Name: Verbeterde Protocol voor chromatine Immunoprecipitation van muis skeletspieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-06T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Leer een verbeterd protocol voor chromatine-immunoprecipitatie van muis skeletspieren. Deze methode maakt ChIP-kwaliteit chromatin preparatie mogelijk uit weefsel met hoge structurele eiwitgehalte.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken alle medewerkers van de IGBMC hoge doorvoer sequencing faciliteit, een lid van "Frankrijk Génomique" consortium (ANR10-INBS-09-08) en alle IGBMC algemene diensten met name het personeel van de IGBMC dier faciliteit. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de CNRS, de INSERM, de AFM, de Ligue Nationale contre le Cancer, de Franse vermelden Fonds door middel van de ANR onder het programma Investissements d'Avenir geëtiketteerd ANR-10-IDEX-0002-02, de Labex INRT ANR-10-IDEX-0001-02 en de ANR-AR2GR-16-CE11-009-01. De financiers had geen rol in de studie ontwerp, gegevensverzameling en analyse, besloten tot bekendmaking of voorbereiding van het manuscript. SJ werd gesteund door de Ligue Nationale contre le Cancer ANR-AR2GR-16-CE11-009-01 en de V.U door de Ministère de l'Enseignement et de la Recherche. ID is een 'équipe labellisée' van de Ligue Nationale contre le Cancer.

