Name: Subcellular fractionering voor ERK activering op een mitochondriale afkomstige Peptide behandeling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Leer subcellulaire fractie-analyse voor ERK-activering door mitochondriaal afgeleide peptiden in SH-SY5Y- en HEK293-cellen. Deze methode onthult signaaltransductiepaden en fosfo-eiwitlokalisatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door een Ellison/AFAR Postdoctoral Fellowship in Aging Research Program aan SJK en een Glenn Foundation Award en NIH grants naar PC (1P01AG034906, 1R01GM 090311, 1R01ES 020812). Alle auteurs worden weergegeven in de film.

1. peptide behandeling naar cellen <ol><li>plaat twee miljoen SH-SY5Y of HEK293 cellen (2 x 10 6) in een 10 cm schotel en groeien ze voor 2 dagen</li> <li>(optioneel) de volgende dag, het wassen van de cellen met serumvrij Dulbecco &#39; s gewijzigd Medium (DMEM) media eenmaal adelaar en incubeer met serum gratis DMEM's nachts als de behandeling dient te gebeuren in serum mediagroep.</li>
	<li>Op dag 3, los S14G-humanin peptiden in 0,2 µm gefilterd, gedestilleerd water en reconstrueren van hen als de stamoplossing van 1mM. 
	Opmerking: De peptiden moeten worden opgelost in de geschikt oplosmiddel, waarbij kan worden bepaald door de kenmerken van de reeks van de peptide (b.v., algemene kosten) kan worden verstrekt door de fabrikant als de peptiden commercieel verkrijgbaar zijn. Bijvoorbeeld, los S14G-humanin, SHLP2, en SHLP6 en MOTS-c op in water. Aliquot de peptiden in een geschikt volume (b.v., 50 μl) voor het voorkomen van bevriezen en ontdooien cycli. Eenmaal ontdooid, gebruik geen hen opnieuw.</li>
	<li>Aliquot de voorverwarmde serum-bevattende of serum-vrije media in een 50 mL conische buis en toevoegen van kamertemperatuur 1 mM stamoplossing te maken in een concentratie van de werken (bijvoorbeeld, 1 µM, 10 µM).</li>
	<li>Vervangen de media met 6 mL peptide uit stap 1.4. en Incubeer de cellen gedurende de juiste hoeveelheid tijd. 
	Opmerking: Kies de incubatietijd afhankelijk van uw aandoening die ERK activeert.</li>
</ol> 2. Subcellular fractionering voor Cytosol en Nucleus <ol><li>wassen van de cellen tweemaal met 10 mL ijskoud PBS, schraap de cellen uit de plaat in 5 mL ijskoud PBS en de celsuspensie Breng in een conische tube van 15 mL.</li>
	<li>De cellen bij 500 x g gedurende 5 min Centrifugeer bij 4 ° C.</li>
	<li>De PBS gecombineerd en resuspendeer de pellet in 200 µL van ijskoud, fractionering buffer (10 mM HEPES pH = 7.6, 3 mM MgCl 2, 10 mM KCl, 5% (v/v) van glycerol 1% niet-ionogene oppervlakteactieve stof (C 13 H 22 O (C 2 H 4 O) n), protease/phosphatase inhibitors). 
	Noot: Om te houden van de eiwitten in hun status fosforylatie, de fosfatase-remmer zoals evenals protease inhibitor vers moet worden toegevoegd en monsters moeten worden bewaard op ijs helemaal keer. Bevriezen en ontdooien herhalende cycli van de monsters moeten worden vermeden. Aliquot monsters in kleine hoeveelheid (bijvoorbeeld 50 μg) voordat ze willen bevriezen -80 ° C.</li>
	<li>Incubeer het opnieuw gesuspendeerde pellet op ijs gedurende 15 minuten en vervolgens Centrifugeer bij 250 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.</li>
	<li>Verzamelen de bovendrijvende substantie als de cytoplasmatische breuk en houden de pellet voor de nucleaire Fractie.</li>
	<li>Centrifugeren het supernatant om te verwijderen van cellulaire puin en andere verontreinigingen bij 18.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C en breng de bovendrijvende substantie in een nieuwe microcentrifuge buis. Dit is de Fractie cytosol.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet in 200 μl ijskoud was buffer (10 mM HEPES pH = 7.6, 1.5 mM MgCl 2, 420 mM NaCl, 25% (v/v) van glycerol 0.2 mM EDTA, protease/phosphatase inhibitors) en centrifugeer bij 250 x g gedurende 5 min bij 4 ° C</li>
	<li>Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 100 μl ijskoud, nucleaire extractie buffer (20 mM HEPES pH = 7.6, 1.5 mM MgCl 2, 420 mM NaCl, 25% (v/v) van glycerol 0.2 mM EDTA, protease/phosphatase inhibitors) en bewerk ultrasone trillingen ten 10 keer (5 s op, 10 s uitschakelen, 30% amp.) op ice.</li>
	<li>Centrifugeer bij 18.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.</li>
	<li>Het supernatant overbrengen in een nieuwe microcentrifuge buis. Dit is de nucleaire Fractie.</li>
