Name: Opsporen van de ziekte van Lyme-spirocheet, Borrelia Burgdorferi, in teken met behulp van genestelde PCR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Leer geneste PCR om Borrelia burgdorferi in teken op te sporen voor surveillancedoeleinden. Deze methode richt zich op OspA- en FlaB-genen om de gevoeligheid en specificiteit van de detectie te verhogen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedank Kami Harris voor primer design, Ashley McKibbon en Jessica Thomas-Ebbett voor het filmen, en John Blakely, Alexandra Foley-Eby, Chris Langley, Julie Lewis, Kelsey McIntyre, Ashley McKibbon, Chris Zinck en Rosie de hond voor het verschijnen het video. A. M. K. werd gesteund door de Canadese Lyme Disease Research Foundation, en projectfinanciering werd verstrekt door de Natural Sciences and Engineering Research Raad van Canada (NSERC). M. K. B. W. ontvangen salaris financiering uit de New Brunswick innovatie Foundation (NBIF).

1. DNA isolatie van teken
<ol><li>Teken via veld-collectie of passieve bewaking van dierenartsen en leden van het publiek te verwerven. Teken moeten worden gedood door bevriezing, geplaatst in een verzegelde zak en gemaild bij kamertemperatuur.<ol>
<li>Met behulp van een verzendformulier, verzamelen informatie over de datum en de geografische locatie van de ontmoeting, status van de bijlage van de teek, host soorten en recente geschiedenis van de reizen van de host.</li>
		<li>Aangezien genestelde PCR inherent kwetsbaar voor besmetting is, er voor zorgen dat de laboratorium-werkruimte is ingesteld om te minimaliseren van de Kruis-blootstelling van monsters. Dit omvat het uitvoeren van de verschillende elementen van het protocol in aparte, specifieke ruimten goed geïsoleerd van elkaar, die grondig zijn gereinigd en gesteriliseerd, en ervoor te zorgen dat alle instrumenten zijn vrij van verontreinigingen.</li>
		<li>Na ontvangst van het model, de teek fotograferen en bepalen van de soorten, ontwikkelingsstadium, seks en de status van de congestie in vergelijking tot een identificatie sleutel32 .</li>
		<li>De teek met een steriele scheermesje of scalpel bisect onder aseptische condities, en plaats de twee teek fragmenten in aparte microcentrifuge buizen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Om totale DNA, gebruikt elke isolatie-procedure dat de opbrengst van de PCR-compatibele sjabloon; Dit protocol toont een eenvoudige chelatie gebaseerde benadering.<ol>
<li>Beginnen met het toevoegen van een passende omvang (vaak tussen de 50-200 µL) van een reagens lytische chelatie naar het fragment van de teek. Het specifieke bedrag zal afhangen van de specimen grootte en congestie status; richtsnoeren moeten worden verstrekt door de fabrikant. Meng met behulp van een stamper microtube.</li>
		<li>Incubeer monsters in een waterbad bij 60 ° C voor 45 min, en vortex kort.</li>
		<li>Centrifugeer steekproeven voor 4 min 16,276 x g (13,300 rpm) in een desktop microcentrifuge.</li>
		<li>Supernatant overbrengen in een frisse, gelabelde microtube met 50 µL isopropanol, Meng door inversie, en opnieuw Centrifugeer zoals (1.2.3).</li>
		<li>De bovendrijvende vloeistof decanteren, en spoel de DNA-pellet met 50 µL van 70% ethanol.</li>
		<li>Verwijderen van de overtollige ethanol met een pipet, en laat de pellet te drogen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Resuspendeer DNA, voeg 50 µL van 1 mM Tris pH 7.0 en incubeer monsters in een waterbad gedurende 1 uur bij 60 ° C. Het DNA kan nu worden opgeslagen bij-20 ° C voor toekomstige moleculaire analyse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. genestelde PCR detectie van Borrelia OspA en FlaB.
Opmerking: Een overzicht van de algemene principes van PCR en praktijken worden verstrekt door Lorenz, 201233.
<ol><li>Synthetiseren of Borrelia gen-specifieke uiterlijke en innerlijke oligonucleotide inleidingen te verkrijgen. Zie tabel 1 voor primer sets, hun respectieve amplicon maten en smeltende temperaturen.</li>
</ol><table border="1"><tbody>
<tr>
<td>De naam van de primer</td>
			<td>Gene Target</td>
			<td colspan="2">Volgorde (5' - 3')</td>
			<td>Amplicon grootte</td>
			<td>Onthardende temperatuur</td>
		</tr>
<tr>
<td>FlaB uit Fw</td>
			<td>FlaB</td>
			<td colspan="2">gcatcactttcagggtctca</td>
			<td rowspan="2">503 bp</td>
			<td rowspan="2">55° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>FlaB uit Rv</td>
			<td>FlaB</td>
			<td colspan="2">tggggaacttgattagcctg</td>
		</tr>
<tr>
<td>FlaB In Fw</td>
			<td>FlaB</td>
			<td colspan="2">ctttaagagttcatgttggag</td>
			<td rowspan="2">447 bp</td>
			<td rowspan="2">58° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>FlaB In Rv</td>
			<td>FlaB</td>
			<td colspan="2">tcattgccattgcagattgt</td>
		</tr>
<tr>
<td>OspA Out Fw</td>
			<td>OspA</td>
			<td colspan="2">cttgaagttttcaaagaagat</td>
			<td rowspan="2">487 bp</td>
			<td rowspan="2">55° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>OspA Out Rv</td>
			<td>OspA</td>
			<td colspan="2">caactgctgacccctctaat</td>
		</tr>
<tr>
<td>OspA In Fw</td>
			<td>OspA</td>
			<td colspan="2">acaagagcagacggaaccag</td>
			<td rowspan="2">350 bp</td>
			<td rowspan="2">58° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>OspA In Rv</td>
			<td>OspA</td>
			<td colspan="2">ttggtgccatttgagtcgta</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Binnenste en buitenste inleidingen voor nPCR van Borrelia burgdorferiFlaB en OspA. In de praktijk de FlaB inleidingen detecteren B. burgdorferi s.s. en andere nauw aanverwante Borrelia -genospecies, terwijl OspA inleidingen alleen B. burgdorferi s.s. vangen versterking van beide loci wijzen op B. burgdorferi. s.s.
<ol start="2"><li>Vooraf steriliseren een PCR-kast met UV licht en 70% ethanol. Opmerking: Om te minimaliseren van potentiële verontreiniging van de steekproef, deze werkruimte moet worden onderscheiden van de locatie van de teek dissectie, DNA-extractie, en gel elektroforese.<ol>
<li>Voor de eerste PCR uitvoeren, door de buitenste inleidingen te gebruiken in combinatie met de sjabloon DNA hersteld in stap 1.0 hierboven, en het opzetten van het reactiemengsel zoals beschreven in tabel 2. In parallel, uitgevoerd door positieve controle uitgevoerd bestaande uit gecontroleerde Borrelia DNA, en negatieve controle wordt uitgevoerd met inbegrip van neen-template reacties op te sporen van besmetting reagens en spuitbussen. DNA toevoegen aan het eind om te minimaliseren van de potentiële verontreiniging van reagentia. Controleer dat elke buis is helemaal gesloten tijden wanneer reagentia worden niet toegevoegd en sluit buizen onmiddellijk na toevoeging van DNA en voordat andere buizen worden geopend.</li>
		<li>Een thermische cycler als volgt programmeren: 95 ° C gedurende 5 minuten; 40 cycli van 95 ° C voor 15 s, onthardende temperatuur voor 30 s, 72 ° C gedurende 45 s; 72 ° C gedurende 5 minuten; Houd bij 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Het uitvoeren van de tweede ronde van PCR vergelijkbaar met de eerste reactie, behalve inner inleidingen gebruiken met 2 µL van het eerste PCR product (geproduceerd in punt 2.2.2). Opmerking: Reactie volumes opnieuw vindt u in tabel 2. Zorg moet worden genomen om te voorkomen van kruisbesmetting van waarbij door ervoor te zorgen dat sjabloon DNA toegevoegd laatste en enige buizen die betrekking hebben op een steekproef zijn open op een moment. 
	 