Muizen werden gehouden overeenkomstig de institutionele richtsnoeren met betrekking tot de zorg en het gebruik van proefdieren en in overeenstemming met nationale Animal Care Guidelines (EuropeseCommissie richtlijn 86/609/EEG; Franse decreet no.87-848). Alle procedures door de Franse nationale ethische commissie waren goedgekeurd.
 1. isolatie van spierweefsel <ol><li>offer één volwassen 6 tot 8 weken oude muis door cervicale dislocatie. Sterlise de ledemaat door het spoelen met 70% ethanol en ontleden de hind-limb spieren (Gastrocnemius, Tibialis anterieure, Quadriceps) met fijne punt schaar en pincet. 
	Opmerking: Één muis moet opleveren ongeveer 500 mg weefsel.</li>
	<li>Mince de spieren in een reageerbuis van 2 mL met 1 mL ijskoud hypotone buffer tot een homogene bereiding van kleine (&#60; 2-3 mm 3) stukken met behulp van fijn schaar en verlaat de buis schudden op een bankje top roerwerk bij 4 ° C gedurende 5-10 minuten</li>
</ol> 2. Lysis van de weefsel Opmerking: Gelieve te verwijzen naar de tabel 1 voor alle buffer composities.
<ol><li>De homogenaat overbrengen in een ronde-onderkant-buis van 14 mL en resuspendeer in 5 mL koude hypotone buffer (EDTA-vrije proteaseinhibitor cocktail en PMSF).
	<ol><li>Homogenise het gehakt spierweefsel met behulp van een losse dounce (20-30 lijnen binnen 3 min) of een weefsel van de mechanische homogenizer voor 15-30 s in buizen van de ronde onderkant 14 mL. 
		Opmerking: De efficiency van lysis van de in dit stadium kan worden geëvalueerd door de lichte microscopie, en indien nodig extra verstoring kan worden uitgevoerd.</li>
	</ol></li> <li>De homogenaat overbrengen in buizen van 15 mL en vul volume tot 10 mL met koude hypotone buffer. Monteren van het homogenaat zoals hieronder beschreven voordat u verdergaat met de volgende muis.</li>
</ol> 3. Fixatie <ol><li>formaldehyde toevoegen aan de eindconcentratie van 1% en schud gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Glycine toevoegen om een eindconcentratie van 0,125 M in elke buis te stoppen fixatie en schud gedurende 5-10 minuten bij kamertemperatuur.</li>
</ol> 4. Kernen voorbereiding Opmerking: Gelieve te verwijzen naar de tabel 1 voor alle buffer composities.
<ol><li>Homogenise de vaste lysate met behulp van een losse dounce (5-10 strokes).
	<ol><li>Overdracht aan een tube 15 mL en centrifugeer bij 1.000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C voor kernen en cellulaire puin.</li>
	</ol></li> <li>Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in vers 5 mL hypotone buffer. Filtreer de lysate door een 70 µm cel zeef in een tube van 50 mL. Opnieuw filteren het filtraat door een zeef van de cel 40 µm.</li>
	<li>Overbrengen in het filtraat een tube van 15 mL en centrifuge op 1.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 ° C tot het verkrijgen van de nucleaire pellet. 
	Opmerking: In dit stadium de kernen kunnen onmiddellijk worden sonicated of uitlijnen als een droge pellet in vloeibare stikstof bevroren en opgeslagen bij -80 ° C.</li>
</ol> 5. Ultrasoonapparaat <ol><li>beoordelen van het volume van de nucleaire pellet (ongeveer 50 µL voor zowel mechanische als dounce homogenisering) en resuspendeer het in ultrasoonapparaat buffer tot 3 tot 4 keer van verpakte nucleaire volume en bewerk ultrasone trillingen ten voor 10-15 min bij 4 ° C met behulp van een ultrasoonapparaat . 
	Opmerking: De chromatine kan worden geanalyseerd onmiddellijk zoals beschreven onder (6) of bevroren en opgeslagen bij -80 ° C.</li>
</ol> 6. Beoordeling van de chromatine Fragment grootte na ultrasoonapparaat Opmerking: Gelieve te verwijzen naar de tabel 1 voor alle buffer composities.
<ol><li>De-dwarslijn, nemen 30 µL van de chromatine in een reageerbuis 1,5 mL en Voeg 20 µL 5 M NaCl. Vul het volume 500 µL en na een nacht bebroeden bij 65 ° C.
	<ol><li>De volgende dag, het uitvoeren van een behandeling met 1 µL proteïnase K (20 mg/mL stockoplossing), 10 µL 2 M Tris pH 6.8, en 10 µL van het EDTA 0.5 M gedurende 1 uur bij 42 ° C. uitvoeren een fenol-chloroform/chloroform extractie en neerslag van het DNA met 1 hoeveelheid natrium acetat e (3 M) en 2 volumes van 100% ethanol gedurende één uur bij-80 ° C, of 's nachts bij -20 ° C.</li>
	</ol></li> <li>Pellet het DNA door centrifugeren bij 13.500 x g gedurende 15 min. Decant het supernatant en de pellet grondig met koud 70% ethanol en Centrifugeer nogmaals gedurende 5 min. Decant het supernatant wassen en drogen de pellet.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet in het oorspronkelijke volume (30 µL) van TE buffer. De concentratie van het DNA in een spectrofotometer meten door absorptie bij 260 nm/280 nm. Pipetteer van 500-1000 ng van DNA samen met een DNA grootte ladder op gescheiden doorgangen van een 1,5% agarose gel en het uitvoeren van elektroforese om te beoordelen van de grootte van het fragment van de chromatine. 
	Opmerking: Fragment grootte moeten tussen 200-500 basenparen, en moet er geen fragmenten van de detecteerbare ultrahoog moleculair gewicht overeenkomt om niet of slecht-gefragmenteerde DNA. Indien nodig, de chromatine-oplossing (stap 5) kan worden opnieuw voor een langere tijd sonicated en vervolgens opnieuw geanalyseerd zoals hierboven beschreven, totdat de optimale omvang wordt verkregen.</li>
</ol> 7. Chromatine Immunoprecipitation (ChIP) Opmerking: Gelieve te verwijzen naar de tabel 1 voor alle buffer composities.
<ol><li>Blok de G eiwit sepharose kralen van aliquoting 1 mL van de 50% drijfmest in ethanol. Pellet de kralen door centrifugeren bij 400 x g gedurende 1 minuut in een benchtop centrifugeren en wassen met 1 mL TE buffer centrifuge op 400 x g en herhaal de wash.
	<ol><li>Na de tweede centrifugeren, resuspendeer in 1 mL van ChIP verdunning buffer met 25 µL van BSA (voorraad 20 mg/mL) en 20 µL tRNA (voorraad 10 mg/mL gist). Blokkeren van de kralen voor ten minste 2 h vóór gebruik door rotatie (40-60 rpm) bij 4 ° C.</li>
		<li>Verdund 50 µg chromatine (stap 5) 8 tot 10 keer gebruik van ChIP verdunning buffer. Voeg 50 µL van geblokkeerde kraal drijfmest en incubeer gedurende 2 uur roteren (40-60 rpm) bij 4 ° C. Centrifuge bij 400 x g bij 4 ° C tot vooraf gewiste chromatine verkrijgen en over te brengen naar een verse buis.</li>
	</ol></li> <li>Voor immunoprecipitation, voeg de juiste hoeveelheid primair antilichaam (bijvoorbeeld, 1-2 µg per 10 µg chromatine) en na een nacht bebroeden met rotatie bij 4 ° C. 
	Opmerking: De optimale hoeveelheid antilichaam kan worden aanbevolen door de leverancier of empirisch kan worden bepaald door het uitvoeren van ChIP-qPCR met verschillende hoeveelheden van antilichaam tot optimale verrijking wordt waargenomen. Ook eiwit G sepharose mag worden vervangen door EiwitA sepharose afhankelijk van het subtype van antilichaam gebruikt.</li>
	<li>De geblokkeerde kralen toevoegen de volgende dag en incubeer gedurende 1 h met rotatie (40-60 rpm) bij 4 ° C. Centrifuge bij 400 x g gedurende 20-30-s tot de kralen pellet, verwijder het supernatant en start de ChIP wast.</li>
	<li>ChIP wast: uitvoeren van de volgende wast met de buffers: met een laag zout Buffer, en vervolgens tweemaal met hoog zout Buffer, tweemaal met LiCl Buffer, en ten slotte tweemaal met de Buffer TE.
	<ol><li>Uitvoeren van elk wassen gedurende 10 minuten met rotatie (40-60 rpm) bij 4 ° C- and -pellet de parels tussen elke wassen door centrifugeren bij 400 x g gedurende 20-30 s in een bench-top centrifuge.</li>
	</ol></li> <li>Voor elutie, verwijderen de laatste wassen en resuspendeer de kralen in 250 µL elutie buffer (vers bereid) gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur tijdens het schudden.</li>
	<li>Centrifuge bij 400 x g en verzamel het eluaat in een verse buis. Uitvoeren van deze stap tweemaal en vervolgens de-dwarslijn het eluaat overnachting met 20 µL NaCl 5 M en 1 µL RNase A (10 mg/mL), behandelen met proteïnase K en fenol-chloroform/chloroform extrhandelen zoals in stap 6.</li>
	<li>Resuspendeer in 50 µL van TE buffer en gebruik aliquots voor ChIP-qPCR volgens standaard protocollen 15 om te controleren de kwaliteit van de ChIP.</li>
</ol>

