25-dihydroxy-vitamine D35gemeld. De identificatie van macrofaag-kolonie stimulerende factor (M-CSF) en receptor activator voor nuclear factor-Kappa B ligand (RANKL) als essentiële factoren van osteoclast formatie is sterk toegenomen de efficiëntie van de osteoclastogenesis in vitro 1 , 6 , 7. de mogelijkheid om cultuur osteoclasten in vitro verbeterd ons begrip van de generatie en regulering van de osteoclasten.
Het zoogdier/mechanistische doel van rapamycin (mTOR) functies in twee structureel en functioneel verschillende complexen, namelijk mTORC1 en mTORC28,9. De twee multi eiwitcomplexen zijn verschillend van elkaar als gevolg van hun verschillende componenten en de stroomafwaartse substraten. mTORC1 bevat de unieke regelgevende-geassocieerde proteïne van mTOR (Raptor), terwijl mTORC2 de rapamycin-ongevoelig metgezel van mTOR (Rictor)9 bevat. mTORC1 kan integreren en zenden belangrijke signalen voor het regelen van de celgroei, proliferatie en differentiatie. Onlangs, we laten zien dat mTORC1 speelt een sleutelrol in het netwerk van katabole bot resorptie door schrapping van de Raptor naar de inactivering van mTORC1 in de osteoclasten10. Echter de onderliggende mechanismen nader moeten worden onderzocht. In de huidige studie, werd een RANKL gebaseerde osteoclastogenic-methode gebruikt voor het genereren van osteoclasten uit beenmerg-afgeleide macrofagen (BMMs) van wild-type (WT) en RapCtsk muizen, en te bestuderen van de invloed van mTORC1 inactivatie op osteoclast vorming.

<table><tbody><tr><td>Raptorfl/fl muizen</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>013188</td><td></td></tr><tr><td>Ctsk-cre muizen</td><td></td><td></td><td>een geschenk van S. Kato, Universiteit van Tokio, Tokio, Japan</td></tr><tr><td>&alpha;-MEM</td><td>Corning</td><td>10-022-CVR</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Gibico</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline streptomycine</td><td>Gibico</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal runderserum</td><td>BioInd</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant muis M-CSF-eiwit</td><td>R&amp;D</td><td>Q3U4F9</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant muis RANKL-eiwit</td><td>R&amp;D</td><td>Q3TWY5</td><td></td></tr><tr><td>RBC-lysebuffer</td><td>Beyotime</td><td>C3702</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblauw</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>302643</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Citraat oplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>915</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde oplossing</td><td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acid Fosfatase, Leukocyten (TRAP) Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387A-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Fast Garnet GBC Basisoplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3872</td><td></td></tr><tr><td>Natriumnitrietoplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>914</td><td></td></tr><tr><td>Naftol AS-BI Fosfaat Oplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3871</td><td></td></tr><tr><td>Acetaat oplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3863</td><td></td></tr><tr><td>Tartraat oplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3873</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing</td><td>Corning</td><td>21-031-CVR</td><td></td></tr><tr><td>L-wijnsteenzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>251380</td><td></td></tr><tr><td>Natriumtartraat dibasisch dehydraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>s4797</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfatase substraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4744</td><td></td></tr><tr><td>anti-Raptor</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2280</td><td></td></tr><tr><td>anti-P-ribosomaal eiwit S6 (S235/236)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2317</td><td></td></tr><tr><td>anti-ribosomaal eiwit S6</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2211</td><td></td></tr><tr><td>anti-&beta;-actine</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-130300</td><td></td></tr><tr><td>37% formaldehyde</td><td>Xilong scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Western Chemiluminescent HRP Substraat (ECL)</td><td>Millipore</td><td>00000367MSDS</td><td></td></tr><tr><td>IX71</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Envision</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,45-mm Spuit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schaar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Muggentang</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

een rankl gebaseerde osteoclast cultuur assay van muis beenmerg te onderzoeken van de rol van mtorc1 in osteoclast vorming