	<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>Component</td>
				<td>PCR # 1 Volumes</td>
				<td>PCR # 2 Volumes</td>
			</tr>
<tr>
<td>Taq Polymerase Master Mix 2 X</td>
				<td>12.5 ΜL</td>
				<td>12.5 ΜL</td>
			</tr>
<tr>
<td>Nuclease-gratis Water</td>
				<td>8,5 ΜL</td>
				<td>8,5 ΜL</td>
			</tr>
<tr>
<td>10 µM forward en Reverse inleidingen</td>
				<td>1,0 µL buitenste Primers</td>
				<td>1,0 µL innerlijke Primers</td>
			</tr>
<tr>
<td>DNA-sjabloon</td>
				<td>2.0 µL, bij voorbeeld winning (1.2.7)</td>
				<td>2.0 µL, van ronde 1 van PCR (2.2.2)</td>
			</tr>
</tbody></table>
Tabel 2: PCR reactie mengsels voor eerste en tweede amplifications. 
	 
	<ol>
<li>Programma van de thermische cycler als voorheen, maar passen de onthardende temperatuur zodat de binnenste inleidingen (zie tabel 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Agarose Gel elektroforese en beeldvorming
Opmerking: Zie voor basisinstructies DNA scheiden door elektroforese, Lee et al.., 201234.
<ol><li>Bereiden een 1,2% agarose gel met 20 X SB buffer (0,2 M NaOH, pH van 0,8 M-boorzuur 8), verdund tot 1 X, en voeg ongeveer 5 µL van een DNA-vlek, vóór het gieten, desgewenst vooraf kleuring van de gel is.</li>
	<li>10 µL van het product van de tweede (binnenste) PCR reactie van elk experimenteel en controlemonster, naast een 100 bp ladder (5 µL) laden.<ol>
<li>Electrophorese gedurende 1 uur bij 107 V (5V/cm).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bekijken en vastleggen van de gel met een transilluminator en de bijbehorende camera en de software.</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Tientallen jaren van gebruik, PCR-gebaseerde technieken hebben consequent bewezen hun waarde in de opsporing van Borrelia van geleedpotigen en zoogdieren specimens, of Borrelia milieu- of klinische oorsprong vandaan. PCR biedt vele verbeteringen over reeds bestaande benaderingen van toezicht. Met name, het is niet afhankelijk van de ontwikkeling en prestaties van antilichaam reagentia, en in plaats daarvan kan gemakkelijk worden aangepast om op te sporen nieuwe doelstellingen van belang gewoon door aanpassing van de primer sequenties. PCR herbergt ook de evaluatie van meerdere loci parallel, zelfstandig of via een multiplex-reactie. Het kan worden toegepast op diverse specimen ingangen, met inbegrip van vers en gearchiveerde teken22, dier of mens lichaamsvloeistoffen en weefsel gereseceerd25. PCR levert ook waarbij dat verder kan worden verwerkt, bijvoorbeeld door restrictie-enzym spijsvertering, sonde hybridisatie of sequencing, toegenomen inzicht in microbiële identiteit21.
Als een klinische hulpmiddel is PCR conceptueel beter dan de standaard serologische diagnostiek, want het biedt een directe indicatie van bacteriële aanwezigheid, in plaats van te vertrouwen op de immuunrespons van de gastheer als een secundaire maatregel van infectie. Lyme Borreliose is echter geassocieerd met een relatief bescheiden microbiële lasten (< 50 organismen/mL urine of plasma) en tijdelijke spirochetemia, die aanleiding tot vals-negatieve geven kan resultaten25. De gevoeligheid van deze techniek in de kliniek varieert afhankelijk van het weefseltype, fase van de infectie en monster voorwaarde, valt, ergens tussen 12,5% en 62% in bestaande studies van bloed, cerebrospinale vloeistof en biopsied weefsel36. Moleculaire gevoeligheid beperkingen zijn niet een bron van zorg als PCR wordt uitgevoerd na de bacteriële cultuur, maar herstel van levensvatbare spirocheten uit klinische monsters ook uitdagende heeft bewezen. Pas onlangs protocollen zijn geoptimaliseerd voor hogere opbrengst35. Ondertussen, de darm van een geïnfecteerde volwassen teek kan haven gemiddeld overal vanaf 2.000 naar meer dan 50.000 Borrelia37,38,39, die stevig binnen het detectiebereik van nPCR. Het protocol is dus zeer geschikt voor teek toezicht inspanningen.
Ondanks de vele voordelen levert nPCR bepaalde uitdagingen, en het vermogen van deze techniek om nauwkeurig verslag teek besmetting is daarom afhankelijk van strategische selectie van genen en waarbij, nauwgezette experimentele werkstromen die kwaliteit DNA herstellen van specimens terwijl het minimaliseren van de Kruis-blootstelling van monsters, en het gebruik van passende besturingselementen die verontreinigingen in de testomgeving en reagentia kunt melden. Voorafgaand aan elke experimenten, moeten de reikwijdte en de bedoelingen van het onderzoek duidelijk worden omschreven zodat passende genetische loci, en regio's kunnen daarin, worden geselecteerd. Als het doel is om een onbevooroordeelde scherm voor de complexe veroorzaakt door Lyme Borrelia burgdorferi -s.l., inleidingen moeten worden gemaakt om alle van de bijbehorende spanningen met soortgelijke affiniteit gedetecteerd en versterking efficiëntie, zonder vastleggen die geen verband houden organismen25. Nieuwe inleidingen kunnen worden ontworpen en beoordeeld in silico met behulp van softwaretools zoals Primer-BLAST40, hoewel zij ook experimenteel moeten worden gevalideerd tegen standaard referentie isoleert voordat het wordt toegepast op de genfunctieonderzoek monsters. Het doel van de DNA-extractiemethode is te herstellen intact microbiële sjabloon van een gemengd milieu monster (teek homogenaat). Een optionele stap voordat u verdergaat met PCR is het evalueren van de integriteit van het geëxtraheerde DNA. Bovendien kunnen parallelle reacties worden ingesteld te richten een huishouden-gen in de teek. Deze laatste methode kan ook wijzen op de aanwezigheid van remmers in het reactiemengsel, bieden meer vertrouwen wordt gesteld dat negatieve reacties van de Borrelia te wijten aan de afwezigheid van het organisme, en niet op de aanwezigheid van een remmende verontreinigingen zijn.
