Name: Tot vaststelling van Muismodellen voor Zika-Virus-geïnduceerde neurologische aandoeningen met behulp van intracerebrale injectie strategieën: embryonale, Neonatale en volwassen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Leer een chirurgische methode voor intracerebrale Zika-virusinfectie in muizen op embryonale, neonatale en volwassen leeftijd. Deze techniek ondersteunt onderzoek naar virale pathogenese en neuroontwikkelingsstoornissen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs wil erkennen Dr. Abdellatif Benraiss bij de Universiteit van Rochester voor zijn mentorschap en de discussies relevant zijn voor het leren van de volwassene chirurgische en neonate technieken. De auteurs wil ook erkennen Dr. James Lauderdale op UGA voor het gebruik van zijn stereotaxic apparatuur en discussies aan het opzetten van de methodologie voor deze techniek, en de vooruitgang voor onderzoek College wetenschappers (ARCS) Stichting voor gerelateerde hun en onze ondersteuning van NIH (NINDS grants R01NS096176-02, R01NS097231-01, en F99NS105187-01).

Alle dier gebruik protocollen volgen de richtlijnen van de verzorging van de dieren van de University of Southern California en de University of Georgia. Euthanasie methoden voor zwangere dammen en volwassenen worden uitgevoerd volgens goedgekeurde protocollen: kooldioxide verstikking, gevolgd door cervicale dislocatie als secundaire methode om euthanasie. Neonatale pups zijn euthanized door onthoofding.
Let op: Het volgende protocol omvat de behandeling van een pathogene virus. Juiste voorzorgsmaatregelen moet worden getroffen tijdens het verwerken van het virus. Alle protocollen moeten worden goedgekeurd door de bevoegde institutionele Commissie vóór gebruik.
1. embryonale intracerebrale inoculatie van Zika-Virus
<ol><li>Voor getimede zwangere paring, kunt u overwegen middag van de dag na de paring als E0.5. Paar muizen aan het eind van de dag en selectievakje stekkers in de vroege ochtend om de variabiliteit van de paring van de tijd.</li>
	<li>De glazen naald vóór de ingreep voor te bereiden. Trek de naald en knipt bij 1/3 de lengte en daarna verscherpen op een hoek van 45° met behulp van een micropipet grinder met een druipneus totdat de porie is KMO's tot 50-70 µm. Check naald tips onder een stereoscoop voor kwaliteit en breuk.</li>
	<li>Houd het virus aliquoot op ijs. Net vóór de operatie, de ZIKV injectie mix in de naald van de injectie bereid glas te laden. De gasdichte injectiespuit (50 µL volume), luer-lock bijlage en buis monteren, en verzadigen van de geassembleerde spuit met de slang met minerale olie. Eenmaal verzadigd, hechten de naald en teken ~ 6-7 µL ZIKV in de naald (~ 1 µL is 1.7 × 10-6 TCID50/mL).</li>
	<li>Injecteren van zwangere C57BL/6J of 129S1/SvImJ muizen met embryonale dag E14.5 embryo's (voor intracraniële injectie) of E10.5-embryo's (voor anticonceptie injectie) met ketamine hydrochloride (80-100 mg/kg) en xylazine (5-10 mg/kg) verdund in een steriele zoutoplossing intraperitoneally voor het opwekken van verdoving in de moeder. U kunt ook anesthetize moeders met gecontroleerde Isofluraan Isofluraan geboden door inademing, met het afgas opruiming, indien van toepassing. Buprenorfine-SR (0.5-1.0mg/kg) subcutaan te induceren analgesie te injecteren.</li>
	<li>Snuifje test verdoofd moeders op de teen tip of staart en dan leg ze liggende op een dier-goedgekeurde verwarming pad (thermische pad van 100 x 200 2.5 mm). De teen snuifje verlostang zijn niet steriel en worden niet gebruikt voor het verwerken van weefsel in de chirurgie. Gehandschoende handen kunnen ook, worden gebruikt voor het testen van de teen reflex voor de terugtrekking van de snuifje. Nota: Verwijs naar uw institutionele veterinair personeel voor de voorkeur perioperatieve verwarming methode. Een cover werd geplaatst tussen deze verwarming pad en het dier.</li>
	<li>Ophthalmic zalf toevoegen aan de ogen.</li>
	<li>Het oppervlak van de buik scheren en steriliseren met jodium en alcohol driemaal. Alternatieve jodium en alcohol veegt; Veeg in een draaiende beweging uit de buurt van de chirurgische site.</li>
	<li>Drape de huid rondom de chirurgische site met steriele doeken om verontreiniging van de incisie en de instrumenten te voorkomen. Opmerking: De gordijn opening mag niet groter zijn dan de bereid chirurgische site; geen haar moet worden gezien in de opening van het gordijn.</li>
	<li>Knijp de Moederdag huid weg van haar buik met een tang en snijd de onderbuik in een 1-1,5 cm lijn bij de mediale Sagittaal lijn met een steriele chirurgische schaar. Dit snijdt in de huid en verder in de buikholte, zodat de embryo's nu worden blootgesteld. Opmerking: Chirurgische schaar worden gebruikt om de incise van de huid en peritoneale laag. Steriele instrumenten en handschoenen worden gebruikt voor elke operatie.</li>
	<li>Knip een gleuf in het midden van een kleine steriel gaas en bovenop de chirurgische opening van toepassing. Hydrateren met een steriele zoutoplossing. Trek de embryo's door de gleuf te rusten op het steriele gaas, met zorg niet meer dan 4-5 embryo's zich te concentreren op een baarmoeder-hoorn in één keer verwijderen.</li>