	<li>Quantify het bedrag van de eiwitten met behulp van een BCA assay</li></ol>
 3. ruwe-mitochondriale fractie <ol><li>wassen van de cellen in elk 10 cm schotel met 10 mL ijskoud PBS, voeg toe 5 mL ijskoud PBS en loskoppelen van de cellen met behulp van een cel schraper. 
	Opmerking: Gebruik drie 10 cm schotels van cellen om een goede opbrengst van mitochondriën voor het westelijke bevlekken.</li>
	<li>De celsuspensie overbrengen in een conische tube van 15 mL, en allemaal uit drie 10 cm gerechten te combineren in een conische tube van 15 ml.</li>
	<li>Centrifugeer de cellen bij 600 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.</li>
	<li>De PBS gecombineerd en resuspendeer de pellet in 1 mL ijskoud mitochondriën isolatie buffer (10 mM Tris-MOPS, 1 mM EGTA/Tris, 200 mM sacharose, aangepast aan de pH = 7.4).</li>
	<li>Meng de cellen met 25 lijnen van een homogenizer van 2 mL met polytetrafluorethyleen gecoate stamper op ice. 
	Opmerking: Deze stap is essentieel voor mitochondriale integriteit te behouden en het maximaliseren van het rendement van de mitochondriale fractie. Het aantal slagen moet worden geoptimaliseerd voor elk celtype. De homogenizer voordat u de procedure start precool.</li>
	<li>Het homogenaat overbrengen in een microcentrifuge buis en Centrifugeer het bij 600 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C tot het verwijderen van de kernen en ongebroken cellen.</li>
	<li>Verzamelen het supernatant, overbrengen naar een nieuwe microcentrifuge-buis en Centrifugeer het bij 7.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. 
	Opmerking: De pellet is los, het supernatant zorvuldig te verzamelen en proberen niet te verstoren de pellet.</li>
	<li>Verwijder het supernatant resuspendeer de pellet met 200 μL van ijskoude mitochondriën isolatie buffer en breng de oplossing over in een nieuwe microcentrifuge buis. Centrifugeer de buis bij 7.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.</li>
	<li>Herhaal stap 3.8 te wassen de pellet. Het is niet nodig het supernatant overbrengen naar een nieuwe microcentrifuge buis in deze stap.</li>
	<li>Verwijder de bovendrijvende vloeistof uit de gewassen pellet en resuspendeer de pellet met mitochondriën met 50 μl van de buffer RIPA.</li>
	<li>Incubate de opschorting op ijs gedurende 10 minuten</li>
	<li>De schorsing bij 16.000 x g gedurende 15 min Centrifugeer bij 4 ° C.</li>
	<li>Het supernatant overbrengen in een nieuwe microcentrifuge buis. Dit is de mitochondriale fractie.</li>
	<li>Kwantificeren van het bedrag van de eiwitten met behulp van een BCA assay.</li>
</ol> 4. Westelijke bevlekken voor Phospho-specifieke eiwitten <ol><li>het uitvoeren van een SDS-polyacrylamide-gelelektroforese (8-16% premade gel) en het eiwit overbrengen in een membraan PVDF 4.</li>
	<li>Incubeer het membraan met 5% BSA in TBST (0,1% Polysorbaat 20) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur te blokkeren van achtergrond aspecifieke bandplaatsen. 
	Opmerking: Voor de detectie van gefosforyleerd eiwit, blokkeren het membraan met BSA geen melk. Melk bevat caseïne, een overvloedige phosphoprotein, wat in hoge niet-specifieke signaal resulteert.</li>
	<li>Na een nacht bebroeden het membraan met het primaire antilichaam (anti-phospho-ERK1/2) bij 4 ° C.</li>
	<li>De volgende dag, het membraan met TBST wassen (0,1% Polysorbaat 20) drie keer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Het membraan met secundair antilichaam (anti-konijn HRP) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur incuberen.</li>
	<li>Het membraan met TBST wassen (0,1% Polysorbaat 20) drie keer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Het membraan met ECL oplossing uit te broeden en beeld van het membraan in de afbeelding analyzer.</li>
	<li>Strip het membraan met strippen buffer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur en het membraan met drie keer, gedurende 5 min. TBST wassen</li>
	<li>Herhaal stap 4.2 tot 4,7 met behulp van het anti-totaal van de ERK1/2 antilichaam.</li>
	<li>Om te controleren op de zuiverheid van elke fractie, SDS-pagina uitvoeren en uitvoeren van immunoblots met antilichamen herkennen markers voor elk compartiment (bijvoorbeeld B1 triplex voor nucleus, GAPDH voor cytosol en TOM20 voor de mitochondriën).</li>
</ol>

