Subcellular fractionering voor ERK activering op een mitochondriale afkomstige Peptide behandeling
25 september 2017
Dit protocol wordt beschreven hoe stimuleren van cellen met mitochondriale afkomstige peptiden en beoordelen van de signalering cascade en lokalisatie voor fosfoproteïne.
Het algemene doel van dit experiment is om de downstream signaleringscascade te identificeren die betrokken is bij cellen gestimuleerd met mitochondriaal-afgeleide peptiden. Deze methode kan belangrijke vragen in het veld van mitochondriaal-afgeleide peptiden beantwoorden, zoals welke signaalroutes betrokken zijn en waar dit plaatsvindt. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het eenvoudig en relatief gemakkelijk uit te voeren is.
We hadden voor het eerst het idee voor deze methode toen we de door humanin gemedieerde ERK-signalering onderzochten, wat ons beperkte informatie gaf over de downstream feiten. De Subscale Kersher-methode gaf ons een beter beeld van de rol van de door humanin gemedieerde signalering. Op de derde dag na het plateren en tweemaal wassen van tien tot de zesde, SH-SY5Y- of HEK293-cellen volgens het tekstprotocol.
Los S14G humanin-peptiden op in nul punt twee micron gefilterd gedistilleerd water. En herstel ze als een één millimolair voorraadoplossing. Verdeel het voorverwarmde serum-bevattende of serumvrije medium in een 15 milliliter kegelbuis en voeg kamertemperatuur humanin-peptide voorraadoplossing toe om een werkconcentratie te maken.
Vervang onmiddellijk het medium in de cellen door zes milliliter van de peptide-oplossing. En incubeer de cellen gedurende de juiste hoeveelheid tijd. Gebruik 10 milliliter ijs-koud PBS om de cellen twee keer te wassen.
Schraap vervolgens de cellen van de plaat in vijf milliliter ijs-koud PBS. En breng de celsuspensie over in een 15 milliliter kegelbuis. Centrifugeer de cellen bij 500 keer G en vier graden Celsius gedurende vijf minuten.
Herstel het pellet op in 200 microliter ijs-koud fractiebuffer en incubeer op ijs gedurende 15 minuten. Centrifugeer de buis bij 250 keer G en vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Verzamel vervolgens de supernatant als de cytoplasmatische fractie en bewaar het pellet voor de nucleaire fractie.
Centrifugeer de supernatant om cellulair puin en andere verontreinigingen te verwijderen bij 18000 keer G en vier graden Celsius gedurende tien minuten. Breng vervolgens de supernatant over in een nieuwe micro-centrifugebuis. Dit is de cytisol-fractie.
Herstel het pellet op in 200 microliter ijs-koud wasbuffer en centrifugeer de oplossing bij 250 keer G en vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Verwijder de supernatant en gebruik 100 microliter ijs-koud nucleair extractiebuffer om het pellet op te lossen. Soniceer vervolgens het monster op ijs tien keer.
Centrifugeer het monster opnieuw. Breng vervolgens de supernatant over in een nieuwe microcentrifugebuis. Gebruik om de ruwe mitochondriale fractie te isoleren, tien milliliter ijs-koud PBS om de cellen in elke 10 centimeter schotel te wassen.
Voeg vervolgens vijf milliliter ijs-koud PBS toe en gebruik een celschraper om de cellen los te maken. Breng de celsuspensies over in een enkele 15 milliliter kegelbuis. Centrifugeer vervolgens de cellen bij 600 keer G en vier graden Celsius gedurende 10 minuten.
Zuig de PBS af en gebruik een milliliter ijs-koud mitochondriaal isolatiebuffer om het pellet op te lossen. Homogeniseer vervolgens de cellen met 25 slagen van een twee milliliter homogenisator met een polytetrafluorethyleen-gecoate stamper op ijs. Breng het homogenaat over in een micro-centrifugebuis en centrifugeer het monster bij 600 keer G en vier graden Celsius gedurende 10 minuten om de kernen en ongebroken cellen te verwijderen.
Verzamel vervolgens de supernatant, breng het over in een nieuwe micro-centrifugebuis en centrifugeer de oplossing bij 7000 keer G en vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Na het verwijderen van de supernatant, herstel het pellet op met 200 microliter ijs-koud mitochondriaal isolatiebuffer en breng de oplossing over in een nieuwe micro-centrifugebuis. Centrifugeer de buis bij 7000 keer G en vier graden Celsius gedurende 10 minuten.