A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

Osteoclasten zijn unieke bot-resorbeerbare cellen die van de bloedlijn monocyt/macrophage van beenmerg onderscheiden. Dysfunctie van osteoclasten kan resulteren in een reeks van bot metabole ziekten, met inbegrip van osteoporose. Ontwikkeling van farmaceutische doelstellingen voor de preventie van pathologische massa botverlies, moeten de mechanismen waarmee osteoclasten van precursoren onderscheiden worden begrepen. De mogelijkheid om te isoleren en een groot aantal osteoclasten in vitro cultuur is van cruciaal belang om te bepalen van de rol van specifieke genen bij osteoclast differentiatie. Inactivering van het zoogdier/mechanistische doelwit van rapamycin complexe 1 (TORC1) in osteoclasten kan verminderen osteoclast nummer en verhoging van de botmassa; echter de onderliggende mechanismen nader moeten worden onderzocht. In de huidige studie, wordt een RANKL gebaseerde protocol cultuur osteoclasten uit beenmerg van de muis te isoleren en te bestuderen of de invloed van mTORC1 inactivatie op osteoclast vorming beschreven. Dit protocol met succes geleid tot een groot aantal reus osteoclasten, meestal binnen een week. Schrapping van de Raptor verminderde osteoclast vorming en daalde de activiteit van secretoire tartraat-resistente zure fosfatase, die aangeeft dat mTORC1 is van cruciaal belang voor osteoclast vorming.

Met behulp van dit protocol, werden een groot aantal reus osteoclasten gezien op dag 6; Als giant osteoclasten niet gezien zijn, een dag van osteoclast differentiatie mogelijk nodig (Figuur 1). Succesvolle osteoclast vorming werd bevestigd door val kleuring (figuur 2A). Osteoclasten waren gigantische wijn rood/paars cellen met meer dan 3 kernen. Meer dan 250 osteoclasten werden verkregen in elk putje van de 96-wells-plaat in WT B...

Dit manuscript wordt beschreven van een protocol bij isolaat en cultuur osteoclasten in vitro uit beenmerg van de muis, en te bestuderen van de rol van het zoogdier/mechanistische doelwit van rapamycin complexe 1 in osteoclast vorming.

Een RANKL gebaseerde Osteoclast cultuur Assay van muis beenmerg te onderzoeken van de rol van mTORC1 in Osteoclast vorming

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...