<ol><li>Yen, K., Lee, C., Mehta, H., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+the+mitochondrial-derived+peptide+humanin+in+stress+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The emerging role of the mitochondrial-derived peptide humanin in stress resistance.</a> J. Mol. Endocrinol. 50 (1), 11-19 (2013).</li>
<li>Muzumdar, R. H., Huffman, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanin%3A+a+novel+central+regulator+of+peripheral+insulin+action%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Humanin: a novel central regulator of peripheral insulin action.</a> PloS one. 4 (7), 6334(2009).</li>
<li>Lee, C., Yen, K., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanin%3A+a+harbinger+of+mitochondrial-derived+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Humanin: a harbinger of mitochondrial-derived peptides.</a> Trends Endocrinol. Metab. 24 (5), 222-228 (2013).</li>
<li>Kim, S. J., Guerrero, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial-derived+peptide+humanin+activates+the+ERK1%2F2%2C+AKT%2C+and+STAT3+signaling+pathways+and+has+age-dependent+signaling+differences+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial-derived peptide humanin activates the ERK1/2, AKT, and STAT3 signaling pathways and has age-dependent signaling differences in the hippocampus.</a> Oncotarget. 7 (30), 46899-46912 (2016).</li>
<li>Ying, G., Iribarren, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanin%2C+a+newly+identified+neuroprotective+factor%2C+uses+the+G+protein-coupled+formylpeptide+receptor-like-1+as+a+functional+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor.</a> J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).</li>
<li>Zhang, W., Liu, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAPK+signal+pathways+in+the+regulation+of+cell+proliferation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">MAPK signal pathways in the regulation of cell proliferation in mammalian cells.</a> Cell Res. 12 (1), 9-18 (2002).</li>
<li>Huang, C., Jacobson, K., Schaller, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAP+kinases+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">MAP kinases and cell migration.</a> J. Cell Sci. 117, Pt 20 4619-4628 (2004).</li>
<li>Cagnol, S., Chambard, J. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERK+and+cell+death%3A+mechanisms+of+ERK-induced+cell+death--apoptosis%2C+autophagy+and+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">ERK and cell death: mechanisms of ERK-induced cell death--apoptosis, autophagy and senescence.</a> FEBS J. 277 (1), 2-21 (2010).</li>
<li>Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+and+properties+of+MAPKs%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Differential regulation and properties of MAPKs.</a> Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).</li>
<li>Morrison, D. K., Davis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+MAP+kinase+signaling+modules+by+scaffold+proteins+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev%22%5BJournal%5D)">Regulation of MAP kinase signaling modules by scaffold proteins in mammals.</a> Annu. Rev. Cell Dev. 19 (1), 91-118 (2003).</li>
<li>Wainstein, E., Seger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+subcellular+localization+of+ERK%3A+mechanisms+of+translocation+and+role+in+various+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The dynamic subcellular localization of ERK: mechanisms of translocation and role in various organelles.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 39, 15-20 (2016).</li>
<li>Zehorai, E., Yao, Z., Plotnikov, A., Seger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subcellular+localization+of+MEK+and+ERK--a+novel+nuclear+translocation+signal+%28NTS%29+paves+a+way+to+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The subcellular localization of MEK and ERK--a novel nuclear translocation signal (NTS) paves a way to the nucleus.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 314 (2), 213-220 (2010).</li>
<li>Kolch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinating+ERK%2FMAPK+signalling+through+scaffolds+and+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Coordinating ERK/MAPK signalling through scaffolds and inhibitors.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (11), 827-837 (2005).</li>
<li>Horbinski, C., Chu, C. T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15589366">Kinase signaling cascades in the mitochondrion: a matter of life or death.</a> Free Radic. Biol. Med. 38 (1), 2-11 (2005).</li>
<li>Aebersold, D. M., Shaul, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+signal-regulated+kinase+1c+%28ERK1c%29%2C+a+novel+42-kilodalton+ERK%2C+demonstrates+unique+modes+of+regulation%2C+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Extracellular signal-regulated kinase 1c (ERK1c), a novel 42-kilodalton ERK, demonstrates unique modes of regulation, localization.</a> Mol Cell Biol. 24 (22), 10000-10015 (2004).</li>
<li>Zhu, J. -H., Guo, F., Shelburne, J., Watkins, S., Chu, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+phosphorylated+ERK%2FMAP+kinases+to+mitochondria+and+autophagosomes+in+Lewy+body+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Localization of phosphorylated ERK/MAP kinases to mitochondria and autophagosomes in Lewy body diseases.</a> Brain Pathol. 13 (4), 473-481 (2003).</li>
<li>Cobb, L. J., Lee, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+mitochondrial-derived+peptides+are+age-dependent+regulators+of+apoptosis%2C+insulin+sensitivity%2C+and+inflammatory+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring mitochondrial-derived peptides are age-dependent regulators of apoptosis, insulin sensitivity, and inflammatory markers.</a> Aging. 8 (4), 796-809 (2016).</li>
<li>Ihle, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Stat+family+in+cytokine+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The Stat family in cytokine signaling.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 13 (2), 211-217 (2001).</li>
<li>Xu, Y. S., Liang, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+Undergoes+Acetylation-dependent+Mitochondrial+Translocation+to+Regulate+Pyruvate+Metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">STAT3 Undergoes Acetylation-dependent Mitochondrial Translocation to Regulate Pyruvate Metabolism.</a> Sci. Rep. 6 (1), 39517(2016).</li>
<li>You, L., Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25951043">The role of STAT3 in autophagy.</a> Autophagy. 11 (5), 729-739 (2015).</li>
<li>Hashimoto, Y., Niikura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+characterization+of+neuroprotection+by+a+rescue+factor+humanin+against+various+Alzheimer%27s+disease-relevant+insults%5BTitle%5D)+AND+%22The+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Detailed characterization of neuroprotection by a rescue factor humanin against various Alzheimer's disease-relevant insults.</a> The J Neurosci. 21 (23), 9235-9245 (2001).</li>
<li>Ying, G., Iribarren, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanin%2C+a+newly+identified+neuroprotective+factor%2C+uses+the+G+protein-coupled+formylpeptide+receptor-like-1+as+a+functional+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor.</a> J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).</li>
<li>Hashimoto, Y., Kurita, M., et al. Humanin inhibits apoptosis in pituitary tumor cells through several signaling pathways including NF-κB activation. Mol. Biol. Cell. 20 (12), 2864-2873 (2009).</li>
</ol>