	<li>Hydrateer de embryo's met steriele zoutoplossing voorafgaand aan en tijdens de inoculatie om ervoor te zorgen dat ze niet uitdrogen. Bijhouden van welke embryo's worden geïnjecteerd en hun locatie binnen de baarmoeder hoorn. Individuele embryo's worden dus behandeld als aparte experimenten, zoals embryo's standpunt niet wijzigen terwijl de ontwikkeling in utero. (Stap 1.15 voor anticonceptie injectie blijven).</li>
	<li>Voorzichtig plaats een spatel onder het hoofd van het embryo. Verlichten de embryo's ook met een lamp te visualiseren van het hoofd en schedel hechtingen. Opmerking: Aseptische techniek wordt gevolgd, met inbegrip van steriele chirurgische handschoenen en instrumenten. Na niet-steriele items (zoals het licht) worden gemanipuleerd, handschoenen moeten worden vervangen door nieuwe steriele handschoenen vóór behandeling steriele instrumenten en gebieden.</li>
	<li>Positie het hoofd door het manipuleren van het embryo met zowel de lamp (achter het hoofd voor zichtbaarheid) en de vrije vingers totdat het hoofd van het embryo is rechtstreeks tegen de baarmoederwand opgedreven en op zijn plaats met de niet-dominante hand gehouden. Opmerking: Positionering van het embryo is een cruciaal onderdeel en de techniek die de meeste praktijk neemt. Teveel vinger druk kan schade aan de embryonic membranen leidt tot letaliteit en niet genoeg druk de injectie kan bemoeilijken.</li>
	<li>Gebruik de bloedvaten loopt langs de schedel hechtdraad als een gids. Injecteren ZIKV virus (~ 1 µL, 1.7 × 10-6 TCID50/mL Mexicaanse isoleren MEX1-44) in de laterale ventrikels van E14.5 embryo hersenen met de geassembleerde spuit en naald. Control media gebruiken als een schijnvertoning injectie.</li>
	<li>Vermijd om te verbeteren retentie van de zwangerschap, virale injectie van de twee embryo's naast de eierstokken en de twee embryo's naast de bovenste vagina (figuur 1A). Over het algemeen worden niet meer dan 6 embryo's geïnjecteerd per nest te verminderen van het tijdstip van de operatie en embryo verlies te voorkomen.</li>
	<li>Plaats de ingespoten embryo's terug in de zwangere dammen, en vul de buikholte met ~ 0,5 mL steriele zoutoplossing. Sluiten, eerst suture zowel de peritoneale buikspier en vervolgens in de tweede suture de externe huidlaag met 4.0 steriele hechtingen. Het is beter om het gebruik van onderbroken hechtingen; Er is mogelijkheid voor wond dehiscentie als de muis de hechtdraad kauwt.</li>
	<li>Plaats de muis in een kooi gedeeltelijk rustend op een verwarming pad dat de muis te ontsnappen naar een niet verwarmde gebied indien nodig. Monitor de moeders terwijl ze herstellen (1-2 h) van anesthesie. Ontwikkelen de embryo's na chirurgie voor gevarieerd tijden volgens individuele experimenten.</li>
	<li>
Uteriene injectie
	<ol>
<li>Met een baarmoeder hoorn en embryo's blootgesteld, gebruik een 1 mL spuit en 27G naald te injecteren 100 μl Zika virus (106 TCID50 eenheden gesuspendeerd in 100 μl DMEM), of controle medium, in de uteriene ruimte of in de placenta weefsel. Opmerking welke embryo's zijn ingespoten voor ontledingen van de embryonale fase. Zie eerder gepubliceerde werken voor meer details18.</li>
		<li>Plaats van ingespoten embryo's terug in de zwangere dammen, en vul de buikholte met ~ 0,5 mL steriele zoutoplossing. Sluiten, eerst suture de peritoneale buikspier en vervolgens in de tweede suture de externe huidlaag met 4.0 steriele hechtingen. Het is beter om het gebruik van onderbroken hechtingen; Er is mogelijkheid voor wond dehiscentie als de muis de hechtdraad kauwt.</li>
		<li>Plaats de muis in een kooi gedeeltelijk rustend op een verwarming pad dat de muis te ontsnappen naar een niet verwarmde gebied indien nodig. Monitor de moeders terwijl ze herstellen (1-2 h) van anesthesie. Ontwikkelen de embryo's na chirurgie voor gevarieerd tijden volgens individuele experimenten.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. de neonatale intracerebrale inoculatie van Zika-Virus: P0/P1
<ol><li>Zorg ervoor dat de gasdichte injectiespuiten (10 µL volume) en de naalden zijn niet verstopt. Reinigen en testen door het laden van de drie 20 mL disposable spuiten met 26-gauge naalden: een met zoutoplossing, een met 70% ethanol, en een met lucht te wissen van de oplossingen. Steriliseren met 10% bleekwater als eerder gebruikt voor virus injectie.</li>
	<li>Houd virus op ijs. Laad de spuit door vullen met zoutoplossing om dood volume in de spuit, en tekenen van 0,75 µL van lucht te scheiden van de zoutoplossing van het materiaal van de injectie.</li>
	<li>Instellen van een verwarmde bevochtigde herstel kamer voor ingespoten pups. Met behulp van een blok van Verwarming, plaats een afgesloten container (zoals een lege tip box) met een steriel gaas en humidify met zoutoplossing. Verwarm het vóór het opstarten van injecties.</li>
	<li>De microinjector met inbegrip van de pomp en de controller instellen. De apparaatcode die type voor de specifieke spuit bepalen (dat wil zeggen, voor een 10 µL spuit, het apparaattype is "D"). Bepaal de snelheid van de injectie.</li>
