Microstructured apparaten voor geoptimaliseerde Microinjection en beeldvorming van zebravis larven
December 8th, 2017
Microinjection van zebravis embryo's en larven is een essentieel maar uitdagende techniek gebruikt in vele zebrafish modellen. Hier presenteren we een scala van microscale instrumenten om te helpen bij de stabilisatie en de oriëntatie van de zebravis voor zowel microinjection en beeldbewerking.
Het algemene doel van deze methodologie is om micro-injectie van zebravislarven eenvoudiger en nauwkeuriger te maken. Deze methode helpt onderzoekers die zebravismodelsystemen gebruiken om zebravislarven in specifieke oriëntaties in grote arrays te immobiliseren. De techniek maakt het gemakkelijker om toegang te krijgen tot specifiek weefsel voor micro-injectie en beeldvorming, en is zeer effectief wanneer grote aantallen larven vereist zijn voor toepassingen zoals infectie of xenograft kankermodellen.
Mijn fabricagestrategieën in zebravismodellen zijn zeer complementair. De ene is kunstmatig en eenvoudig. De andere is levend en complex.
Beide delen dezelfde grootteschaal. Ze zijn allebei transparant. En beide maken observaties op celniveau mogelijk.
Zoals hier getoond, kunnen ze eenvoudig worden gecombineerd en kunnen ze toepassingen hebben voor de studie van vrijwel elke belangrijke ziekte. Na het voorbereiden van een PDMS-blok in een petrischaal bedekt met een dunne film van E-3, volgens het tekstprotocol, gebruik een overdrachtspipet om het vereiste aantal embryo's over te brengen naar het oppervlak van het PDMS-blok. Gebruik een haarlus of een soortgelijk hulpmiddel om de embryo's in de microstructuurputjes te duwen, vooral voor dorsale en ventrale oriëntaties.
Bij het laden van larven in de putjes, is het belangrijk om voldoende water op het PDMS-blok te hebben om gemakkelijk te kunnen manipuleren. Het is ook belangrijk om ze in de putjes te duwen, zodat ze tijdens de injectie op hun plaats blijven. Om zebravissen te oriënteren op microstructuurkanalen die eerder zijn voorbereid volgens het tekstprotocol, gebruik een overdrachtspipet om E-3 van het gepatroneerde PDMS-blok te verwijderen.
Het niveau van E-3 moet onder de rand van het blok dalen, maar nog steeds aanwezig zijn in het reservoir en de kanalen, en een dunne laag blijft op het PDMS. Gebruik een overdrachtspipet om 10 verdoofde embryo's over te brengen naar het reservoir, zorg ervoor dat de randen niet overlopen. Gebruik een haarlus om elk embryo in de trechterkop te manipuleren, eerst bij de ingang van het juiste kanaal, en zorg ervoor dat het embryo de juiste oriëntatie heeft als het het kanaal binnenkomt.
Gebruik vervolgens een haarlus om elk embryo langs het kanaal te laten glijden, totdat het de oriënterende microfuncties in de kanaalwanden bereikt die het op zijn plaats houden. Na de voorbereiding van micro-injectienaalden en micro-injectieoplossing, gebruik een fijn taps toelopende pipettip om vijf microliters van de oplossing in de naald te laden. Monteer de naald in een micromanipulator gemonteerd op een magnetische standaard, en sluit deze aan op een PICO-pompmicro-injector.
Gebruik vervolgens een pincet om het uiteinde van een naald op een hoek van 45 graden te breken door de taps toelopende punt te knijpen. Pas de grootte van de injectiebolus aan op één nanoliter door de injectietijd op de PICO-pompcontroller aan te passen. Pas de hoek van de micro-injectienaald aan op de micromanipulatorcontroller, beginnend met 45 graden met de naald parallel aan de lengte van het embryo.
Een steilere hoek kan worden gebruikt om zijdelingse beweging van het embryo tijdens de micro-injectie te minimaliseren. Controleer de petrischaal met de linkerhand en de nodige micromanipulator met de rechterhand, breng de naald zo dicht mogelijk bij de beoogde plaats van micro-injectie, zoals de otische blaas. Gebruik de micromanipulatorcontroller om de naald in het doelweefsel te steken en gebruik de PICO-pompvoetschakelaar om het vooraf ingestelde volume te injecteren.
Als het weefsel weerstand biedt aan penetratie, tik dan voorzichtig op de micromanipulatorcontroller. Om de embryo's te loslaten, gebruik een overdrachtspipet om E-3 van boven naar beneden over het oppervlak te laten stromen, of door de schaal te draaien zodat de embryo's in het omringende E-3 worden losgelaten. Breng de embryo's over naar een herstelbschaal van E-3 zonder MS-222.
Gebruik een haarlus of een soortgelijk hulpmiddel om de embryo's bij de ingangen van de beeldvormingskanalen in de gewenste oriëntatie te positioneren en duw ze gedeeltelijk in het apparaat. Dit zal helpen om ze gelijkmatig in het apparaat te trekken. Gebruik een 1000 microliter pipet of overdrachtspipet om E-3 door het apparaat vanaf de poort te trekken totdat de embryo's in de juiste oriëntatie voor beeldvorming in de kanalen worden getrokken.
Breng de puttenplaat naar een omgekeerde fluorescentiemicroscoop. Om de embryo's te beeldvormen, pas de vergroting aan door de juiste lens te selecteren, zoals 10x voor beeldvorming van de migratie van zebravisneturaohil. Pas de intensiteit van de lichtbron en de belichtingstijd voor elk kanaal aan, zodat elk signaal duidelijk is, maar niet verzadigd.