<ol><li>Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions.</a> Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).</li>
<li>Furey, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+and+beyond%3A+new+and+improved+methodologies+to+detect+and+characterize+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions.</a> Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).</li>
<li>Wade, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+Transcription+Regulatory+Networks+with+ChIP-seq+and+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Mapping Transcription Regulatory Networks with ChIP-seq and RNA-seq.</a> Adv Exp Med Biol. 883, 119-134 (2015).</li>
<li>Alpern, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAF4%2C+a+subunit+of+transcription+factor+II+D%2C+directs+promoter+occupancy+of+nuclear+receptor+HNF4A+during+post-natal+hepatocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">TAF4, a subunit of transcription factor II D, directs promoter occupancy of nuclear receptor HNF4A during post-natal hepatocyte differentiation.</a> Elife. 3, e03613(2014).</li>
<li>Martianov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+occupancy+of+an+extended+repertoire+of+CREM+and+CREB+binding+loci+in+male+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Cell-specific occupancy of an extended repertoire of CREM and CREB binding loci in male germ cells.</a> BMC Genomics. 11, 530(2010).</li>
<li>Achour, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+identity+genes+regulated+by+super-enhancers+are+preferentially+down-regulated+in+the+striatum+of+Huntington%27s+disease+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Neuronal identity genes regulated by super-enhancers are preferentially down-regulated in the striatum of Huntington's disease mice.</a> Hum Mol Genet. 24 (12), 3481-3496 (2015).</li>
<li>Joshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TEAD+transcription+factors+are+required+for+normal+primary+myoblast+differentiation+in+vitro+and+muscle+regeneration+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">TEAD transcription factors are required for normal primary myoblast differentiation in vitro and muscle regeneration in vivo.</a> PLoS Genet. 13 (2), e1006600(2017).</li>
<li>Ohkawa, Y., Mallappa, C., Dacwag-Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOhkawa%2C+Y+%22Myogenesis%3A+Methods+and+protocols%22">Myogenesis: Methods and protocols</a>. DiMario, J. 798, Springer Science+Business Media LLC. 517-531 (2012).</li>
<li>Dimauro, I., Pearson, T., Caporossi, D., Jackson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+protocol+for+the+subcellular+fractionation+of+skeletal+muscle+cells+and+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">A simple protocol for the subcellular fractionation of skeletal muscle cells and tissue.</a> BMC Res Notes. 5, 513(2012).</li>
<li>Thomas, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAK1+and+CtBP1+Regulate+the+Coupling+of+Neuronal+Activity+to+Muscle+Chromatin+and+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">PAK1 and CtBP1 Regulate the Coupling of Neuronal Activity to Muscle Chromatin and Gene Expression.</a> Mol Cell Biol. 35 (24), 4110-4120 (2015).</li>
<li>Kuo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+glucocorticoid+receptor-binding+sites+in+myotubes+identifies+gene+networks+modulating+insulin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of glucocorticoid receptor-binding sites in myotubes identifies gene networks modulating insulin signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (28), 11160-11165 (2012).</li>
<li>Whyte, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Master+transcription+factors+and+mediator+establish+super-enhancers+at+key+cell+identity+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes.</a> Cell. 153 (2), 307-319 (2013).</li>
<li>Benhaddou, A., Keime, C., Ye, T., Morlon, A., Michel, I., Jost, B., Mengus, G., Davidson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+TEAD4+regulates+expression+of+myogenin+and+the+unfolded+protein+response+genes+during+C2C12+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Transcription factor TEAD4 regulates expression of myogenin and the unfolded protein response genes during C2C12 cell differentiation.</a> Cell Death and Differentiation. 19 (2), 220-231 (2011).</li>
<li>Cowling, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+dynamin+2+expression+rescues+X-linked+centronuclear+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Reducing dynamin 2 expression rescues X-linked centronuclear myopathy.</a> J Clin Invest. 124 (3), 1350-1363 (2014).</li>
<li>Thermo Fisher Scientific. ChIP Analysis. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html">https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html</a> (2017).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Hier beschrijven we een nieuw protocol voor het voorbereiden van de chromatine van volwassen muis skeletspieren en Toon dat deze chromatine is geschikt voor ChIP experimenten die transcription factor binding en covalente histone modificaties in de spiervezel kernen detecteren. Dit protocol omvat verschillende kritische stappen. De eerste is de verstoring van de weefsels die kan worden uitgevoerd hetzij door dounce hetzij door mechanische schuintrekken. Mechanische schuintrekken sneller en meer reproduceerbaar is, en daar...