	<li>Verzamel de postnatale dag 0 of 1 pups (P0/P1) in de omgeving van het chirurgische setup. De injectiespuit met virus worden geladen. Desinfecteren van de pup hoofd montering met 70% EtOH.</li>
	<li>Wikkel de pups in een dun laagje gaas en hen volledig te begraven in ijs om een verdoving staat. Pups zijn cryoanesthetized voor 5 min. Zorg ervoor dat de pups zijn voldoende verdoofd voor injectie door het uitvoeren van een staart/teen snuifje zonder reactie. Dit levert ongeveer 15 min van een verdoving staat.</li>
	<li>Plaats van de pup op hoofd mount, steriliseren van het oppervlak van het hoofd met jodium en ethanol (drie keer) en vervolgens veeg droog met een steriel doekje (isopropanol of 70% EtOH).</li>
	<li>Lambda markeren met een zwarte marker en registreren de coördinaten op lambda met behulp van het stereotaxic instrument. Maatregel de afstand van lambda aan de rand van het oog en het begin van de stereotaxic coördinaten van lambda berekenen van de afstand van de 2/5 van de lambda voor het oog (voor beide halfronden als u zijn het injecteren van beide).</li>
	<li>Vinkt de verdoving diepte voordat een gat voor de injectieplaats. Gebruik een 26-gauge naald om zorgvuldig en oppervlakkig de hoofdhuid en de schedel op de locatie van de injectie (de schedel is zeer zacht bij pasgeborenen) als u wilt maken van een opening voor de injectie naald punctie.</li>
	<li>De injectie naald lager in de geperforeerde locatie, en zodra de naald heeft net het overtreden van de huid, bereken een 1 mm diepte voor de injectieplaats (laterale ventrikel) met behulp van het stereotaxic instrument.</li>
	<li>Zodra de naald wordt verlaagd tot de diepte van de injectie, programma de microinjector te injecteren: 1 µL van virus, met een snelheid van 10 nL/s, injecteren van ongeveer 1 µL meer dan 1,5 min (~ 1 μl 3.4 x 105 TCID50/mL ZIKV).</li>
	<li>Wanneer de injectie is voltooid, wacht 30 s, en intrekken van de naald in stappen van 0,5 mm door het draaien van de schroef (dorsally), wachten 30 s na elke increment. Opmerking: Dit vermindert lekkage van ingespoten virus.</li>
	<li>Zodra verwijderd, hetzij snel laden de naalden en spuiten met meerder virus (verschillende virussen of mock besturingselementen moeten worden geladen in aparte injectiespuiten/naalden) of verwijderen van de pup uit het hoofd mount voor de voorverwarmde bevochtigde kamer. Volgen de pup om de paar minuten te meten van herstel. Vervang de pups met haar nest.</li>
</ol>3. volwassen intracerebrale inoculatie van Zika-Virus
<ol><li>Injecteren van volwassen muizen intraperitoneally met ketamine hydrochloride (80-100 mg/kg) en xylazine (5-10 mg/kg) verdund in een steriele zoutoplossing voor het opwekken van de verdoving. Buprenorfine-SR (0.5-1.0mg/kg) subcutaan te induceren analgesie te injecteren. Teen/staart knijpen de muis om te zorgen dat de verdoving staat en dit vervolgens koppelen op de stereotaxic instrument (met een verwarming pad) om te immobiliseren het hoofd tijdens de operatie.</li>
	<li>Ophthalmic zalf toevoegen aan de ogen om te voorkomen dat de ogen van de muis uitdrogen tijdens de operatie. Scheren van de hoofdhuid starten achter de ogen naar het begin van de oren. Steriliseren van de blootgestelde huid met jodium en 70% EtOH driemaal. Alternatieve jodium en alcohol veegt; Veeg in een draaiende beweging uit de buurt van de chirurgische site.</li>
	<li>Vinkt de verdoving diepte vóór het gebeuren van de huid. Met behulp van een scalpel, maak een incisie 0.5 cm langs de mediale Sagittaal lijn van het hoofd in de gesteriliseerde locatie, bregma bloot. Een afrollen met een applicator katoen-tipped, schakelt u het oppervlak van de schedel van meningeal weefsels, terwijl het tegelijkertijd duwen de huid van de bezienswaardigheden van de injectie.</li>
	<li>Vanaf bregma, aanpassing van de chirurgische boor en identificeren van de sites van de injectie met behulp van de volgende coördinaten: AP -0,5 mm, ML: +/-1,5 mm. met behulp van het voetpedaal controle, boren in schedel langzaam over het bot alleen boren totdat een gat voor de naald is gewist.</li>
	<li>Vervang de boor met de microinjector pomp en gasdichte spuiten (10 µL volume) op de stereotaxic. Het verlaten van een kleine luchtbel tussen de zoutoplossing en het virus, trekken ~ 4-5 µL van het virus. De apparaatcode die type voor de specifieke Pompvolume (ie, D voor 10 μL volume spuit) bepalen. Verlagen van de naald aan DV:-1.5 mm van het oppervlak van de hersenen. Program om te injecteren 1 µL van virus, een snelheid van 10 nL/s, injecteren van ongeveer 1 µL meer dan 1,5 min.</li>
	<li>Wanneer de injectie is voltooid, wacht 30 s, en verwijder de naald in stappen van 0,5 mm, wachten 30 s na elke beurt. Dit vermindert terugvoer en lekkage van het geïnjecteerde virus.</li>
	<li>Wanneer de injection(s) zijn klaar, gebruik pincet los van de huid te herstellen van de blootgestelde schedel. Sutuur (geologie) de hoofdhuid terug samen met behulp van 4.0 hechtingen en verwijder de muis uit de stereotaxic instrument. Plaats de muis in een kooi gedeeltelijk rustend op een verwarming pad dat de muis om te ontsnappen naar een niet verwarmde gebied indien nodig en controleren terwijl ze herstellen (1-2 h) van anesthesie.</li>
</ol>