Het algemene doel van dit protocol is om osteoclasten in vitro te isoleren en te kweken uit muisbeenmerg en om de rol van de mammalian target of rapamycin complex one in osteoclastvorming te bestuderen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de vorming van osteoclasten, zoals de rol van mTORC1 bij osteoclastdifferentiatie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het binnen een week resulteert in een groot aantal gigantische osteoclasten.De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van osteoporose omdat het nuttig is om het mechanisme te bestuderen waardoor osteoclasten differentiëren uit hun voorlopers. Om deze procedure te beginnen, maak een verticale incisie aan het distale uiteinde van de tibia van een geëuthaniseerde muis en dissecter de huid langs de achterpoten. Vervolgens snijdt u het gewrichtsligament van de heupgewrichten door met een schaar en disloceert u de achterpoten van de romp.Snijd het gewrichtsligament van het kniegewricht door en dissocieer voorzichtig de tibia en femur ervan. Verwijder voorzichtig het zachte weefsel met een schaar. Plaats al het bot van een muis in elke put van een zes-putsplaat met twee milliliter alfa-MEM op ijs.Voor isolatie vult u één put van een zes-putsplaat met 75% ethanol en de andere vijf putten met alfa-MEM. Leg alle botten van een muis in de ethanolwassing gedurende 15 seconden en was de botten vervolgens vijf keer met alfa-MEM gedurende 10 seconden elke keer. Snijd de epifysen af met de schaar en steek een 0,45-millimeter spuitnaald in de botholte.Spuit het beenmerg uit met alfa-MEM in een centrifugeerbuis van 50 milliliter. Spuit vervolgens de botholte uit met dezelfde methode vanaf het andere uiteinde van het bot. Herhaal dit ten minste twee keer om de botholte grondig te wassen totdat het bot bleek is.Centrifugeer vervolgens het beenmerg om een celpellet te verkrijgen bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Zuig daarna de supernatant op. Voeg drie milliliter rode bloedcel lysisbuffer toe aan de centrifugeerbuis en pipetteer voorzichtig om het beenmerg op te schorsen.Houd vervolgens de centrifugeerbuis acht minuten op ijs om de rode bloedcellen te lyseren. Voeg na acht minuten zes milliliter alfa-MEM toe aan de centrifugeerbuis om de cellyse te stoppen. Centrifugeer bij 800 g en vier graden Celsius gedurende 10 minuten en zuig de supernatant op.Suspensieer vervolgens in drie milliliter alfa-MEM kweekmedium en plaats de cellen in een zes-putsplaat. Incubeer bij 37 graden Celsius overnacht. In deze stap, brengt u de supernatant over naar een 15-milliliter centrifugeerbuis om de niet-gehechte cellen de volgende ochtend te verzamelen.Centrifugeer daarna bij 800 g en vier graden Celsius gedurende vijf minuten en zuig de supernatant op. Suspensieer vervolgens de cellen in vier milliliter alfa-MEM kweekmedium. Neem 20 microliters van de celoplossing en meng met 20 microliters Trypan Blue.Voeg vervolgens 10 microliters van het mengsel toe aan de telkamer en verkrijg het aantal cellen per milliliter oplossing. Voeg vervolgens een geschikt volume alfa-MEM kweekmedium toe om een celoplossing van 500.000 cellen per milliliter te verkrijgen. Voeg vervolgens 500 microliter en 50 microliter beenmergmacrofaag-inductiemedium toe in elke put van een 24-putsplaat en 96-putsplaat, respectievelijk.Voeg vervolgens 500 microliter en 50 microliter celoplossing toe in elke put van een 24-putsplaat en 96-putsplaat, respectievelijk. Incubeer bij 37 graden Celsius gedurende drie dagen. Drie dagen na het plateren, verzamel 50 microliter medium uit elke put van de 96-putsplaat en bevries het bij min 20 graden Celsius.Zuig vervolgens het resterende medium op. Voeg één milliliter en 100 microliter osteoclast-inductiemedium toe in elke put van een 24-putsplaat en een 96-putsplaat, respectievelijk. Incubeer bij 37 graden Celsius gedurende twee dagen.Na twee dagen, verzamel 50 microliter medium uit elke put en zuig het resterende medium op. Voeg vervolgens osteoclast-inductiemedium toe in elke put en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende één dag. Nadat osteoclasten zijn gevormd, verzamel 50 microliter medium uit elke put van de 96-putsplaat.In deze stap, zuig het medium op en was het monster voorzichtig drie keer met 1X PBS. Fixeer vervolgens de cellen in elke put van de 96-putsplaat met 100 microliter fixeeroplossing gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur. Na fixatie, zuig de fixeeroplossing op en was de cellen voorzichtig drie keer met gedeïoniseerd water voorverwarmd tot 37 graden Celsius.Zuig vervolgens het gedeïoniseerd water op en voeg 100 microliter TRAP-kleurstof toe in elke put van de 96-putsplaat. Plaats de plaat in een incubator bij 37 graden Celsius gedurende 30 minuten en bescherm het tegen licht. Na het kleuren, zuig de TRAP-kleurstof op en was drie keer voorzichtig met gedeïoniseerd water.Beeld vervolgens de osteoclasten af in een omgekeerde microscoop met 40X vergroting. Breng vervolgens 30 microliters van het medium dat eerder is verzameld over naar een nieuwe 96-putsplaat. Voeg vervolgens 90 microliters substraatmengsel toe in elke put van de 96-putsplaat.Plaats de plaat in een incubator bij 37 graden Celsius gedurende een uur en bescherm het tegen licht. Stop na een uur de reactie door 30 microliters drie molair natriumhydroxide toe te voegen in elke put van de 96-putsplaat. Meet vervolgens de absorptie bij de golflengte van 405 nanometer met de EnVision Multilabel Plate Reader.Hier is de representatieve weergave van de osteoclasten die op dag zes in fel veld werden waargenomen. De rode lijn omlijnt de rand van de osteoclasten. En hier wordt een typisch gigantische, meerkernige, TRAP-positieve osteoclast getoond.De zwarte pijl geeft twee kernen van de meerkernige osteoclast aan. Deze figuur toont TRAP-kleuring

a-rankl-based-osteoclast-culture-assay-mouse-bone-marrow-to

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Behandeling van primaire muis osteoblasten met retinoinezuur produceert een homogene populatie van vertakte cellen die morfologische en moleculaire kenmerken van osteocyten. De werkwijze overwint de moeilijkheid van het verkrijgen en handhaven primaire osteocyten in kweek, en kan voordelig zijn om cellen uit transgene modellen bestuderen.