Immunoprecipitation (ChIP) van de chromatine gekoppeld aan kwantitatieve polymerase-kettingreactie (qPCR) en hoge doorvoer sequencing (ChIP-seq) zijn geworden de keuze om te studeren transcriptie en Epigenetische regulatie van de genexpressie in verschillende weefsels en celtypes1. Deze techniek maakt het mogelijk genoom-brede profilering van covalente chromatine wijzigingen, histone variant bezetting en transcriptie factor bindende2,3.
Terwijl het uitvoeren van ChIP uit gekweekte cellen goed ingeburgerd is, blijft ChIP van zoogdieren weefsels uitdagend. Chromatine voorbereiden ChIP bestaat uit verschillende kritische stappen die moeten worden geoptimaliseerd voor elk type weefsel en cel. Chromatine kan bereid worden uit de cellulaire lysates van gekweekte cellen of volgende zuivering van hun kernen. In het geval van zoogdieren weefsels staan efficiënte lysis, formaldehyde fixatie en reiniging van kernen kritisch tegenover met het oog op een optimale terugwinning van de chromatine. Bovendien moet de keuze of u kunt het oplossen van de kernen, vóór of na hun zuivering experimenteel worden bepaald. Ondanks deze hindernissen, is ChIP met succes uitgevoerd van weefsels zoals de lever, testis of hersenen4,5,6. In het geval van skeletspieren vormt verstoring van dergelijke een fysiek resistente weefsel, dat een hoog gehalte aan structurele proteïnen, en isolatie van de kernen vertoont een bijzondere uitdaging. Gezien deze specificiteit, geven protocollen geoptimaliseerd voor andere weefsels geen bevredigende resultaten voor skeletspieren.
Hier beschrijven we een protocol om te isoleren van de ChIP-grade chromatine van muis skeletspieren weefsel, waarbij het weefsel, formaldehyde fixatie, waarna het isolement van de kernen en ultrasoonapparaat fysiek te verstoren. De efficiëntie van deze methode voor het bereiden van chromatine geschikt voor ChIP uit dit weefsel werd aangetoond door het uitvoeren van ChIP-qPCR en ChIP-seq voor verschillende transcriptiefactoren, RNA polymerase II en covalente histone modificaties7.
Deze nieuwe techniek is veel sneller dan een eerder gemelde protocol8 bestaande uit lange collagenase spijsvertering stappen in die periode, wijzigingen in genomic lokalisatie van transcriptiefactoren en wijzigingen in genexpressie kunnen plaatsvinden. De snelheid waarmee de kernen zijn geïsoleerd en vaste maakt de hier beschreven methode bijzonder aantrekkelijk voor het bereiden van chromatine waarmee de inheemse genomic bezetting staat meer getrouw worden vastgelegd. Bovendien, hoewel andere methoden voor het chromatine isolatie of eiwit extractie van spierweefsel zijn beschreven8,9,10 en gebruikt voor ChIP-qPCR experimenten op geselecteerde genen, geen ChIP-seq gegevens is gemeld met hen. De methode hier gemeld is geschikt voor transcriptie factor en Histon wijziging ChIP-seq, en moet daarom ook geschikt voor 3 / 4C of HiC chromatine conformatie opname toepassingen.