Pinchas Cohen is een aandeelhouder en consultant bij CohBar, Inc. Kelvin Yen heeft gediend als consultant bij CohBar, Inc.

Hier, wij laten zien dat humanin peptide-gemedieerde ERK1/2 activering treedt op in twee verschillende soorten cellen, en de subcellular localisatie van geactiveerde ERK1/2 verschillen naargelang de omstandigheden (bijvoorbeeld, dosis van peptide, tijdstip en cel kunnen type). Het is aangetoond dat humanin signalen door middel van twee verschillende receptoren22,23, wat de verschillen verklaart wellicht in de signalering tussen de twee cellijnen, evenals...

Nieuwe studies tonen aan dat mitochondriale afkomstige peptiden (MDP's) spelen een belangrijke rol in cytoprotection en metabolisme1,2,3. Inzicht in het signaaltransductie traject in aanwezigheid van MDP's geeft ons inzicht in het mechanisme waarmee MDP's verschillende functies moduleren. De eerste geïdentificeerde MDP, humanin, heeft aangetoond dat het verhogen van extracellulaire signaal-gereglementeerde kinase 1/2 (ERK1/2) fosforylering door haar receptor binden4,5. De downstream effect van ERK1/2 activering is echter nog steeds underexplored.
De ERK1/2 cascade fungeert als een essentiële bemiddelaar in een verscheidenheid van cellulaire processen zoals proliferatie, cel migratie, cellulaire metabolisme, overleving en apoptosis6,7,8. Om te orkestreren van al zijn deze verschillende cellulaire processen, de activiteit en subcellular localisatie van ERK1/2 strak geregeld phosphatases en steiger eiwitten9,10. Naast posttranslationele modificatie regelt de dynamische pendelen van ERK1/2 ook haar signalering functie, activiteit en specificiteit11,12. ERK1/2 is vooral gelokaliseerd in het cytosol13. Een set van verankering en steiger eiwitten helpen behouden ERK1/2 in cytoskeletal elementen, op de oppervlakte van organellen of diffuus in het cytoplasma13. Bij stimulatie, ERK1/2 is phosphorylated en wordt losgekoppeld van de verankerende eiwitten, waardoor de translocatie van ERK1/2 om andere subcellular compartimenten, met inbegrip van de celkern, mitochondriën, Golgi, en lysosomen14, 15 , 16.
Hoewel humanin is bekend dat de ERK1/2 traject signalering activeren, wordt de activering van ERK1/2 alleen waargenomen in de cel Totaal lysates. Zoals eerder beschreven aangezien ERK1/2 subcellular localisatie een cruciale rol in de downstream effecten, de analyse van zowel de subcellular localisatie en de totale hoeveelheid speelt is gefosforyleerd ERK1/2 nodig om een grondig inzicht van humanin-geïnduceerde ERK1/2 activering en het activeren van downstream doelstellingen.
Om te begrijpen de organellen van de doelstelling van geactiveerde ERK1/2, werd subcellular fractionering, gevolgd door het westelijke bevlekken voor gefosforyleerd ERK1/2 uitgevoerd. Deze methode kan gemakkelijk worden uitgevoerd, zoals het maakt gebruik van Standaard laboratoriumapparatuur en reagentia. De geïsoleerde subcellular compartimenten zijn van hoge zuiverheid, waardoor de resultaten ronduit worden geïnterpreteerd. Immunokleuring van ERK1/2 kan vergelijkbare resultaten geven. Bepaalde subcellular compartimenten zijn echter relatief moeilijk te visualiseren en vereisen speciale fixatie en permeabilization methoden. ERK1/2 niveaus variëren in subcellular compartimenten, en deze variatie kan valse positieve en valse negatieve signalen wanneer we kijken naar hele cel lysates. Daarom geeft een immunoblot met behulp van geïsoleerde subcellular compartimenten ons een beter begrip van ERK1/2 lokalisatie.