<ol><li>Dreher, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrum+of+Disease+and+Outcome+in+Children+with+Symptomatic+Congenital+Cytomegalovirus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+of+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Spectrum of Disease and Outcome in Children with Symptomatic Congenital Cytomegalovirus Infection.</a> J of Pediatr. 164 (4), 855-859 (2014).</li>
<li>Lanzieri, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+outcomes+of+children+with+symptomatic+congenital+cytomegalovirus+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+of+Perinatol%22%5BJournal%5D)">Long-term outcomes of children with symptomatic congenital cytomegalovirus disease.</a> J of Perinatol. 37 (7), 875-880 (2017).</li>
<li>Naseer, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+WDR62+mutation+causes+primary+microcephaly+in+a+large+consanguineous+Saudi+family%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Saudi+Med%22%5BJournal%5D)">A novel WDR62 mutation causes primary microcephaly in a large consanguineous Saudi family.</a> Ann Saudi Med. 37 (2), 148-153 (2017).</li>
<li>Abuelo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcephaly+Syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Pediatr+Neurol%22%5BJournal%5D)">Microcephaly Syndromes.</a> Semin Pediatr Neurol. 14 (3), 118-127 (2007).</li>
<li>Nicholas, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WDR62+is+associated+with+the+spindle+pole+and+is+mutated+in+human+microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">WDR62 is associated with the spindle pole and is mutated in human microcephaly.</a> Nat Genet. 42 (11), 1010-1014 (2010).</li>
<li>Pulvers, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+mouse+Aspm+%28abnormal+spindle-like+microcephaly+associated%29+cause+not+only+microcephaly+but+also+major+defects+in+the+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mutations in mouse Aspm (abnormal spindle-like microcephaly associated) cause not only microcephaly but also major defects in the germline.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (38), 16595-16600 (2010).</li>
<li>Shao, Q., Herrlinger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus+infection+disrupts+neurovascular+development+and+results+in+postnatal+microcephaly+with+brain+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zika virus infection disrupts neurovascular development and results in postnatal microcephaly with brain damage.</a> Development. 143 (22), 4127-4136 (2016).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus+Disrupts+Neural+Progenitor+Development+and+Leads+to+Microcephaly+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Zika Virus Disrupts Neural Progenitor Development and Leads to Microcephaly in Mice.</a> Cell Stem Cell. 19 (5), 672(2016).</li>
<li>Miki, T., Fukui, Y., Takeuchi, Y., Itoh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+study+of+the+effects+of+prenatal+X-irradiation+on+the+development+of+cerebral+cortex+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">A quantitative study of the effects of prenatal X-irradiation on the development of cerebral cortex in rats.</a> Neurosci Res. 23, 241-247 (1995).</li>
<li>Cragan, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population-based+microcephaly+surveillance+in+the+United+States%2C+2009+to+2013%3A+An+analysis+of+potential+sources+of+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res+Part+A+Clin+Mol+Teratol%22%5BJournal%5D)">Population-based microcephaly surveillance in the United States, 2009 to 2013: An analysis of potential sources of variation.</a> Birth Defects Res Part A Clin Mol Teratol. 106 (11), 972-982 (2016).</li>
<li>Cragan, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baseline+Prevalence+of+Birth+Defects+Associated+with+Congenital+Zika+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22MMWR+Morb+Mortal+Wkly+Rep%22%5BJournal%5D)">Baseline Prevalence of Birth Defects Associated with Congenital Zika Virus.</a> MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 66 (8), 219-220 (2017).</li>
<li>Mlakar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus+Associated+with+Microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Zika Virus Associated with Microcephaly.</a> N Engl J Med. 374 (10), 951-958 (2016).</li>
<li>Jaenisch, T., Rosenberger, D., Brito, C., Brady, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+of+microcephaly+after+Zika+virus+infection+in+Brazil%2C+2015+to+2016%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+World+Health+Organ%22%5BJournal%5D)">Risk of microcephaly after Zika virus infection in Brazil, 2015 to 2016.</a> Bull World Health Organ. 95 (3), 191-198 (2017).</li>
<li>Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+developmental+time+across+mammalian+species%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Translating developmental time across mammalian species.</a> Neuroscience. 105 (1), 7-17 (2001).</li>
<li>Driggers, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus+Infection+with+Prolonged+Maternal+Viremia+and+Fetal+Brain+Abnormalities%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Zika Virus Infection with Prolonged Maternal Viremia and Fetal Brain Abnormalities.</a> N Engl J Med. 374 (22), 2142-2151 (2016).</li>
<li>Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+development+in+rodents+and+humans%3A+Identifying+benchmarks+of+maturation+and+vulnerability+to+injury+across+species%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species.</a> Prog Neurobiol. 106, 1-16 (2013).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus+Infects+Neural+Progenitors+in+the+Adult+Mouse+Brain+and+Alters+Proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Zika Virus Infects Neural Progenitors in the Adult Mouse Brain and Alters Proliferation.</a> Cell Stem Cell. 19 (5), 593-598 (2016).</li>
<li>Vermillion, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrauterine+Zika+virus+infection+of+pregnant+immunocompetent+mice+models+transplacental+transmission+and+adverse+perinatal+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Intrauterine Zika virus infection of pregnant immunocompetent mice models transplacental transmission and adverse perinatal outcomes.</a> Nat. Commun. 8, 14575(2017).</li>
<li>Goodfellow, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus+Induced+Mortality+and+Microcephaly+in+Chicken+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Zika Virus Induced Mortality and Microcephaly in Chicken Embryos.</a> Stem Cells Dev. 25 (22), 1-27 (2016).</li>
<li>Dick, G. W. A., Kitchen, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus+%28I%29.+Isolations+and+serological+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Trans+R+Soc+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">Zika Virus (I). Isolations and serological specificity.</a> Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 509-520 (1952).</li>
<li>Shao, Q., Herrlinger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+African+Zika+virus+MR-766+is+more+virulent+and+causes+more+severe+brain+damage+than+current+Asian+lineage+and+Dengue+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The African Zika virus MR-766 is more virulent and causes more severe brain damage than current Asian lineage and Dengue virus.</a> Development. , (2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier wordt beschreven, is een methode voor intracerebrale inoculatie van de ZIKV in embryonale, Neonatale en volwassen stadia voor het onderzoek van ZIKV-veroorzaakte schade in de ontwikkeling van de hersenen. Terwijl heel simpel: er zijn een paar overwegingen die onderzoekers nemen moeten om ervoor te zorgen de kwaliteit van de studie en de veiligheid van de betrokkenen.
DENV is nauw verwant aan ZIKV in het geslacht flavivirus. DENV heeft geen causaal verband gebracht met pediatrische Hersena...