Na herhaling van de wassing, gebruik 15 microliter RIPA-buffer om het pellet op te lossen en incubeer de suspensie op ijs gedurende 10 minuten. Centrifugeer vervolgens het monster bij 16000 keer G en vier graden Celsius gedurende 15 minuten. Breng de supernatant, dat de mitochondriale fractie is, over in een nieuwe buis.
Kwantificeer en voer western blotting uit volgens het tekstprotocol. Met behulp van de in deze video gedemonstreerde procedure, werden HEK293 en SH-SY5Y-cellen behandeld met één en 100 micromolair S14 G humanin, een krachtig humanin-analogon. En de totale en gefosforyleerde vorm van ERK12 bij theanine 202, tyrosine 204 van totaal eiwitextracten werden geanalyseerd.
Zoals hier te zien is, vertoonde behandeling met S14G humanin een toename van fosforylering van ERK12 en zijn regulerende theanine-202, tyrosine-204-plaats. Om het doelwit van S14G humanin-gemedieerde ERK12-activatie te begrijpen, werd de subcellulaire lokalisatie van de totale en gefosforyleerde ERK12 na behandeling met S14G humanin geanalyseerd. Zoals te zien is in deze western blots, in HEK293-cellen, nam de gefosforyleerde ERK toe in zowel het cytoplasma als de kern, maar niet in de mitochondriën.
In SH-SY5Y-cellen daarentegen nam gefosforyleerde ERK af in het cytoplasma, kern en mitochondriën. Dit suggereert dat S14G humanin-gemedieerde ERK-fosforylering mogelijk een andere rol speelt in verschillende celtypen en onder verschillende omstandigheden. Eenmaal onder de knie, kan de celnucleaire fractiebepaling in één uur worden uitgevoerd en de mitochondriale fractiebepaling kan in één uur en 30 minuten worden uitgevoerd, als deze correct wordt uitgevoerd.
Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat alle monsters op ijs moeten worden gehouden. Na het volgen van deze procedure kunnen andere methoden, waaronder co-immunale precipitatie en massaspectrometrie, worden uitgevoerd om de downstream doelen van de signaalmoleculen te begrijpen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft hoe cellen gestimuleerd kunnen worden met mitochondriale peptiden en hoe de signaalcascade en lokalisatie van fosfoproteïnen kunnen worden beoordeeld. Het hoofddoel is om de downstream signaalcascade te identificeren die betrokken is bij cellen die met deze peptiden zijn gestimuleerd.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Cel-signalering
- Mitochondriële biologie
- Proteinfosforylering
Achtergrond
- Mitochondriële peptiden spelen een rol in de cellulaire signalering.
- Het begrijpen van deze pathways kan inzicht verschaffen in de cellulaire functie.
- Eerdere methoden boden beperkte informatie over de downstream-effecten.
- De Subscale Kersher-methode verbetert het begrip van humanine-gemedieerde signalering.
Doel van de studie
- Om de signaleringsroutes te onderzoeken die worden geactiveerd door mitochondriale peptiden.
- Om de lokalisatie van fosfoproteïnen als reactie op stimulatie te bepalen.
- Om een eenvoudige methode te bieden voor het bestuderen van deze effecten.
Gebruikte methoden
- Stimulatie van SH-SY5Y- of HEK293-cellen met mitochondriale peptiden.
- Beoordeling van downstream signaleringscascades.
- Lokalisatiestudies van gefosforyleerde eiwitten.
- Gebruik van de Subscale Kersher-methode voor verbeterde analyse.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van belangrijke signaleringspaden die betrokken zijn bij de respons op mitochondriale peptiden.
- Inzichten in de lokalisatie van fosfoproteïnen tijdens signalering.
- Validatie van de Subscale Kersher-methode voor het bestuderen van humanine-gemedieerde signalering.
- Vestiging van een eenvoudig experimenteel protocol.
Conclusies
- De studie biedt een heldere methode om signalering door mitochondriële peptiden te onderzoeken.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van de mitochondriële biologie.