De veelzijdigheid van de methode maakt het mogelijk wijzigingen van het protocol bij het onderzoeken van de effecten van andere stimulerende middelen met inbegrip van andere MDP's of translocatie van andere signalering moleculen zoals STAT3. Onlangs worden ontdekte kleine humanin-achtige peptiden (SHLPs) gecodeerd uit 16S rRNA regio waar humanin is gecodeerd, en ze hebben vergelijkbare, maar verschillende eigenschappen vergeleken met HN17. Bijvoorbeeld, SHLP2 en SHLP3 activeren ERK1/2 na 8u hoewel humanin ERK1/2 binnen 5 min. onderzoeken subcellular localisatie van ERK1/2 reactie op verschillende peptiden activeert ons een beter begrip van de biologie van deze peptiden geeft. Opkomende bewijsmateriaal bleek dat de subcellular localisatie van signalering van moleculen een cruciale rol in de downstream effecten speelt. Bijvoorbeeld, STAT3 traditioneel bekend is vooral gelokaliseerd in het cytosol in rustende cellen, en vervolgens het translocates in de kern te activeren van genexpressie in reactie op de cytokines18. STAT3 ook translocates naar de mitochondriën en regelt de TCA cyclus en de ATP productie19. Met betrekking tot autophagy verordening moduleert verschillende subcellular localisatie van STAT3 autophagy in verschillende manieren20. Bijvoorbeeld, nucleaire STAT3 transcriptionally regelt autophagy-gerelateerde genen en fungeert als een autophagy modulator. Autophagy remt cytoplasmatische STAT3 constitutively door interactie met autophagy signalering van moleculen. Mitochondriale STAT3 remt en voorkomt mitophagy door het onderdrukken van oxidatieve stress geïnduceerde autophagy. Daarom is deze methode van de isolatie subcellular compartiment is cruciaal voor het begrip van de rol van andere signalering moleculen, alsmede ERK1/2.

<table><tbody><tr><td>p44/42 MAPK (ERK1/2)</td><td>Celsignalering</td><td>9102</td><td>Verdunning 1:1.000</td></tr><tr><td>phospho-p44/42 MAPK (ERK1/2)(Thr202/Tyr204)</td><td>Celsignalering</td><td>4370</td><td>Verdunning 1:1.000</td></tr><tr><td>Lamin B1</td><td>Celsignalering</td><td>12586</td><td>Kernmarker, Verdunning 1:1.000</td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>Celsignalering</td><td>5174</td><td>Cytoplasmatische marker, Verdunning 1:2.000</td></tr><tr><td>Tom20</td><td>Santa cruz</td><td>SC-17764</td><td>Mitochondria marker, Verdunning 1:2.000</td></tr><tr><td>anti-Rabbit-HRP geconjugeerd</td><td>Celsignalering</td><td>7074</td><td>Verdunning 1:30.000</td></tr><tr><td>RIPA Lysis and Extraction Buffer</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>89900</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Cultuurschaal</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>12556002</td><td></td></tr><tr><td>HNG peptide</td><td>Genescript</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25mm sylinge filter</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>09-719A</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>3609</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>HCL</td><td>Sigma</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td></td></tr><tr><td>Celschraper</td><td>FALCON</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>Halt&trade; Protease en Fosfatase Inhibitor Cocktail (100X)</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>78440</td><td></td></tr><tr><td>Thomas Pestle Tissue Grinder Assemblies met gladde Pestles</td><td>Thomas Scientific</td><td>3432S90</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>8-16% Mini-PROTEAN TGX Precast Eiwit Gels</td><td>BIO RAD</td><td>4561104</td><td></td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot Module</td><td>BIO RAD</td><td>1658030</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo Transfer System</td><td>BIO RAD</td><td>1704150</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit</td><td>BIO RAD</td><td>1704272</td><td></td></tr><tr><td>Clarity Western ECL Blotting Substrates</td><td>BIO RAD</td><td>1705060</td><td></td></tr><tr><td>Restore Western blot stripping buffer</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>21059</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Gemodificeerd Eagle Medium</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator, Model: FB120</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>695320-07-12</td><td></td></tr></tbody></table>

subcellular fractionering voor erk activering op een mitochondriale afkomstige peptide behandeling