Microcefalie is een voorwaarde die voortvloeien uit de ontwikkeling van de defecte hersenen gekenmerkt door kleiner is dan de gemiddelde hoofdmaat bij pasgeborenen. Kinderen met microcefalie vertonen een aantal symptomen die kunnen bestaan uit vertraging in de ontwikkeling, inbeslagneming, verstandelijke beperking, gehoorverlies, visie problemen en problemen met beweging en balans, ondermeer, afhankelijk van de ernst van de ziekte en 1,2,3te veroorzaken. Deze voorwaarde is multifactoriële aard, met de genetische, besmettelijke agent en milieufactoren gekoppeld aan waardoor microcefalie4,5,6,7,8, 9. 8 kinderen uit 10.000 geboorten werden voor het 2015-2016 ZIKV uitbreken, microcefalie in de Verenigde Staten volgens de CDC10gediagnosticeerd. Op 1 februarist van 2016 de World Health Organization verklaarde de Zika-virus een zorg van de noodsituatie van International van volksgezondheid als gevolg van de alarmerende toename van de microcefalie diagnoses die zijn gekoppeld aan ZIKV besmetting in moeders11, 12. Een recente studie van de CDC op ZIKV gevallen in de Verenigde Staten suggereert dat moeders ZIKV infectie resulteert in een verhoogd risico op 20-fold voor een kind te ontwikkelen microcefalie ten opzichte van niet-geïnfecteerde personen, en 4% van de ZIKV besmet moeders uit de Verenigde Staten hebben geleid tot kinderen met microcefalie11. Het tarief van microcefalie-geassocieerde geboorteafwijkingen tijdens de zwangerschap van ZIKV infectie in Brazilië zijn gemeld te hebben beïnvloed tot 17% van de baby's in geïnfecteerde moeders, die aangeeft dat andere factoren in Latijns-Amerika kunnen bijdragen aan het verhoogde risico op 13. terwijl we weten dat de ZIKV microcefalie en pathogenese kan veroorzaken in de neurale progenitor cel (NPC) bevolking7,8,14, de volledige pathogenese van ZIKV in de ontwikkeling van de hersenen blijft ongrijpbaar. Het is belangrijk voor de ontwikkeling van diermodellen om de ziekte mechanismen ten grondslag liggen aan de afwijkingen van de hersenen die zijn gekoppeld aan ZIKV infectie verder te onderzoeken.
Direct studeren het effect dat de ZIKV op de ontwikkeling van de hersenen heeft, ontwikkelden we eerst een muismodel intracerebrale inoculatie van embryonale dag 14,5 (E14.5) hersenen met ZIKV7. Deze fase werd gekozen aangezien het als vertegenwoordiger van het einde van het eerste trimester in menselijke dracht14wordt beschouwd. Pups kunnen overleven tot postnatale dag 5 (P5) met deze methode embryonale intracerebrale injectie (~ 1 µL van 1,7 x 106 weefselkweek infectieuze dosis (TCID50/mL)). Deze postnatale pups vertonen een aantal fenotypen ook waargenomen in besmette menselijke baby's, met inbegrip van uitgebreide ventrikels, neuronale verlies axonale rarefaction, astrogliosis en12,15van de activering van de microglial. Een pasgeboren muis brein is relatief onvolwassen, verwant aan het ontwikkelingsstadium van het menselijk brein op middellange dracht16, en de ontwikkeling van de hersenen van de muis bevat een grote postnatale component. Studeren later dracht fase infecties, is ook een methode voor postnatale infectie beschreven. Pasgeborenen geïnfecteerd met ZIKV bij P1 zijn in staat om te overleven tot aan 13 dagen na injectie. Bloed-geboren volwassen stadium infectie is beschreven in de muis eerder17 maar het gebruik van vereist de interferon (IFN) regulerende factor (IRF) transcriptie factoren IRF-3, -5,-7 triple knockout stam. Dit protocol beschrijft een methode voor het enten van de ZIKV intraventricularly om te omzeilen de antivirale reactie van het lymfkliertest model in de volwassene uit te schakelen. Terwijl dit het lymfkliertest immuunsysteem omzeilt, deze route van injectie doet niet direct na te bootsen de typische route van infectie. Om deze discrepantie direct, kunt de experimentator uitvoeren een uteriene infectie van ZIKV in plaats van de intracraniële route. Overgenomen uit eerdere werk18, hebben we deze techniek in dit protocol embryonale infectie kort beschreven.
De Zika-virusstammen uitgevoerd met deze techniek zijn de Mexicaanse isolaat MEX1-447,19 en de Afrikaanse isoleren heer-766 geïsoleerd in 194720. Zika MEX1-44 werd geïsoleerd in Chiapas, Mexico in januari voor 2016 vanaf een geïnfecteerde Aedes aegypti -mug. Wij verkregen dit virus met toestemming door de Universiteit van Texas Medical Branch in Galveston (UTMB). Daarnaast is het Dengue virus serotype 2 (DENV2) werd geënt met behulp van deze techniek in een vergelijkende studie. DENV2, stam S16803 (reeks GenBank GU289914), werd geïsoleerd uit een patiënt monster uit Thailand in 1974 en gepasseerd in C6/36 cellen. Het virus werd gepasseerd tweemaal in Vero-cellen door de wereld-referentiecentrum voor opkomende virussen en Arboviruses (WRCEVA) voor muis injecties. Dit toont aan dat deze techniek net zo werkt goed voor verschillende stammen van ZIKV en andere flavivirussen die een impact op de ontwikkeling van de hersenen hebben kunnen.