De verhoogde gevoeligheid van de geneste PCR aanpak gaat ten koste van potentiële verontreiniging die vals-positieve resultaten oplevert. Exogene sjabloon kan worden ingevoerd om een steekproef tijdens teek dissectie en DNA herstel, of bij de oprichting van de uiterlijke en innerlijke amplificatie reacties. Daarom is het vooral belangrijk te volgen beste praktijken protocollen voor PCR om te voorkomen dat de sjabloon of amplicon kruisbesmetting. Voorbeelden hiervan zijn het gebruik van aparte werkplekken met onafhankelijke luchtstromen, insluiting in PCR en biologische veiligheid kasten in voorkomend geval, grondige chemische en fysieke reiniging en sterilisatie van oppervlakken en reagentia, en voorzichtige behandeling van DNA 41. No-template besturingselementen zijn ook essentieel bij het identificeren van de besmetting van de voorraad reagentia. Een bijzondere kwetsbaarheid van nPCR is de amplicon behandeling die optreedt bij het overbrengen van de producten van de eerste reactie in het tweede schip van de PCR. Aangezien de doelDNA heeft al ondergaan exponentiële verrijking in positieve monsters, deze stap is met name gevoelig voor kruisbesmetting en een single-buis nPCR protocol is ontwikkeld om het omzeilen van deze beperking. In deze benadering worden beide reeksen inleidingen voor een bepaald gen samen aan een reactiebuis die gesloten voor beide rondes van PCR31 blijfttoegevoegd. De uiterlijke en innerlijke primerparen moet thermodynamisch distinct, zodanig dat de buitenste paar versterkt sjabloon bij een hoge onthardende temperatuur dat is onbetaalbaar voor de innerlijke inleidingen. In de tweede ronde, wordt de onthardende temperatuur verminderd aan de interne paar. Niet alleen is dit een potentieel storende stap overslaan, het maakt ook het gebruik van extra anti-besmetting maatregelen31,42. Deze wijziging kan echter de gevoeligheid van sommige assay offeren. Ongeacht de benadering, zal verhoging van het aantal technische replicatieonderzoeken onafhankelijk van elkaar uitgevoerd op een monster bijdragen tot het identificeren van valse besmetting.
Moleculaire technieken zijn verder ontwikkeld sinds de invoering van nPCR en deze nieuwere benaderingen select voordelen ten opzichte van de originele ontwerpen, bieden zij bij verhoogde financiële lasten. Zoals de naam al suggereert, kwantitatieve PCR (qPCR of real time (RT)-PCR) voorziet in de opsomming van ziekteverwekkers in een steekproef, terwijl conventionele technieken kwalitatief van aard,43 zijn. De gevoeligheid van qPCR is naar verluidt vergelijkbaar met die van nPCR38, hoewel het afhankelijk van de primer kenmerken28kan fluctueren. Een variatie van qPCR die gebruikmaakt van moleculaire beacons (MB) in plaats van conventionele TaqMan sondes heeft ook aangetoond belofte in het opsporen van Borrelia in klinische monsters44,45,46. Vanwege hun unieke secundaire structuur produceren moleculaire bakens naar verluidt lagere achtergrond fluorescentie en hogere legitieme signalen, waardoor superieure gevoeligheid47. Pre-klinische evaluaties suggereren een mogelijke drempel van de detectie van tussen één en tien spirocheten44,45. Bovendien is de techniek met succes toegepast in multiplex reacties op gelijktijdig detecteren een zoogdieren host gene44 en andere Frühsommer meningo ziekteverwekkers45, die is niet zo gemakkelijk haalbaar met nPCR. Andere ontwerp wijzigingen omvatten droplet digitale PCR (ddPCR) technologie, die DNA zonder het gebruik van een standaard curve39,48 kwantificeren kan. De onderste detectiegrens van deze techniek voor Borrelia is eveneens ongeveer tien spirocheten/monster39. Vergeleken met nPCR, hebben deze benaderingen ook het voordeel van verminderde mogelijkheden voor besmetting, zoals zij alleen een interne versterking-protocol vereisen.
Als het doel van toezicht in plaats daarvan is te profileren van de gevarieerde bacteriële inhoud van een teek, is 16S rRNA metagenomic screening een aantrekkelijke optie49. Hoewel deze benadering duurder is, gespecialiseerde DNA sequencers niet gevonden in alle laboratoria van de moleculaire biologie vereist en verfijnder bioinformatics gebaseerde interpretatie vergt, kan het een breed spectrum van microben meer nauwkeurig vangen vertegenwoordigen de pathogen belasting van de vector.
Terwijl qPCR en derivaten daarvan methoden van keuze voor kwantitatieve toepassingen zijn en metagenomics schermen grote voorraden van de microbiome van de teek leveren, gerichte bewaking inspanningen gaat vaak met binaire rapportage van de aanwezigheid of afwezigheid van een of een paar ziekteverwekkers in een vector. Onder dergelijke omstandigheden kunnen deze nieuwere, meer uitgebreide benaderingen onnodige complexiteit en financiële lasten indienen in het proces. Om deze redenen heeft nPCR doorstaan de tand des tijds als een centrale techniek in de teek testen.