Subcellular Fractionation for ERK Activation Upon Mitochondrial-derived Peptide Treatment

Mitochondriale afkomstige peptiden (MDP's) zijn een nieuwe klasse van peptiden die zijn gecodeerd door kleine open lezing frames binnen andere bekende genen van het mitochondriaal genoom. MDP's hebben een breed scala aan biologische effecten zoals neuronen beschermt tegen apoptosis, verbetering van de metabole markeringen en bescherming van cellen tegen chemotherapie. Humanin was de eerste MDP om ontdekt te worden en is de meest bestudeerde peptide onder het MDP-familie. De membraan-receptoren en de stroomafwaartse signaalroutes van humanin zorgvuldig gekenmerkt. Extra MDP's zoals MOTS-c en SHLP1-6 hebben meer recentelijk ontdekt en de signalering mechanismen nog moeten worden opgehelderd. Hier beschrijven we een cel cultuur gebaseerde methode om te bepalen van de functie van deze peptiden. In het bijzonder, toestaan cel fractionering technieken in combinatie met het westelijke bevlekken voor de kwantitatieve bepaling van activering en translocatie van belangrijke signalering molecuul. Hoewel er andere methoden van cel fractionering, is de hier beschreven een gemakkelijke en eenvoudige methode. Deze methoden kunnen verder het ophelderen van het werkingsmechanisme van deze peptides en andere therapeutische agenten worden gebruikt.

Met behulp van de procedure die hier gepresenteerd, we HEK293 en SH-SY5Y cellen met 1 μM en 100 μM behandeld S14G-humanin, een krachtige humanin analoge21, respectievelijk, in volledige media voor de aangegeven perioden (Figuur 1 en Figuur 1 B). vervolgens onderzochten We de totale en gefosforyleerd vorm van ERK1/2 bij Thr202/Tyr204 uit totaal eiwit ...

Dit protocol wordt beschreven hoe stimuleren van cellen met mitochondriale afkomstige peptiden en beoordelen van de signalering cascade en lokalisatie voor fosfoproteÃ¯ne.

Subcellular fractionering voor ERK activering op een mitochondriale afkomstige Peptide behandeling

Mitochondrial-derived peptides (MDPs) are a new class of peptides that are encoded by small open reading frames within other known genes of the ...