Toepassing van retinoinezuur aan Osteocyten Culturen van primaire muizen osteoblasten verkrijgen

De differentiatie van precursorcellen in osteoclasten wordt gereguleerd door cytokinen en groeifactoren. Hier worden een nieuwe genoverdrachtstechniek voor differentiatie van osteoclasten in vivo en celkweekprotocollen voor het differentiëren van precursorcellen in osteoclasten in vitro beschreven als een methode om de effecten van cytokinen op osteoclastogenese te bestuderen.

A Novel In vivo Gene Transfer Techniek en In vitro Cel-gebaseerde testen voor de studie van botverlies bij musculoskeletale aandoeningen

Osteoclasten zijn de voornaamste botresorberende cellen in het lichaam. Het vermogen om osteoclasten te isoleren in grote aantallen heeft tot aanzienlijke vooruitgang in het inzicht van osteoclast biologie. In dit protocol beschrijven we een werkwijze voor het isoleren, kweken en kwantificeren van osteoclasten in vitro.

Osteoclast Afleiding van Mouse Bone Marrow

Notch-signalering is een vorm van cellulaire communicatie die afhankelijk is van direct contact tussen cellen. Om Notch-signalering goed te induceren in vitro, moeten Notch-liganden aan cellen worden gepresenteerd in een geïmmobiliseerde toestand. Dit protocol beschrijft methoden voor in vitro stimulatie van Notch-signalering in voorlopers van muizenosteoclasten.

Stimulatie van Notch signalering in Mouse osteoclastvoorlopers

Dit protocol beschrijft de ontwikkeling van een in vitro menselijke preklinische model van osteoclastogenesis uit perifeer bloed monocyten gekweekt met borst kanker cellijnen na te bootsen de kanker cel-osteoclast interactie. Het model kan worden gebruikt om verdere van ons begrip van metastase biomineralisatie en therapeutische opties te verbeteren.

Ontwikkeling van een menselijke preklinische Model van Osteoclastogenesis uit perifeer bloed monocyten mede gekweekt met borst kanker cellijnen

In dit artikel presenteren we methoden om te isoleren en te onderscheiden van het beenmerg stromale cellen en hematopoietische stamcellen van lange beenderen van de muis. Twee verschillende protocollen worden gepresenteerd opbrengst andere cel populaties geschikt voor uitbreiding en differentiatie in botcellen, adipocytes en osteoclasten.

Isolatie, cultuur en differentiatie van beenmerg stromale cellen en Osteoclast voorlopercellen van muizen

Osteoclasten zijn weefsel-specifieke macrofagen polykaryons afgeleid van de monocyten-macrofagen afstamming van hematopoietische stamcellen. In dit protocol wordt beschreven hoe u beenmergcellen isoleren zodat grote hoeveelheden osteoclasten worden verkregen terwijl het risico op ongevallen in traditionele methoden wordt verminderd.

Isolatie, zuivering en differentiatie van osteoclast precursoren van het Rat beenmerg

Dit protocol omvat dissectie van lymfkliertest lange botten en beenmerg isolatie, voor het genereren van beenmerg macrofagen en produceren van de osteoclasten met behulp van macrofaag kolonie stimulerende factor (M-CSF) en receptor activator van nuclear factor-Kappa-B ligand (RANKL) of Tumornecrosefactor alfa (TNF-α) en hun arrestatie door anti-c-fms antilichaam, M-CSF receptor.

Effect van Anti-c-fms antilichaam op Osteoclast vorming en verspreiding van Osteoclast voorloper In Vitro

Dit protocol beschrijft een canonieke methode om de kritische genen te begrijpen die de osteoclastenactiviteit in vivo controleren. Deze methode maakt gebruik van een transgeen muismodel en enkele canonieke technieken om skeletfenotype te analyseren.

Skelet fenotype analyse van een voorwaardelijke Stat3 verwijdering muismodel

Hier presenteren we een eenvoudige en effectieve testprocedure voor resorptieputtests met behulp van met calciumfosfaat gecoate celkweekplaten.

Een eenvoudig pittestprotocol om osteoclastische resorptie in vitro te visualiseren en te kwantificeren

Leer een RANKL-gebaseerde osteoclastkweekmethode met muizenbeenmerg om de rol van mTORC1 in osteoclastvorming te onderzoeken. Dit protocol genereert efficiënt grote osteoclasten binnen één week.

Een RANKL gebaseerde Osteoclast cultuur Assay van muis beenmerg te onderzoeken van de rol van mTORC1 in Osteoclast vorming

Meer video's verkennen