<table><tbody><tr><td>Flexible Drive Shaft Drill Hanging Motor</td><td>Leica</td><td>39416001</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Stereotax</td><td>Kopf</td><td>04557R</td><td></td></tr><tr><td>Micro4 Microsyringe Pump Controller</td><td>WPI</td><td>SYS-MICRO4</td><td></td></tr><tr><td>UMP3 UltraMicroPump</td><td>WPI</td><td>UMP3</td><td></td></tr><tr><td>Modulamp</td><td>Schott</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Luer-lock tubing (19-gauge)</td><td>Hamilton</td><td>90619</td><td></td></tr><tr><td>Melting Point Capillary</td><td>Kimble</td><td>34500-99</td><td>Glasnaald</td></tr><tr><td>Fluoro-Max: Red Fluorescent Microspheres</td><td>Thermo Scientific</td><td>R25</td><td>Geen verdunning; Gebruik voor oefeninjecties</td></tr><tr><td>10 &micro;L, Model 1701 LT SYR</td><td>Hamilton</td><td>80001</td><td>voor embryonale inoculatie</td></tr><tr><td>10 &micro;L, Model 1701 RN SYR, Small Removable NDL, 26s ga, 2 in, point style 2</td><td>Hamilton</td><td>80030</td><td>voor neonate/volwassene</td></tr><tr><td>4-0 Ethilon Nylon Sutures</td><td>Ethicon</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Mineral Oil</td><td>VWR</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>micropipette puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette Grinder</td><td>Narishige</td><td>EG-44</td><td></td></tr><tr><td>Fastgreen FCF Dye</td><td>Sigma</td><td>F7252</td><td>Injecteer met 0,5% kleurstof</td></tr><tr><td>Antilichamen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flavivirus groep antigeen antilichaam</td><td>Millipore</td><td>MAB10216</td><td>ms IgG2a 1:400 (Figuur 2, Figuur 3)</td></tr><tr><td>Pax6</td><td>DBHB</td><td>Pax6-s</td><td>ms IgG1 1:20</td></tr></tbody></table>