Het algemene doel van dit experiment is om de downstream signaleringscascade te identificeren die betrokken is bij cellen gestimuleerd met mitochondriaal-afgeleide peptiden. Deze methode kan belangrijke vragen in het veld van mitochondriaal-afgeleide peptiden beantwoorden, zoals welke signaalroutes betrokken zijn en waar dit plaatsvindt. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het eenvoudig en relatief gemakkelijk uit te voeren is.We hadden voor het eerst het idee voor deze methode toen we de door humanin gemedieerde ERK-signalering onderzochten, wat ons beperkte informatie gaf over de downstream feiten. De Subscale Kersher-methode gaf ons een beter beeld van de rol van de door humanin gemedieerde signalering. Op de derde dag na het plateren en tweemaal wassen van tien tot de zesde, SH-SY5Y- of HEK293-cellen volgens het tekstprotocol.Los S14G humanin-peptiden op in nul punt twee micron gefilterd gedistilleerd water. En herstel ze als een één millimolair voorraadoplossing. Verdeel het voorverwarmde serum-bevattende of serumvrije medium in een 15 milliliter kegelbuis en voeg kamertemperatuur humanin-peptide voorraadoplossing toe om een werkconcentratie te maken.Vervang onmiddellijk het medium in de cellen door zes milliliter van de peptide-oplossing. En incubeer de cellen gedurende de juiste hoeveelheid tijd. Gebruik 10 milliliter ijs-koud PBS om de cellen twee keer te wassen.Schraap vervolgens de cellen van de plaat in vijf milliliter ijs-koud PBS. En breng de celsuspensie over in een 15 milliliter kegelbuis. Centrifugeer de cellen bij 500 keer G en vier graden Celsius gedurende vijf minuten.Herstel het pellet op in 200 microliter ijs-koud fractiebuffer en incubeer op ijs gedurende 15 minuten. Centrifugeer de buis bij 250 keer G en vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Verzamel vervolgens de supernatant als de cytoplasmatische fractie en bewaar het pellet voor de nucleaire fractie.Centrifugeer de supernatant om cellulair puin en andere verontreinigingen te verwijderen bij 18000 keer G en vier graden Celsius gedurende tien minuten. Breng vervolgens de supernatant over in een nieuwe micro-centrifugebuis. Dit is de cytisol-fractie.Herstel het pellet op in 200 microliter ijs-koud wasbuffer en centrifugeer de oplossing bij 250 keer G en vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Verwijder de supernatant en gebruik 100 microliter ijs-koud nucleair extractiebuffer om het pellet op te lossen. Soniceer vervolgens het monster op ijs tien keer.Centrifugeer het monster opnieuw. Breng vervolgens de supernatant over in een nieuwe microcentrifugebuis. Gebruik om de ruwe mitochondriale fractie te isoleren, tien milliliter ijs-koud PBS om de cellen in elke 10 centimeter schotel te wassen.Voeg vervolgens vijf milliliter ijs-koud PBS toe en gebruik een celschraper om de cellen los te maken. Breng de celsuspensies over in een enkele 15 milliliter kegelbuis. Centrifugeer vervolgens de cellen bij 600 keer G en vier graden Celsius gedurende 10 minuten.Zuig de PBS af en gebruik een milliliter ijs-koud mitochondriaal isolatiebuffer om het pellet op te lossen. Homogeniseer vervolgens de cellen met 25 slagen van een twee milliliter homogenisator met een polytetrafluorethyleen-gecoate stamper op ijs. Breng het homogenaat over in een micro-centrifugebuis en centrifugeer het monster bij 600 keer G en vier graden Celsius gedurende 10 minuten om de kernen en ongebroken cellen te verwijderen.Verzamel vervolgens de supernatant, breng het over in een nieuwe micro-centrifugebuis en centrifugeer de oplossing bij 7000 keer G en vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Na het verwijderen van de supernatant, herstel het pellet op met 200 microliter ijs-koud mitochondriaal isolatiebuffer en breng de oplossing over in een nieuwe micro-centrifugebuis. Centrifugeer de buis bij 7000 keer G en vier graden Celsius gedurende 10 minuten.Na herhaling van de wassing, gebruik 15 microliter RIPA-buffer om het pellet op te lossen en incubeer de suspensie op ijs gedurende 10 minuten. Centrifugeer vervolgens het monster bij 16000 keer G en vier graden Celsius gedurende 15 minuten. Breng de supernatant, dat de mitochondriale fractie is, over in een nieuwe buis.Kwantificeer en voer western blotting uit volgens het tekstprotocol. Met behulp van de in deze video gedemonstreerde procedure, werden HEK293 en SH-SY5Y-cellen behandeld met één en 100 micromolair S14 G humanin, een krachtig humanin-analogon. En de totale en gefosforyleerde vorm van ERK12 bij theanine 202, tyrosine 204 van totaal eiwitextracten werden geanalyseerd.Zoals hier te zien is, vertoonde behandeling met S14G humanin een toename van fosforylering van ERK12 en zijn regulerende theanine-202, tyrosine-204-plaats. Om het doelwit van S14G humanin-gemedieerde ERK12-activatie te begrijpen, werd de subcellulaire lokalisatie van de totale en gefosforyleerde ERK12 na behandeling met S14G humanin geanalyseerd. Zoals te zien is in deze western blots, in HEK293-cellen, nam de gefosforyleerde ERK toe in zowel het cytoplasma als de kern, maar niet in de mitochondriën.In SH-SY5Y-cellen daarentegen nam gefosforyleerde ERK af in het cytoplasma, kern en mitochondriën. Dit suggereert dat S14G humanin-gemedieerde ERK-fosforylering mogelijk een andere rol speelt in verschillende celtypen en onder verschillende omstandigheden. Eenmaal onder de knie, kan de celnucleaire fractiebepaling in één uur worden uitgevoerd en de mitochondriale fractiebepaling kan in één uur en 30 minuten worden uitgevoerd, als deze correct wordt uitgevoerd.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat alle monsters op ijs moeten worden gehouden. Na het volgen van deze procedure kunnen andere methoden, waaronder co-immunale precipitatie en massaspectrometrie, worden uitgevoerd om de downstream doelen van de signaalmoleculen te begrijpen.

subcellular-fractionation-for-erk-activation-upon-mitochondrial

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In deze video laten wij u zien hoe de mitochondriale ademhalingsketen-complexen van menselijke embryonale stamcellen kunnen worden geanalyseerd met behulp van gel-activiteit assays.