Ziekte van Lyme (LD) is de meest voorkomende vectoren overgedragen infectie op het noordelijk halfrond, en de frequentie blijft toenemen van1. Deze slopende ziekte wordt veroorzaakt door spirocheteal pathogenen van de Lyme borreliose (LB) complexe (kortweg Borrelia burgdorferi sensu lato, of s.l.), die historisch gezien het overheersende Noordamerikaanse pathogene agens, B. omvat burgdorferi sensu stricto (s.s), naast B. afzelii en B. garinii, die algemeen verspreid in Europa en Azië, en soorten klinische relevantie2,3in opkomst zijn. Deze bacteriën worden overgedragen op de mens door de beet van de geïnfecteerde Ixodes teken2. Hoewel de belangrijkste Noord-Amerikaanse vectoren I. scapularis en I. pacificus, meerdere soorten binnen dit geslacht gevonden voor haven en doorgeven van de bacterie-4. Bij de mens kan de B. burgdorferi Multisysteem symptomen op het gebied van de huid, gewrichten, hart, zenuwstelsel, endocriene klieren, gastro-intestinale tractus en inwendige organen5,6,7, 8,9,10. Het Center for Disease Control and Prevention schat momenteel meer dan 300.000 nieuwe gevallen bij de mens jaarlijks in de Verenigde Staten11,12. Terwijl de prognose is vaak gunstig wanneer de ziekte is gediagnostiseerd en behandeld in de vroege stadia, hebben studies gesuggereerd dat ergens tussen 10% en 60% van de patiënten die ontvangen de aanbevolen antibiotische regime blijven symptomen na therapie beëindiging, in een verschijnsel genoemd Post behandeling ziekte van Lyme syndroom (PTLDS)13,14,15. Bovendien, vertragingen in klinische interventie kunnen ontstaan als gevolg van gebrek aan bewustzijn van de beet van een teek, niet-specifieke presentatie van de eerste ziekte, en de lage gevoeligheid van traditionele serologie gebaseerde diagnostiek wanneer gebruikt aan het begin van de infectie. Falen om snel en adequaat te behandelen kan symptoom progressie die manifesteren kan in toenemende mate invaliderende complicaties16,17. Preventie van de ziekte van Lyme is dus een hoeksteen van het risicobeheer. Strategieën ter bestrijding van deze groeiende dreiging robuuste toezichtmaatregelen om aan te geven van de prevalentie van het pathogene agens in teken bevatten en identificeren van de geografische regio's van belang.
Dit artikel demonstreert het nut van geneste polymerase-kettingreactie (nPCR) als een moleculaire screening tool voor het identificeren van besmette teken. Het vergroten van specificiteit, worden twee Borrelia genen gebruikt voor parallelle versterking. Flagellin B (FlaB) codeert een grote gloeidraad proteïne van het flagellum18, en het gen ligt op het enkele lineaire chromosoom, terwijl het lipoproteïne product van de buitenste oppervlakte EiwitA (OspA) teek middendarm bemiddelt kolonisatie, en is van de plasmide-gecodeerde19,20. De werkstroom bestaat uit de collectie van de teek, DNA-extractie, waarna een eerste ronde van PCR te detecteren van Borrelia-specifieke loci. Latere PCR maakt gebruik van het product van de eerste reactie als een nieuwe sjabloon voor het genereren van kleinere, interne versterking fragmenten. Een teek wordt als positief beschouwd voor Borrelia burgdorferi wanneer innerlijke waarbij van beide genen Borrelia kan worden gedetecteerd door agarose gelelektroforese.
Zowel de nPCR techniek, en de FlaB en OspA gene doelen, zijn grote schaal gebruikt voor de ecologische bewaking en klinische opsporing van de Lyme-spirocheet sinds de vroege jaren 199021,22,23 ,24,25. Voorafgaand aan de ontwikkeling van moleculaire protocollen, werden teken onderzocht door gut inhoud te onderwerpen aan anti -Borrelia immunofluorescentie (IF) kleuring, microbiële cultuur of een combinatie daarvan26. Deze benaderingen lijden aan inherente beperkingen, met inbegrip van de trage groei en kieskeurig aard van Borrelia27antilichaam prestatieproblemen en de eis van levende teken voor als verwerking21. PCR werd vervolgens aangenomen om snelle, gevoelige en specifieke identificatie van besmette vectoren. Het aangeboden duidelijke verbeteringen over de traditionele methode, met inbegrip van de directe toepassing van de cultuur-zelfstandige op uiteenlopende specimen typen, zoals dode en gearchiveerde teken dat anders ongeschikt zijn zou voor het testen van21,22 . Geneste experimentele designs verder verbeteren door gebruik te maken van twee verschillende sets van gen-specifieke primers in twee opeenvolgende ronden van versterking25,28op de specificiteit en de gevoeligheid van klassieke PCR.
Experimentele succes is kritisch afhankelijk van strategische gene selectie en amplicon ontwerp. Voor het nauwkeurig inschatten van de aanwezigheid van Borrelia burgdorferi, zouden de inleidingen de desbetreffende ziekteverwekkers detecteren zonder cross-reacting met relapsing fever spirocheten ook in het geslacht Borrelia . In het geval van FlaB, wordt deze specificiteit bereikt door zich te richten een variabele interne regio van het gen, in plaats van de relatief geconserveerde flankeren de opeenvolgingen die worden gedeeld door diverse bacteriën (Figuur 1)24,29 , 30.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56471/56471fig1.jpg"> Figuur 1: het concept van nPCR, zoals geïllustreerd met behulp van Borrelia FlaB gen als een doelwit. De 5' en 3' termini van het gen gelden voor organismen dan Borrelia burgdorferi s.l., waardoor deze regio's niet geschikt zijn voor de specifieke beoordeling van Lyme-veroorzakende ziekteverwekkers. Met behulp van de minder-geconserveerd interieur sequenties als primer doelen, worden twee rondes van PCR uitgevoerd om te detecteren een finale, interne amplicon. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56471/56471fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
In een test van hun discriminerende capaciteit, werden interieur FlaB inleidingen geëvalueerd met meer dan 80 verschillende Borrelia -isolaten, en gevonden om te identificeren alleen die verband houden met de ziekte van Lyme24. De onderste detectiegrens van nPCR is gedocumenteerd op zes24 à tien31 bacteriën uit reincultuur, hoewel de gevoeligheid kan verder worden verbeterd door Southern blotting van de amplicon en kwekers een radioactief gelabelde of chemiluminescentie sonde. Koppeling van de technieken reduceert de drempel detectie tot een enkele spirocheet31. Door directe vergelijking, werd conventionele, unprobed single-ronde PCR gevonden voor het melden van de aanwezigheid van een minimum van 104 spirocheten31. Opgemerkt moet worden, echter dat assay gevoeligheid lager zijn zal bij het werken met complexe milieumonsters en klinische monsters, als gevolg van de overweldigende aanwezigheid van niet-verwante DNA en potentiële remmende stoffen. Deze uitdagingen kunnen grotendeels worden omzeild door het gebruik van nPCR.
Ondanks de vooruitgang in moleculaire technologieën in de afgelopen decennia blijft nPCR een nietje techniek in modern toezicht inspanningen. Als zorg is genomen in het ontwerp en de uitvoering van dit protocol, is het een relatief eenvoudig, krachtige en flexibele benadering te vangen van de aanwezigheid van ziekteverwekkers in teek vectoren.