- Het protocol kan worden gebruikt voor verder onderzoek binnen dit vakgebied.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Deze methode stelt R&D-teams in de biofarmaceutische sector in staat om de ERK-activering en subcellulaire lokalisatie kwantitatief te beoordelen als reactie op peptiden afgeleid van mitochondriën, wat targetvalidatie en mechanistische risicoreductie in de vroege ontdekkingsfase ondersteunt. Door een eenvoudige fractioneringsworkflow te bieden die compatibel is met western blot-analyse, faciliteert het het testen van hypothesen over peptide-gemedieerde signaleringscascades die relevant zijn voor neuroprotectie en metabole ziekte-indicaties. De aanpak vergroot het voorspellende vertrouwen bij het onderzoeken van signaalpaden voorafgaand aan inspanningen voor lead-identificatie.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Target Validatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt de therapeutische hypothese van de interactie tussen mitochondriale afgeleide peptiden en ERK-signaleringspaden.
- Operationele waarde: Maakt functionele targetvalidatie mogelijk door kwantitatieve fosfo-ERK-metingen in cytoplasmatische, nucleaire en mitochondriale fracties.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfoliotriage door celtype-specifieke signaleringsresponsen te onthullen die bijdragen aan mechanistische risicoreductie.
Screening & assayontwikkeling
- Assayklaarheid: Genereert gestandaardiseerde subcellulaire fracties die geschikt zijn voor downstream western blot-analyse van fosforyleringsgebeurtenissen.
- Reproduceerbaarheid: Biedt een eenvoudig, op ijs gehandhaafd protocol dat een consistente isolatie van cytoplasmatische, nucleaire en mitochondriale fracties waarborgt.
- Screeningondersteuning: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op een betrouwbare evaluatie van verbindingen in fenotypische screeningcascades.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziektebeelden: Ondersteunt onderzoek naar mitochondriale peptiden bij neuroprotectie en modellen van metabole stress, in overeenstemming met de preklinische relevantie voor ziektebeelden.
- Translationele continuïteit: Verbindt observaties over signalering in de ontdekkingsfase met preklinische validatie door middel van kwantificeerbare gegevens over de lokalisatie van fosfo-eiwitten.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Informeert go/no-go-beslissingen door te verduidelijken of de waargenomen ERK-activatie plaatsvindt in subcellulaire compartimenten die relevant zijn voor de ziekte.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het discovery-continuüm, van de beoordeling van target-interactie tot de verduidelijking van signaalpaden, waardoor de overgang van fenotypische hits naar mechanistisch inzicht mogelijk wordt gemaakt voorafgaand aan de lead-optimalisatie.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing van mechanismen van mitochondriale peptiden via subcellular resolutie van ERK-activeringsgebeurtenissen.
- Screening: Levert assay-klare fracties met kwantitatieve fosforyleringsmetingen voor het vergelijken van effecten van verbindingen.
- Analytics: Genereert phospho-ERK1/2 (Thr202/Tyr204) metingen waarmee teams stimuleringscondities en inhibitor-effecten kunnen vergelijken.
- Translationeel onderzoek: Koppelt ERK-lokalisatiepatronen aan preklinische continuïteit door nucleaire versus cytoplasmatische signaleringsdominantie te identificeren in relevante celmodellen.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar fractioneringsplatform dat toepasbaar is op meerdere mitochondriale peptiden en therapeutische middelen buiten humanine-analogen.
Operationele impact & impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in de validatie van doelpaden door mechanische ambiguïteit in peptide-gemedieerde signalering te verminderen.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare fractionering die compatibel is met western blot-analyses voor verschillende discovery-teams.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroege risicoreductie van mitochondriale targets mogelijk te maken vóór aanzienlijke investeringen in leadgeneratie.
- Impact op portfolio: Faciliteert risicogecorrigeerde prioritering door productieve signaleringsactivatie te onderscheiden van artefacten of compartimentspecifieke ruis.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in technieken voor subcellulaire fractionering en western blot-detectie van fosfo-epitopen.
- Afhankelijk van toegang tot centrifuge-apparatuur die in staat is tot nauwkeurige controle van de G-kracht en temperatuur voor fractie-isolatie.
- Vereist standaardisatie tussen teams van de timing van fractionering en het gebruik van protease-/fosfatase-remmers om consistente resultaten te garanderen.
- Overwegingen voor aanpassing omvatten optimalisatie voor verschillende celtypen en peptideconcentraties op basis van oplosbaarheid- en stabiliteitsprofielen.
- Praktische beperkingen omvatten mogelijke kruiscontaminatie tussen fracties als wasstappen niet strikt worden nageleefd, zoals vermeld in het protocol.