tot vaststelling van muismodellen voor zika-virus-geïnduceerde neurologische aandoeningen met behulp van intracerebrale injectie strategieën: embryonale, neonatale en volwassen

Establishing Mouse Models for Zika Virus-induced Neurological Disorders Using Intracerebral Injection Strategies: Embryonic, Neonatal, and Adult

Het Zika-virus (ZIKV) is een flavivirus momenteel endemisch in Noord-, Midden- en Zuid-Amerika. Nu blijkt dat de ZIKV microcefalie en extra hersenen afwijkingen kan veroorzaken. Het mechanisme dat ten grondslag ligt aan de pathogenese van ZIKV in de ontwikkelende hersenen blijft echter onduidelijk. Intracerebrale chirurgische methoden worden vaak gebruikt in het onderzoek neurowetenschap om vragen te stellen over zowel normale en abnormale hersenontwikkeling en hersenfunctie. Dit protocol maakt gebruik van klassieke chirurgische technieken en beschrijving van de methoden waarmee een model ZIKV-geassocieerde neurologische ziekten bij de mens in het zenuwstelsel van de muis. Terwijl directe hersenen inoculatie doet niet model op de normale wijze van transmissie van het virus, kan de methode onderzoekers gerichte vragen betreffende het gevolg na ZIKV infectie van de ontwikkelende hersenen. Dit protocol beschrijft embryonale, Neonatale en volwassen stadia van intraventricular inoculatie van ZIKV. Eenmaal onder de knie, kan deze methode worden een ongecompliceerd en reproduceerbare techniek die duurt slechts een paar uur uit te voeren.

Representatieve beelden van onze injectie methoden voor de ZIKV-inoculatie van embryonale hersenen worden weergegeven in diagrammen afgebeeld intracerebrale injecties (figuur 1A) en uteriene en intraplacental injecties (figuur 1B), illustreren de manier de zwangere dam en embryo's moeten worden bekeken en worden georiënteerd voor chirurgie (embryonale inoculatie protocol). Figuur 2A vertoont ZIKV (ME...

Hier beschrijven we een methode voor de vaststelling van een model voor Zika virus-geïnduceerde microcefalie in muis. Dit protocol bevat methoden voor embryonale, Neonatale en volwassene-fase intracerebrale inoculatie van de Zika-virus.

Tot vaststelling van Muismodellen voor Zika-Virus-geïnduceerde neurologische aandoeningen met behulp van intracerebrale injectie strategieën: embryonale, Neonatale en volwassen

The Zika virus (ZIKV) is a flavivirus currently endemic in North, Central, and South America. It is now established that the ZIKV can cause microcephaly ...

Het algemene doel van de hier gepresenteerde chirurgische methoden is om in vivo-modellen van intracraniale Zika-virusinfectie tot stand te brengen. Deze methode kan helpen om de belangrijkste vraag op het gebied te beantwoorden, zoals de pathologie en het mechanisme van Zika-virusinfectie in de hersenen, zowel in het vroege als latere ontwikkelingsstadium als in het volwassen stadium. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de richting van infectie van de hersenen gemakkelijk kan worden bereikt.De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot therapieën of diagnoses van door Zika-virus geïnduceerde microcefalie of andere neuro-ontwikkelingsstoornissen. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de pathogenese van het Zika-virus, kan deze ook worden toegepast om andere flavivirusinfecties in de hersenen te bestuderen, zoals het dengue-virus. Laad vlak voor de operatie het Zika-virusinjectiemengsel in een voorbereide glazen injectienaald door eerst de gasdichte 50-microliter injectiespuit Luer-lock-aansluiting en slang te monteren.Verzadig de geassembleerde spuit en slang met minerale olie. Zodra verzadigd, bevestig de naald en trek ongeveer zes tot zeven microliters

establishing-mouse-models-for-zika-virus-induced-neurological

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

This video demonstrates the generation of an experimental mouse model of cerebral malaria. Sporozoites isolated from Plasmodium berghei-infected female mosquitoes are injected into a restrained mouse's tail veins, leading to blood-brain barrier disruption and brain inflammation, causing cerebral malaria. This infected mouse model offers a valuable tool to study in vivo microvascular pathology associated with cerebral malaria.