<table><tbody><tr><td>LabGard Class II, Type A2 biologische veiligheidscabinet</td><td>Nuaire</td><td>ES AIR NU-543&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Veiligheidsmesjes</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>0.22 mm dikte</td></tr><tr><td>Microfugebuisjes (Microtubes 1,5 mL)</td><td>Axygen</td><td>311-08-051</td><td></td></tr><tr><td>AquaGenomic&nbsp;</td><td>MultiTarget Pharmaceuticals</td><td>2030</td><td>DNA-extractiereagens</td></tr><tr><td>Microtube-stamper</td><td>Diamed</td><td>DIATEC610-1551</td><td>Ontworpen voor 1,5 ml buisjes</td></tr><tr><td>Waterbad - Isotemp 202</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-462-2</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Labnet</td><td>S0100 CAN</td><td></td></tr><tr><td>Spectrafuge 24D Digitale Microcentrifuge</td><td>Labnet</td><td>C2400</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>190764</td><td></td></tr><tr><td>BIS-TRIS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9754</td><td></td></tr><tr><td>Primersynthese</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>OLIGO</td><td></td></tr><tr><td>PCR-kabinet</td><td>Misonix</td><td>PCR6-482</td><td></td></tr><tr><td>PCR-buis met bijgevoegde platte doppen 0,2mL</td><td>VWR</td><td>20170-012</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Green Master Mix 2x</td><td>Promega</td><td>M7123</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-vrij water</td><td>Promega</td><td>M7123</td><td>Het water wordt geleverd met de GTG</td></tr><tr><td>Spectrafuge Mini</td><td>Labnet</td><td>C1301</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA-kleuring 10.000X Concentratie</td><td>EDVOTEK</td><td>608</td><td></td></tr><tr><td>Froggarose LE (Agarose voor moleculaire biologie)</td><td>FroggaBio</td><td>A87-500G</td><td></td></tr><tr><td>GD 100 bp DNA Ladder</td><td>FroggaBio</td><td>DM001-R500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Elektroforese-voedingspack&nbsp;</td><td>VWR</td><td>VWR 105</td><td>EC Apparatus Corporation</td></tr><tr><td>Fluor-S MultiImager&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>170-7700 (Serienummer 433B0154)</td><td></td></tr><tr><td>Quantity One 1-D Analysesoftware (V. 4.5.2)</td><td>BioRad</td><td>1709600</td><td></td></tr></tbody></table>

opsporen van de ziekte van lyme-spirocheet, borrelia burgdorferi, in teken met behulp van genestelde pcr

Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

Ziekte van Lyme is een ernstige vectoren overgedragen infectie die wordt veroorzaakt door de Borrelia burgdorferi sensu lato familie van spirocheten, die worden overgebracht via de beet van de geïnfecteerde Ixodes -teken op de mens. Het primaire etiologische agens in Noord-Amerika wordt Borrelia burgdorferi sensu stricto. Als geografische risico gebieden uit te breiden, is het verstandig om ondersteuning van robuuste toezicht-programma's die kunnen meten teek infectie tarieven, en bevindingen communiceren clinici, dierenartsen en het grote publiek. De moleculaire techniek van geneste polymerase-kettingreactie (nPCR) heeft lange tijd gebruikt voor dit doel, en het blijft een centraal, goedkope en robuuste aanpak in het opsporen van Borrelia in zowel de teken en de natuur.
Dit artikel demonstreert de toepassing van nPCR op Vink DNA fragmenten te identificeren van besmette exemplaren. Twee onafhankelijke B. burgdorferi getarget, genen coderen Flagellin B (FlaB) en Outer surface EiwitA (OspA), zijn uitgebreid gebruikt met deze techniek. Het protocol omvat teek collectie, het DNA-extractie en vervolgens een eerste ronde van PCR te sporen elk van de twee Borrelia-specifieke loci. Latere polymerase-kettingreactie (PCR) maakt gebruik van het product van de eerste reactie als een nieuwe sjabloon voor het genereren van kleinere, interne versterking fragmenten. De geneste benadering verbetert zowel de gevoeligheid en specificiteit van conventionele PCR. Een teek wordt beschouwd als positief voor het pathogene agens oplevert wanneer innerlijke waarbij van beide genen Borrelia kan worden gedetecteerd door agarose gelelektroforese.

nPCR is een elegante aanpak te verhogen de specificiteit en de gevoeligheid van de detectie van de ziekteverwekker, met name wanneer complexe milieu monsters onderzocht worden. Zoals afgebeeld in Figuur 1, kunnen twee rondes van PCR gericht op een strategische regio van de Borrelia FlaB locus (en OspA, niet afgebeeld) de aanwezigheid van de bacterie Borrelia burgdorferi door middel van het genereren van korte inner melden waarbij. Wanneer opgelost door elektroforese van het gel, kunnen de FlaB en OspA reactieproducten van elke teek visueel scoorde en vergeleken met de besturingselementen. In Figuur 2, unieke exemplaar-id vindt u langs de bovenkant van elke gel, en neen-template en aërosol besturingselementen zijn vertegenwoordigd helemaal links en rechts, respectievelijk, grenzend aan de ladders.
Robuuste amplicon bands zijn duidelijk zichtbaar in select experimentele monsters, en ze zijn gemakkelijk onderscheiden van overtollige primers en resterende DNA (Figuur 2). Gebaseerd op de beginselen van de proefopzet uiteengezet, een teek wordt als positief beschouwd voor Borrelia wanneer parallelle negatieve controles tonen geen versterking, en innerlijke waarbij zijn vervaardigd uit zowel FlaB en OspA inleidingen. In dit geval voldaan exemplaren T907, T604 en T606 aan toezicht criteria voor het Lyme-pathogeen (Figuur 2). By contrast, T923 was alleen positief voor OspA, een uitkomst waarvoor er meerdere mogelijke verklaringen zijn: A) de teek van oorsprong was negatief voor Borrelia, maar de buitenste of binnenste OspA PCR voorbereiding onecht besmet was met sjabloon DNA (merk op dat systemische besmetting van reagentia werd uitgesloten via negatieve controles), B) de teek die Lyme Borrelia, maar lage sjabloon bedragen of experimentele fout voorkwam versterking van FlaB, of C) een organisme aanwezig was die bevatte de geconserveerde OspA -reeks, maar miste Flagellin of onvoldoende identiteit in het gerichte gebied van FlaB te ontharden aan de inleidingen had. Inderdaad, OspA reeks overeenkomsten hebben opgemerkt in een verscheidenheid van organismen, met inbegrip van planten en dieren28. De omgekeerde situatie, versterking van de meer bewaard Flagellin gen, maar niet het OspA -gen, kan duiden op een Borrelia soorten. In de praktijk levert dit protocol meer OspA single-positieve resultaten dan de FlaB primers, suggereert dat scenario 'A' de minst waarschijnlijke verklaring is. Zonder verdere experimentele analyse van het omstreden model, echter is het niet mogelijk om de bron van het single-positieve resultaat te bepalen. Verhoging van het aantal technische replicatieonderzoeken uitgevoerd op monsters die zijn dubbelzinnig kan helpen met elkaar te verzoenen hun werkelijke status, omdat eventuele verontreinigingen die onecht werden ingevoerd om de vorige reacties zou niet in de gearchiveerde DNA aanwezig. Echter als volgende reacties met deze inleidingen niet afdoende resultaten opleveren, kunnen andere loci Borrelia door PCR worden onderzocht. Waarbij gegenereerd op basis van deze reacties kunnen ook worden sequenced en vergeleken tussen isolaten bij het toewijzen van identiteit, en de raming van de mate van divergentie van de stam. SAPI en collega's bieden een voorbeeld van deze workflow met menselijke klinische monsters35.
Alle factoren rekening gehouden, de geschetste protocol en interpretatie criteria zijn geraamd aan opbrengst van valse positieve en valse negatieve tarieven van 0,17% en 0.0063%, respectievelijk.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56471/56471fig2.jpg"> Figuur 2 : Detectie van Borrelia burgdorferi in individuele teken door nPCR van FlaB en OspA. Codes die zijn toegewezen aan elke teek worden weergegeven aan de bovenkant van de gels en identiteiten om te melden het opsporen van OspA en FlaB in elk monster verticaal uitlijnen. Rijstroken recht B aan de linkerkant van de besturingselementen voor afbeeldingen vertegenwoordigen neen-template, terwijl een (rechterhand rijstroken) aërosol besturingselementen te vangen van de besmetting van de labo-omgeving. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56471/56471fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Genestelde PCR is een eenvoudig, gevoelige en specifieke techniek die kan worden toegepast op de teek die DNA geëxtraheerd om sonde voor Borrelia burgdorferi, de verwekker van de ziekte van Lyme. De eerste PCR experiment maakt gebruik van gen-specifieke primers voor het genereren van lange waarbij, die vervolgens worden sjablonen voor een latere reactie met behulp van interne inleidingen.