Peilen naar Mitochondriale complexe activiteit in menselijke embryonale stamcellen

De effecten van activering van eiwit kinase C (PKC) isozymen op mitochondriële functies geassocieerd met ademhaling en oxidatieve fosforylering en cellevensvatbaarheid beschreven. De aanpak past adenovirale techniek om selectief PKC overexpressie isozymen in primaire celkweek en verschillende assays voor mitochondriële functies en energie status van de cel te bepalen.

Beoordeling van Mitochondriale functies en levensvatbaarheid van de cellen in de nier overexpressie Proteïne kinase C-isozymen

Deze procedure laat zien hoe u te isoleren van de volwassen hersenen van muizen de mitochondriën-geassocieerde ER membranen of Mams en de glycosfingolipiden verrijkte microdomain fracties uit Mams en mitochondriale preparaten.

Mitochondriën-geassocieerde ER Membranen (eigen MTM) en glycosfingolipiden Verrijkt microdomeinen (GEM): Isolatie van Mouse Brain

Vergelijking van het mitochondriale membraanpotentieel tussen monsters levert waardevolle informatie op over de cellulaire status. Gedetailleerde stappen voor het isoleren van mitochondriën en het beoordelen van de respons op remmers en ontkoppelaars met behulp van fluorescentie worden beschreven. De methode en het nut van dit protocol worden geïllustreerd door het gebruik van een celcultuur en een diermodel van cellulaire stress.

Isolatie en functionele analyse van Mitochondriën uit gekweekte cellen en muis Tissue

Hier schetsen we hoe we de mitochondriale lokalisatie van een (celcyclus) kinase kunnen bestuderen, en hoe we de sub-mitochondriale locatie evenals potentiële mitochondriale substraten/doelen kunnen bepalen. Gedwongen expressie van eiwitten in de mitochondriën biedt een nuttige tool voor het bestuderen van de functionele consequenties van de mitochondriale lokalisatie van een eiwit van belang.

Experimentele benaderingen om te studeren mitochondriale lokalisatie en functie van een nucleair celcyclus Kinase, Cdk1

Proteïne kinasen zijn hoog geëvolueerde signaal enzymen en steigers die kritisch zijn voor inter- en intracellulaire signaaltransductie. Wij presenteren een protocol voor het meten van kinase-activiteit door middel van radioactief gemerkte adenosintrifosfaat ([γ-32P] ATP), een betrouwbare methode om te helpen bij het ophelderen van cellulaire signalering regulering.

Analyse van proteïnekinaseactiviteit met radiolabelde ATP

Hier presenteren we een protocol om te isoleren van het plasmamembraan, cytoplasma en mitochondria van U937 cellen zonder het gebruik van high-speed centrifugeren. Deze techniek kan worden gebruikt voor het zuiveren van subcellular breuken voor latere onderzoek van eiwit lokalisatie via immunoblotting.

Cel fractionering van U937 cellen in het ontbreken van snelle centrifugeren

Ondanks recente vooruitgang blijven veel mitochondriale gisteiwitten nog steeds met hun functies volledig onbekend. Dit protocol biedt een eenvoudige en betrouwbare methode om de submitchondriale lokalisatie van eiwitten te bepalen, wat fundamenteel is geweest voor de opheldering van hun moleculaire functies.

Beoordeling van submitchondrial protein localization in ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae

Het huidige protocol benadrukt de toepassing van western blotting-techniek om de functies en activiteiten van neuronale K-Cl co-transporter KCC2 te bestuderen. Het protocol beschrijft het onderzoek naar KCC2-fosforylering op kinaseregelplaatsen Thr906/1007 via western blotting. Ook aanvullende methoden om KCC2-activiteit te bevestigen worden kort gemarkeerd in deze tekst.

Studie van de functies en activiteiten van Neuronale K-Cl Co-Transporter KCC2 met behulp van Western Blotting

RASopathieën zijn multisysteem-genetische syndromen die worden veroorzaakt door hyperactivering van de RAS-MAPK-route. Potentieel pathogene varianten die wachten op validatie duiken continu op, terwijl slecht preklinisch bewijs de therapie beperkt. Hier beschrijven we ons in vivo protocol voor het testen en kruisvalideren van RASopathie-geassocieerde ERK-activeringsniveaus en de farmacologische modulatie ervan tijdens de embryogenese door middel van live FRET-beeldvorming in Teen-reporter...

Een efficiënt protocol om ERK-activiteitsmodulatie te beoordelen in vroege zebravismodellen van het Noonan-syndroom via live FRET-microscopie en immunofluorescentie

Leer subcellulaire fractie-analyse voor ERK-activering door mitochondriaal afgeleide peptiden in SH-SY5Y- en HEK293-cellen. Deze methode onthult signaaltransductiepaden en fosfo-eiwitlokalisatie.

Subcellular fractionering voor ERK activering op een mitochondriale afkomstige Peptide behandeling

Meer video's verkennen