<table><tbody><tr><td>T 25 digital ULTRA-TURRAX</td><td>T 18 ULTRA-TURRAX</td><td>0009022800</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE SARL</td><td>P7626-25G</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail-EDTA Free</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Protein G Sepharose beads</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>P-3296</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>P-2308</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainers 70um</td><td>Corning BV</td><td>431751</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainers 40um</td><td>Corning BV</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde EM grade</td><td>Euromedex</td><td>15710-S</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Fischer Scientific</td><td>12091039</td><td></td></tr><tr><td>Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>P3803</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>B4287-25G</td><td></td></tr><tr><td>yeast tRNA</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>R5636</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen Blue</td><td>AMIBION</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>Pol II ChIP Antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-9001</td><td></td></tr><tr><td>H3K27ac ChIP Antibody</td><td>Active Motif</td><td>39133</td><td></td></tr><tr><td>Tead4 ChIP Antibody</td><td>Aviva Systems Biology</td><td>(ARP38276_P050)</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>I-3021</td><td></td></tr><tr><td>E220 Focused Ultrasonicator</td><td>Covaris E220</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Aanvullende items</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schaar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Losse Dounce</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml en 50 ml falconbuisjes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>14 ml ronde bodembuisjes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml en 2 ml Eppendorfbuisjes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 &mu;m en 40 &mu;m celsifters (Corning)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

verbeterde protocol voor chromatine immunoprecipitation van muis skeletspieren

Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

Beschrijven we een efficiënte en reproduceerbare protocol voor de voorbereiding van de chromatine van volwassen muis skeletspieren, een fysiek resistente weefsel met een hoog gehalte aan structurele proteïnen. Ontleed ledemaat spieren van volwassen muizen zijn fysiek verstoord door mechanische homogenisering, of een combinatie van hakken en douncing, in een hypotone buffer voordat formaldehyde fixatie van de cel lysate. De vaste kernen zijn gezuiverd door verdere cycli van mechanische homogenisering of douncing en opeenvolgende filteringen cel puin te verwijderen. De gezuiverde kernen kunnen onmiddellijk of in een later stadium worden sonicated na invriezen. De chromatine efficiënt kan worden sonicated en is geschikt voor chromatine immunoprecipitation experimenten, zoals wordt geïllustreerd door de profielen verkregen voor transcriptiefactoren, RNA polymerase II en covalente histone modificaties. De gebeurtenissen van de bindende gedetecteerd met behulp van chromatine bereid door dit protocol zijn overwegend die plaatsvindt in de kernen van de spiervezel ondanks de aanwezigheid van de chromatine van andere vezel-geassocieerde satelliet en endotheliale cellen. Dit protocol is daarom aangepast aan het bestuderen van genregulatie in de skeletspieren volwassen muis.

Om te isoleren kernen, we uitgevoerd mechanische homogenisering van de ontleed en gehakt spierweefsel voor 15 of 45 s, van 18.000 en 22.000 toeren per minuut (Zie Tabel van materialen). In alle omstandigheden, kernen van het weefsel puin kunnen worden gescheiden, maar de opbrengst was optimaal gebruik van de lagere snelheid (figuur 1A-B). Kernen kunnen ook worden voorbereid door douncing 3-5 min (figuur 1...

Een nieuw protocol voor de voorbereiding van de chromatine van volwassen muis skeletspieren aangepast aan de studie van genregulatie in spiervezels door chromatine immunoprecipitation wordt gepresenteerd.