Opsporen van de ziekte van Lyme-spirocheet, Borrelia Burgdorferi, in teken met behulp van genestelde PCR

Lyme disease is a serious vector-borne infection that is caused by the Borrelia burgdorferi sensu lato family of spirochetes, which are transmitted to ...

Lyme-ziekte is een invaliderende ziekte veroorzaakt door de spirochetenpathogeen Borrelia burgdorferi sensu lato. De bacterie wordt op mensen overgedragen via de beet van een geïnfecteerde teek en veroorzaakt symptomen in meerdere systemen die de huid, gewrichten, hart en het zenuwstelsel kunnen aantasten. Dagelijkse activiteiten zoals het uitlaten van honden en wandelen kunnen mensen een verhoogd risico geven op het oplopen van Lyme-ziekte.Strategieën om deze groeiende dreiging te bestrijden omvatten daarom robuuste bewakingsmaatregelen die de prevalentie van de ziekteverwekker in teken kunnen aangeven en geografische regio's van belang kunnen identificeren. Deze video demonstreert het nut van geneste polymeerketenreactie als moleculair screeningsinstrument voor Borrelia. Om specifieker te zijn, zijn zowel het A-gen van het buitenoppervlak van het eiwit als het flagelline B-gen het doelwit voor amplificatie.De workflow begint met het verzamelen van teken, DNA-extractie en vervolgens een eerste ronde PCR om Borrelia-specifieke loci te detecteren. De tweede ronde PCR gebruikt het product van de eerste reactie als een nieuw sjabloon om kleinere interne amplificatiefragmenten te genereren. Een teek wordt als positief beschouwd voor de ziekteverwekker wanneer interne amplicons van beide Borrelia-genen kunnen worden gedetecteerd door agarose-gelelektroforese.Passieve bewaking roept de hulp in van burgers en dierenartsen om teken te verzamelen en in te dienen voor testen. Als onderdeel van dit proces is het belangrijk om informatie te verzamelen zoals de gastheer van de teek, de datum en de locatie van de ontmoeting. In het laboratorium moeten teken eerst worden gefotografeerd en geïdentificeerd op basis van morfologische vergelijking met standaardsleutels.De gevoeligheid van geneste PCR maakt deze techniek kwetsbaar voor besmetting, dus elke fase van de monsterverwerking moet in een aparte, schone locatie plaatsvinden en er moeten meerdere controles worden opgenomen om ervoor te zorgen dat de reagentia en omgeving vrij zijn van verontreinigingen. Zodra de werkruimte geschikt is voorbereid, biject de teek in een gesteriliseerde biologische veiligheidskast en plaats de helft in een microcentrifugebuisje. Elke DNA-isolatieprocedure die een PCR-compatibel sjabloon oplevert, kan worden gebruikt.Deze video demonstreert een eenvoudige chelatie-gebaseerde DNA-extractie. Om te beginnen, voegt u een geschikt volume van de lytische chelatiebuffer toe, afhankelijk van de grootte van het teekfragment, en homogeniseert u met behulp van een microbuispestel. Incubeer de monsters in een waterbad op 60 graden Celsius gedurende 45 minuten, vortex en centrifugeer vervolgens de inhoud.Tijdens het wachten, bereidt u verse microcentrifugebuisjes voor elk monster voor door 50 micrometer isopropanol te doseren. Breng het supernatant over in de nieuwe microcentrifugebuis, meng door inversie en centrifugeer opnieuw zoals eerder. Gooi dit keer het supernatant weg en spoel het DNA-pellet met 70%ethanol.Verwijder restvloeistof met een pipette en laat het pellet 15 minuten bij kamertemperatuur aan de lucht drogen. Voeg tenslotte 50 micrometer van 1-millimolair Tris toe aan elk pellet en incubeer gedurende één uur in een waterbad van 60 graden om het DNA op te schorten. Steekjes kunnen nu worden bewaard bij min 20 graden Celsius voor toekomstige moleculaire analyses.Begin met het steriliseren van een PCR-kast met UV-licht en 70%ethanol. De reactiecocktail bestaat uit mastermix met de polymerase, water, voorwaartse en achterwaartse buitenprimers en het DNA dat in de vorige procedure is geëxtraheerd. Afzonderlijke reacties worden ingesteld om OspA en FlaB onafhankelijk in elk teekmonster te detecteren.Pulseer de monsters en plaats ze in een thermische cycler en programmeer de machine. Het initiële PCR-experiment gebruikt genspecifieke buitenprimers die lange amplicons produceren. PCR-producten van de eerste reactie worden vervolgens het sjabloon voor verdere amplificatie.Deze geneste PCR gebruikt genspecifieke primers die binnen de eerste amplicon aanhechten om nieuwe, kortere DNA-fragmenten te produceren. Het product van de tweede reactie kan nu naast een moleculair massareferentieladder op een 1,2% agarose-gel worden geladen en gedurende een uur geëlektroforeerd. Bekijk tenslotte de gel met behulp van een transilluminator.In dit voorbeeld vertegenwoordigt elke baan een ander teekmonster, geanalyseerd voor zowel OspA als FlaB. Amplicons zijn aanwezig in slechts enkele van de banen. Hoewel deze twee monsters beide PCR-producten voor OspA hebben gegenereerd, heeft slechts één van hen FlaB vastgelegd.Een monster moet banden produceren voor beide genen om als positief te worden beschouwd. Visuele inspectie van PCR-producten maakt het mogelijk om de Borrelia-status van elke teek te bepalen. Over het algemeen is geneste PCR een gevoelige, specifieke en relatief eenvoudige techniek die kan worden toegepast op Borrelia-bewaking.Gegevens die uit dergelijke initiatieven worden gegenereerd, kunnen helpen om geografische regio's van belang voor Lyme-ziekte te identificeren en de prevalentie van deze ziekteverwekker in de natuur te schatten.