Generation of a Mouse Model of Experimental Cerebral Malaria Using Host Mosquito-Derived Sporozoites

This video demonstrates the establishment of an in vitro model of Zika virus infection in a developing brain. Human cerebral organoids containing rosettes of stem cells, neural progenitor cells (NPCs), and neurons are infected with the Zika virus. The virus infects NPCs and triggers apoptosis, disrupting organoid development.

Developing an In Vitro Model of Zika Virus Infection in Cerebral Organoids

This video demonstrates the generation of a mouse model with a CNS infection. A suckling pup is injected with the virus both intracranially and intraperitoneally. The virus spreads, infecting the CNS causing neuronal cell death and inflammation. The pup is assessed for symptoms of infection as the disease progresses.

Generation of a Murine Model with a Central Nervous System Infection

The video demonstrates intracerebral injection of Zika virus suspension in an adult mouse to induce neurodegeneration. An anesthetized mouse is secured in a stereotaxic frame, and a hole is drilled into the exposed skull for injection. A suspension of the Zika virus is injected into the brain tissue. The viral infection causes inflammation, leading to neurodegeneration.

Establishing a Model of Zika Virus-Induced Neurodegeneration in an Adult Mouse

This video demonstrates a procedure to infect human fetal neural stem cells with Zika virus. The infected cells can be used for further studies.

Zika Virus Infection of Fetal Neural Stem Cells

Hier demonstreren we een techniek voor wijdverspreide neuronale transductie door intraventriculaire injectie van adeno-geassocieerd virus in de neonatale muisbrein. Deze methode biedt een snelle en eenvoudige manier om levenslange expressie van vireel aangeboden transgenen te bereiken.

Intracerebroventriculaire Viral Injectie van de Neonatale Mouse Brain voor persistent en wijdverbreide Neuronale Transduction

Dit protocol beschrijft een techniek gebruikt om te modelleren Zika virusinfectie van de ontwikkeling van de menselijke hersenen. Wildtype of gemanipuleerde stamcellijnen kunnen, onderzoekers gebruiken deze techniek te ontdekken van de verschillende mechanismen of behandelingen die vroege infectie van de hersenen en de resulterende microcefalie in Zika virus-geïnfecteerde embryo's kunnen beïnvloeden.

Zika Virus infectie van de ontwikkelende hersenen In Vitro met behulp van stamcel modellering afgeleid cerebrale Organoids

In dit artikel een overzicht van de methoden die worden gebruikt om uit te breiden van de foetale hersenen neurale stamcellen in cultuur, evenals hoe om hen te onderscheiden in verschillende neuronale subtypen en astrocyten, met de nadruk op het gebruik van neurale stamcellen te bestuderen Zika virusinfectie.

Zika Virus infectie van gekweekte menselijke foetale hersenen neurale stamcellen immunocytochemische p.a.

Een protocol bij het evalueren van antigeen-specifieke T-cel-reacties in de organen van de immunoprivileged van het Ifnar1- / - lymfkliertest model voor de Zika-virus (ZIKV)-infectie wordt beschreven. Deze methode is cruciaal voor het onderzoeken van de cellulaire mechanismen voor de bescherming en immunopathogenese van ZIKV vaccins en is ook waardevol voor de evaluatie van hun doeltreffendheid.

Evaluatie van Zika Virus-specifieke T-cel reacties in Immunoprivileged organen van besmette Ifnar1- / - muizen

Hier presenteren we een protocol voor het creëren van een immunocompetente ICR (Institute of Cancer Research) Murine model van infectie van het centrale zenuwstelsel om de ontwikkeling van neuropathie weer te geven. Monitoring van acute virale encefalitische stoornissen door identieke ziekte scores kan worden uitgevoerd voor het tonen van Denguevirus-geïnduceerde neuropathie in vivo.

Een Muriene model van dengue virus-geïnduceerde acute virale encefalitis-achtige ziekte

Het doel van het protocol is om de technieken aan te tonen die worden gebruikt om virale ziekten te onderzoeken door het Zikavirus te isoleren en te kwantificeren, van meerdere organen in een muis na infectie.

Isolatie en kwantificering van het Zikavirus van meerdere organen in een muis

Leer een chirurgische methode voor intracerebrale Zika-virusinfectie in muizen op embryonale, neonatale en volwassen leeftijd. Deze techniek ondersteunt onderzoek naar virale pathogenese en neuroontwikkelingsstoornissen.

Tot vaststelling van Muismodellen voor Zika-Virus-geïnduceerde neurologische aandoeningen met behulp van intracerebrale injectie strategieën: embryonale, Neonatale en volwassen (Video) | JoVE Journal

Tot vaststelling van Muismodellen voor Zika-Virus-geïnduceerde neurologische aandoeningen met behulp van intracerebrale injectie strategieën: embryonale, Neonatale en volwassen

Meer video's verkennen