Vang tenslotte afbeeldingen voor elk fluorescent en doorgelaten kanaal. Met behulp van het microgestructureerde kanaalapparaat om embryo's in de laterale oriëntatie te stabiliseren, werd de mogelijkheid van neutrofielen om te reageren op de standaard chemoattractanten fMLP en LTB4 micro-geïnjecteerd in de otische blaasjes, van twee dagen post-fertilisatie zebravis embryo's getest. Om neutrofielenwerving te visualiseren, werden injecties getraceerd met hoogmoleculairgewicht rodamine dextran, en uitgevoerd in transgene embryo's met groen fluorescerende neutrofielen.
Niet-geïnjecteerde embryo's en embryo's geïnjecteerd met alleen rodamine werden gebruikt als negatieve controles. Na micro-injectie werden embryo's overgebracht naar het beeldvormingskanaalapparaat en beeldvormd met behulp van een EVOS-fluorescentiemicroscoop op 30 minuten en vijf uur na injectie. Zoals verwacht, werd een klein aantal fluorescerende neutrofielen gerekruteerd naar de mock geïnjecteerde otische blaasjes op het vroege tijdstip, waarschijnlijk als gevolg van door schade gemedieerde rekrutering.
Interessant genoeg werd waargenomen dat de rhodamine dextran tracer zich accumuleerde in de otolieten tijdens het experiment. Voor beide chemo-attractanten werden neutrofielen in grotere aantallen gerekruteerd, vooral in reactie op
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert een methodologie voor micro-injectie van zebravislarven, gericht op het verbeteren van de gemak en nauwkeurigheid van het proces. De techniek stelt onderzoekers in staat om zebravislarven in specifieke oriëntaties te immobiliseren, wat de toegang tot doelweefsels voor micro-injectie en beeldvorming vergemakkelijkt.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Ontwikkelingsbiologie
- Genetica
Achtergrond
- Micro-injectie is een cruciale techniek in zebravisonderzoek.
- Er zijn uitdagingen bij het stabiliseren en oriënteren van zebravislarven.
- Effectieve methoden zijn nodig voor grootschalige toepassingen.
- Onderzoek omvat vaak infectie- of kankermodellen.
Doel van het onderzoek
- Om het micro-injectieproces voor zebravislarven te vereenvoudigen.
- Om de nauwkeurigheid van weefseltargeting tijdens injecties te verbeteren.
- Om het gebruik van zebravis in verschillende experimentele modellen te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Ontwikkeling van microschaalhulpmiddelen voor stabilisatie.
- Technieken voor het immobiliseren van larven in arrays.
- Strategieën voor toegang tot specifieke weefsels.
- Toepassing van methoden in grootschalige studies.
Belangrijkste resultaten
- Verbeterde stabilisatie van zebravislarven tijdens procedures.
- Verbeterde oriëntatie voor gerichte micro-injectie.
- Effectief voor high-throughput toepassingen.
- Vereenvoudigde toegang tot weefsels voor beeldvorming en injectie.
Conclusies
- De methodologie helpt aanzienlijk bij zebravisonderzoek.
- Het biedt een betrouwbare aanpak voor verschillende experimentele behoeften.
- Toekomstige toepassingen kunnen zich uitbreiden naar andere modelsystemen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Microstructured devices for zebrafish larval microinjection address throughput and precision bottlenecks in phenotypic screening and target validation workflows. By enabling standardized embryo orientation and immobilization, the method supports reproducible compound testing in disease-relevant systems. This improves predictive confidence in early discovery for infection and oncology models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables precise tissue targeting for microinjection of pathogens or tumor cells, supporting mechanistic de-risking of therapeutic hypotheses.
- Operational Value: Standardizes larval positioning across large arrays, reducing variability in infection or xenograft model initiation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides quantitative imaging readouts of neutrophil recruitment in response to chemoattractants like fMLP and LTB4, enabling dose-response assessment.
- Operational Value: Facilitates parallel processing of larvae in microfluidic channels, increasing throughput for compound screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports longitudinal imaging of immune cell dynamics post-injection, aligning with translational biomarker studies in inflammation and metastasis.
- Operational Value: Integrates with fluorescent microscopy platforms for standardized readout across preclinical validation stages.
Pipeline & Workflow Integration
The method bridges early discovery and preclinical evaluation by enabling standardized microinjection and live imaging in zebrafish larvae, a disease-relevant system for target validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing through controlled delivery of agents to specific tissues such as the otic vesicle.
- Screening: Enables assay-ready preparation of larvae in consistent orientations for reproducible compound exposure.
- Analytics: Generates fluorescent and transmitted light imaging outputs for quantifying cellular recruitment and tracer distribution.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via standardized imaging of neutrophil responses relevant to human inflammation and cancer models.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable platform technology adaptable across multiple larval stages and experimental endpoints.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves target validation confidence by reducing technical variability in microinjection and imaging procedures.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability of larval handling in multi-well formats.
- Strategic Value: Supports better go/no-go decisions by increasing data quality in early-stage phenotypic screens.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on robust zebrafish model data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device handling and zebrafish larval manipulation.
- Depends on access to PDMS fabrication, micromanipulators, and fluorescent microscopy systems.
- Necessitates standardization of embryo staging and anesthetic protocols across teams.
- Adaptation considerations include channel dimensions for different larval sizes and orientation requirements.
- Practical limitations include device clogging risk and the need for careful fluidic priming to ensure consistent larval loading.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:06
Orientation of Zebrafish on Divot Arrays and Microstructured Channels
2:39
Microinjection of Zebrafish
4:20
Screening of Embryos Using the PDMS Imaging Device
5:45
Results: Microinjection and Imagingof Zebrafish Larvae Using Microstructured Devices
7:04
Conclusion