detecting-lyme-disease-spirochete-borrelia-burgdorferi-ticks-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De ziekte van Lyme studies vereisen vaak generatie van de teken besmet met de ziekteverwekker Borrelia burgdorferi, een proces dat normaal gesproken duurt enkele weken. Hier laten we zien een micro-injectie-based tick infectie procedure die kan worden bereikt binnen enkele uren. We tonen ook aan een immunofluorescentie methode voor het in situ lokalisatie van B. burgdorferi in teken.

Methoden voor snelle overdracht en localisatie van Lyme pathogenen in de Tick Gut

De ziekte van Lyme is de meest gerapporteerde vector overgedragen ziekte in Noord-Amerika. De verwekker, Borrelia burgdorferi is een spirocheet bacterie overgedragen door Ixodes teken. Transmissie en detectie van infectie bij diermodellen wordt geoptimaliseerd door het gebruik van teek voeding, die hier beschreven.

Voederen van Ticks on Animals voor Transmissie en Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

In vitro transcriptie assays kunnen de mechanismen van transcriptionele regulatie in Borreliella burgdorferi ontcijferen. Dit protocol beschrijft de stappen om B. burgdorferi RNA polymerase te zuiveren en in vitro transcriptiereacties uit te voeren. Experimentele benaderingen met behulp van in vitro transcriptietests vereisen betrouwbare zuivering en opslag van actief RNA-polymerase.

Essentiële componenten van Borreliella (Borrelia) burgdorferi In Vitro Transcriptie Assays

Het vermogen van bacteriofaag om DNA tussen bacteriële cellen te verplaatsen, maakt ze effectieve hulpmiddelen voor de genetische manipulatie van hun bacteriële gastheren. Hier wordt een methodologie gepresenteerd voor het induceren, herstellen en gebruiken van φBB-1, een bacteriofaag van Borrelia burgdorferi, om heterologe DNA te transduceren tussen verschillende stammen van de ziekte van Lyme spirocheet.

Faag-gemedieerde genetische manipulatie van de ziekte van Lyme Spirochete Borrelia burgdorferi

In vitro kweek is een directe detectiemethode voor de aanwezigheid van levende bacteriën. Dit protocol beschrijft methoden voor de kweek van diverse Borrelia spirocheten, waaronder die van het Borrelia burgdorferi sensu lato-complex, recidiverende koorts Borrelia-soorten en Borrelia miyamotoi.  Deze soorten zijn kieskeurig en langzaam groeiend, maar kunnen worden gekweekt.

Teeltmethoden van Spirocheten uit Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex en Relapsing Fever Borrelia

Een driekanaals dual-reporter fluorescentiestroomanalysesysteem werd gebruikt om een op kralen gebaseerde multiplex-immunoassay te ontwikkelen die tegelijkertijd serummonsters evalueert voor IgG en IgM die worden opgewekt tegen meerdere antigenen van verschillende Borrelia-soorten die Lyme-borreliose veroorzaken in Europa en Noord-Amerika.

Gelijktijdige detectie van verschillende antilichaamklassen in een gemultiplexte serologische test

In deze studie werd een dot-blot-applicatie ontworpen om Leptospira te detecteren van de drie belangrijkste clades in watermonsters. Deze methode maakt de identificatie mogelijk van minimale DNA-hoeveelheden die specifiek het doelwit zijn van een digoxigenine-gelabelde sonde, die gemakkelijk kan worden gedetecteerd door een anti-digoxigenine-antilichaam. Deze aanpak is een waardevol en bevredigend instrument voor screeningsdoeleinden.

Polymerasekettingreactie en dot-blot-hybridisatie voor leptospira-detectie in watermonsters

Dit artikel presenteert de methodologie voor het blootstellen van mensen aan larvale Ixodes scapularis voor klinisch onderzoek. De techniek is relatief eenvoudig, acceptabel voor de onderzoeksvrijwilligers en kan worden aangepast aan de experimentele behoeften. Dergelijk onderzoek met menselijke proefpersonen moet worden uitgevoerd volgens protocollen voor klinisch onderzoek die zijn goedgekeurd door de bevoegde regelgevende instanties.

Een model voor experimentele blootstelling van mensen aan larvale Ixodes scapularis-teken

De Solaris qPCR Gene Expression Assays zijn nieuwe vooraf ontworpen qPCR primer / probe met het doel de qPCR proces te vereenvoudigen zonder dat de specificiteit en robuustheid van de test.

Kwantitatieve real-time PCR met behulp van de Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR) is een doeltreffend instrument om mRNA niveaus te diagnosticeren in verschillende insecten weefsels en ontwikkelingsstadia. In dit rapport tonen we het gebruik van de qRT-PCR na te gaan mRNA niveaus in de verschillende weefsels en larvale ontwikkelingsstadia van de invasieve soorten insecten, smaragd as boor.

Analyse van genexpressie in Emerald Ash Borer ( Agrilus planipennis) Met behulp van kwantitatieve Real Time-PCR

Leer geneste PCR om Borrelia burgdorferi in teken op te sporen voor surveillancedoeleinden. Deze methode richt zich op OspA- en FlaB-genen om de gevoeligheid en specificiteit van de detectie te verhogen.

Opsporen van de ziekte van Lyme-spirocheet, Borrelia Burgdorferi, in teken met behulp van genestelde PCR

Meer video's verkennen