Een RANKL gebaseerde Osteoclast cultuur Assay van muis beenmerg te onderzoeken van de rol van mTORC1 in Osteoclast vorming

Het algemene doel van dit protocol is om osteoclasten in vitro te isoleren en te kweken uit muisbeenmerg en om de rol van de mammalian target of rapamycin complex one in osteoclastvorming te bestuderen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de vorming van osteoclasten, zoals de rol van mTORC1 bij osteoclastdifferentiatie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het binnen een week resulteert in een groot aantal gigantische osteoclasten.

De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van osteoporose omdat het nuttig is om het mechanisme te bestuderen waardoor osteoclasten differentiëren uit hun voorlopers. Om deze procedure te beginnen, maak een verticale incisie aan het distale uiteinde van de tibia van een geëuthaniseerde muis en dissecter de huid langs de achterpoten. Vervolgens snijdt u het gewrichtsligament van de heupgewrichten door met een schaar en disloceert u de achterpoten van de romp.

Snijd het gewrichtsligament van het kniegewricht door en dissocieer voorzichtig de tibia en femur ervan. Verwijder voorzichtig het zachte weefsel met een schaar. Plaats al het bot van een muis in elke put van een zes-putsplaat met twee milliliter alfa-MEM op ijs.

Voor isolatie vult u één put van een zes-putsplaat met 75% ethanol en de andere vijf putten met alfa-MEM. Leg alle botten van een muis in de ethanolwassing gedurende 15 seconden en was de botten vervolgens vijf keer met alfa-MEM gedurende 10 seconden elke keer. Snijd de epifysen af met de schaar en steek een 0,45-millimeter spuitnaald in de botholte.

Spuit het beenmerg uit met alfa-MEM in een centrifugeerbuis van 50 milliliter. Spuit vervolgens de botholte uit met dezelfde methode vanaf het andere uiteinde van het bot. Herhaal dit ten minste twee keer om de botholte grondig te wassen totdat het bot bleek is.

Centrifugeer vervolgens het beenmerg om een celpellet te verkrijgen bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Zuig daarna de supernatant op. Voeg drie milliliter rode bloedcel lysisbuffer toe aan de centrifugeerbuis en pipetteer voorzichtig om het beenmerg op te schorsen.

Houd vervolgens de centrifugeerbuis acht minuten op ijs om de rode bloedcellen te lyseren. Voeg na acht minuten zes milliliter alfa-MEM toe aan de centrifugeerbuis om de cellyse te stoppen. Centrifugeer bij 800 g en vier graden Celsius gedurende 10 minuten en zuig de supernatant op.

Suspensieer vervolgens in drie milliliter alfa-MEM kweekmedium en plaats de cellen in een zes-putsplaat. Incubeer bij 37 graden Celsius overnacht. In deze stap, brengt u de supernatant over naar een 15-milliliter centrifugeerbuis om de niet-gehechte cellen de volgende ochtend te verzamelen.

Centrifugeer daarna bij 800 g en vier graden Celsius gedurende vijf minuten en zuig de supernatant op. Suspensieer vervolgens de cellen in vier milliliter alfa-MEM kweekmedium. Neem 20 microliters van de celoplossing en meng met 20 microliters Trypan Blue.

Voeg vervolgens 10 microliters van het mengsel toe aan de telkamer en verkrijg het aantal cellen per milliliter oplossing. Voeg vervolgens een geschikt volume alfa-MEM kweekmedium toe om een celoplossing van 500.000 cellen per milliliter te verkrijgen. Voeg vervolgens 500 microliter en 50 microliter beenmergmacrofaag-inductiemedium toe in elke put van een 24-putsplaat en 96-putsplaat, respectievelijk.

Voeg vervolgens 500 microliter en 50 microliter celoplossing toe in elke put van een 24-putsplaat en 96-putsplaat, respectievelijk. Incubeer bij 37 graden Celsius gedurende drie dagen. Drie dagen na het plateren, verzamel 50 microliter medium uit elke put van de 96-putsplaat en bevries het bij min 20 graden Celsius.

Zuig vervolgens het resterende medium op. Voeg één milliliter en 100 microliter osteoclast-inductiemedium toe in elke put van een 24-putsplaat en een 96-putsplaat, respectievelijk. Incubeer bij 37 graden Celsius gedurende twee dagen.

Na twee dagen, verzamel 50 microliter medium uit elke put en zuig het resterende medium op. Voeg vervolgens osteoclast-inductiemedium toe in elke put en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende één dag. Nadat osteoclasten zijn gevormd, verzamel 50 microliter medium uit elke put van de 96-putsplaat.

In deze stap, zuig het medium op en was het monster voorzichtig drie keer met 1X PBS. Fixeer vervolgens de cellen in elke put van de 96-putsplaat met 100 microliter fixeeroplossing gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur. Na fixatie, zuig de fixeeroplossing op en was de cellen voorzichtig drie keer met gedeïoniseerd water voorverwarmd tot 37 graden Celsius.

Zuig vervolgens het gedeïoniseerd water op en voeg 100 microliter TRAP-kleurstof toe in elke put van de 96-putsplaat. Plaats de plaat in een incubator bij 37 graden Celsius gedurende 30 minuten en bescherm het tegen licht. Na het kleuren, zuig de TRAP-kleurstof op en was drie keer voorzichtig met gedeïoniseerd water.

Beeld vervolgens de osteoclasten af in een omgekeerde microscoop met 40X vergroting. Breng vervolgens 30 microliters van het medium dat eerder is verzameld over naar een nieuwe 96-putsplaat. Voeg vervolgens 90 microliters substraatmengsel toe in elke put van de 96-putsplaat.

Plaats de plaat in een incubator bij 37 graden Celsius gedurende een uur en bescherm het tegen licht. Stop na een uur de reactie door 30 microliters drie molair natriumhydroxide toe te voegen in elke put van de 96-putsplaat. Meet vervolgens de absorptie bij de golflengte van 405 nanometer met de EnVision Multilabel Plate Reader.

Hier is de representatieve weergave van de osteoclasten die op dag zes in fel veld werden waargenomen. De rode lijn omlijnt de rand van de osteoclasten. En hier wordt een typisch gigantische, meerkernige, TRAP-positieve osteoclast getoond.

De zwarte pijl geeft twee kernen van de meerkernige osteoclast aan. Deze figuur toont TRAP-kleuring