Cel fluorescentie microscopie als waarnemer van essentiële processen tijdens microbiële celgroei bij te wonen

Het algemene doel van deze microscopie-gebaseerde aanpak is om centrale processen te observeren tijdens de groei van bacteriële cellen. Deze methode stelt ons in staat om belangrijke vragen in de bacteriologie te beantwoorden, zoals hoe essentiële processen worden gecoördineerd tijdens de groei en deling van bacteriële cellen. Het grote voordeel van deze techniek is dat we fluorescerende reagentia kunnen gebruiken om bacteriële celoppervlakken en structuren in levende cellen te visualiseren.

Hier gebruiken we deze methode om inzicht te geven in essentiële processen in Agrobacterium tumefaciens. Dit proces kan echter ook worden toegepast op andere bacteriën om hun groei te bestuderen. Om te beginnen, gebruik een steriele houten stok of pipettip om drie milliliter ATGN-groeimedium te inoculeren met een enkele kolonie van een wildtype- of mutante stam van A. Tumefaciens.

Laat de cultuur overnacht groeien bij 28 graden Celsius en 225 RPM. Gebruik de volgende dag een spectrofotometer om de OD600 te meten. Verdun vervolgens de celcultuur tot een OD600 van ongeveer 0,2 en laat de cellen verder groeien tot een OD600 van 0,6.

Giet een milliliter exponentiële cultuur in drie microfugebuizen. En pellet de cellen in een desktopcentrifuge bij 7.000 x g gedurende vijf minuten. Breng elke celpellet weer op in één milliliter PBS en voeg vervolgens een microliter DMSO Orange-stockoplossing of DAPI-stockoplossing toe.

Meng voorzichtig door te pipetten en incubeer de opgehangen cellen in het donker gedurende vijf minuten. Pellet de cellen door centrifugatie bij 7.000 x g gedurende vijf minuten en breng het pellet weer op in één milliliter PBS om overtollig reagens te verwijderen. Was vervolgens de cellen nog twee keer en breng het pellet weer op in 50 microliter PBS of medium.

Voor gelijktijdige time-lapse beeldvorming, combineer tien microliter cellen van elke behandeling in een nieuwe microfugebuis. Om agarose pads voor celbeeldvorming voor te bereiden, gebruik een dekglas als leidraad en snijd een 22 bij 22 millimeter vierkant van laboratoriumfolie door een scalpel rond de randen te laten lopen. Snijd een vierkant uit het midden van de laboratoriumfolie, waarbij een rand van ongeveer twee tot vijf millimeter overblijft om als afdichting voor de agarose-pad te dienen.

Gooi vervolgens het uitgesneden midden weg. Plaats de filmafdichting op een glasplaatje, gereinigd met een ammoniak- en alcoholvrije reiniger. En gebruik een warmteblok ingesteld op 70 graden Celsius of een vlam om de plaat te verwarmen tot de film lichtjes op het glas is gesmolten.

Bereid vervolgens de agarose-oplossing voor door ongeveer 0,075 gram agarose en vijf milliliter medium in een kleine kolf te mengen. Verwarm de oplossing in een magnetron met periodiek schudden om te mengen, totdat de agarose is opgelost en de oplossing helder is. Houd de agarose-oplossing op 55-70 graden Celsius en gebruik deze voor het aanleggen van meerdere agarose-pads binnen 48 uur.

Pipet de warme agarose-medium in het midden van de afdichting. Plaats vervolgens een dekglas over de afdichting om de agarose gelijkmatig te verdelen. Plaats de plaat op een koel vlak oppervlak om ongeveer twee minuten te laten stollen.

Schuif nu voorzichtig het dekglas van de agarose-pad en laat de agarose-pad een tot twee minuten op kamertemperatuur drogen, totdat het oppervlak van de pad droog lijkt. Een goede constructie van de agarose-pad is cruciaal voor het verkrijgen van hoogwaardige beelden. Probeer niet te beelden op een slechte pad.

Als de agarose-pad uitdroogt, rimpels of scheurt, is het het beste om niet lui te zijn en in plaats daarvan een nieuwe pad te maken. Verwijder vervolgens met een scalpel een kleine strook agarose om een luchtzak van ongeveer twee bij zeven tot tien millimeter te creëren. A.Tumefacien-cellen groeien het beste in de buurt van de luchtzak.

Breng 0,8 tot 1 microliter cellen aan op de agarose-pad. Plaats vervolgens voorzichtig een dekglas bovenop de agarose-pad om de cellen over het oppervlak van de pad te verdelen. Gebruik voor langetermijn time-lapse beeldvorming gesmolten Valap om de randen van het dekglas te verzegelen.

Zorg ervoor dat u alle randen en hoeken van het dekglas met Valap afdicht. Als u dit niet doet, kan dit leiden tot drift tijdens de time-lapse beeldvorming van de agarose-pad. Om epifluorescentiemicroscopie uit te voeren, plaatst u immersie-olie op het gewenste objectief en plaatst u de omgekeerde plaat in de plaathouder op het podium.

Gebruik de focusknoppen om de cellen scherp te stellen. Maak beelden in fase of DIC en fluorescentie, met behulp van de gewenste fluorescentiefilter voor fluorescentiebeelden. Optioneel, maak meerdere x, y-posities door willekeurig tien velden cellen te selecteren in de buurt van de luchtzak van de agarose-pads.

Stel de tijdsequentie-acquisitie in om in fase of DIC te beelden met het gewenste tijdsinterval. Zoals hier getoond, werden cellen direct vanuit cultuur beeldvormd na wassen door centrifugatie en na het incuberen van de cellen met 0,1 procent DMSO, de resultaten toonden aan dat DMSO alleen de celmorfologie niet beïnvloedt. Zowel Orange als DAPI labelden DNA in levende A.Tumefaciens-cellen.

Bij beeldvorming met de DAPI-filter stopten de cellen echter binnen een uur met groeien. Volgens vergelijkbare methoden kunnen andere fluorescerende reagentia ook worden gebruikt om de bacteriële celwand of membranen te visualiseren. Bovendien kunnen veel van deze fluorescerende kleurstoffen worden gecombineerd om een uitgebreid beeld van het bacteriële celoppervlak te geven.

Beeldvorming van essentiële processen in levende bacteriën is opwindend, omdat het de mogelijkheid biedt om deze processen te bestuderen in conditionele mutanten of niet-modelbacteriën. Dit stelt ons in staat om onze studies van diverse bacteriesoorten te verbeteren.