Verbeterde Protocol voor chromatine Immunoprecipitation van muis skeletspieren

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a ...

Het algemene doel van deze procedure is om chromatine uit volwassen muisskeletspier voor te bereiden. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over genexpressie en skeletspiervezels. Het grote voordeel van deze techniek is dat het de voorbereiding van ChIP-kwaliteit chromatine uit muisskeletspier mogelijk maakt.Een fysiek resistent weefsel met een hoog gehalte aan structurele eiwitten. We hadden het idee voor deze methode toen we de moleculaire mechanismen wilden karakteriseren die ten grondslag liggen aan gluco-gearticuleerde gebruiksspieratrofie, wat de identificatie vereist van de gluco-gearticuleerde receptor, DNA-bindende sites in muisskeletspiervezels. De procedure zal worden gedemonstreerd door Shilpy Joshi, een post-doc uit ons lab.Om met deze procedure te beginnen, haalt u bevroren of vers gedissekteerde achterste ledematenspieren terug. Hak vervolgens de spieren in een twee-milliliter testbuisje, met één milliliter ijskoude hypotone buffer, in een homogene bereiding van kleine stukjes, met behulp van fijne schaars. Laat de buis vervolgens vijf tot tien minuten schudden op een tafelroerder bij vier graden Celsius.Breng vervolgens het gedissekteerde weefsel over naar een ronde bodembuis van 14 milliliter met vier milliliter koude hypotone buffer. Homogeniseer het gehakte weefsel gedurende 15 tot 30 seconden met een mechanische weefselhomogenisator. Breng vervolgens het homogenaat over naar een 15-milliliterbuis.Voeg koude hypotone buffer toe om een totaal van 10 milliliter aan het monster te bereiken en fixeer het homogenaat voordat u doorgaat met de volgende muis. Voeg in deze procedure formaldehyde toe aan het monster om een eindconcentratie van 1% te bereiken. Schud vervolgens gedurende 10 minuten op kamertemperatuur.Voeg vervolgens glycine toe om een eindconcentratie van 0,125 molair in elke buis te bereiken om de fixatie te stoppen. Schud gedurende vijf tot tien minuten op kamertemperatuur. Homogeniseer vervolgens het gefixeerde lysaat met een losse dounce.Breng het vervolgens over naar een 15-milliliterbuis en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 1000 g bij vier graden Celsius om kernen en cellulaire deeltjes te verkrijgen. Verwijder na vijf minuten het supernatant en suspendeer de pellet opnieuw in vijf milliliter verse hypotone buffer. Filter het lysaat door een 70-micrometer celzevener in een 50-milliliterbuis.Was vervolgens het zevener met één milliliter koude hypotone buffer met behulp van een pipettentip. Filter daarna het filtraat opnieuw door een 40-micrometer celzevener. Breng vervolgens het filtraat over in een 15-milliliterbuis.En centrifugeer gedurende vijf minuten bij 1000 g bij vier graden Celsius om het nucleaire pellet te verkrijgen. Gooi het supernatant weg en gebruik één milliliter hypotone buffer om de drie pellets samen te brengen en over te brengen naar een 1,5 tot twee-milliliterbuis. Centrifugeer gedurende vijf minuten bij 1000 g.Bepaal vervolgens het volume van het nucleaire pellet door vergelijking met buisjes met een bekend volume vloeistof en suspendeer het opnieuw in sonificatiebuffer tot drie tot vier keer het volume van het verpakte nucleaire pellet. Soniceer vervolgens de suspensie gedurende 10 tot 15 minuten bij vier graden Celsius met behulp van een sonicator. Centrifugeer het gesonificeerde monster en breng het chromatinesupernatant over naar een verse 1,5-milliliterbuis.Voer voor de ontkruising een behandeling uit met 30 microliter chromatine in een 1,5-milliliter testbuisje en voeg 20 microliter vijf molair natriumchloride en 450 microliter water toe. Breng het volume aan tot 500 microliter en incubeer gedurende een nacht bij 65 graden Celsius. De volgende dag voert u een behandeling uit met één microliter Proteinase K, 10 microliter twee molair tris bij pH 6,8 en 10 microliter 0,5 molair EDTA gedurende één uur bij 42 graden Celsius.Voer vervolgens een reguliere fenol-chloroform chloroform extractie uit en precipiteer het DNA met één volume natriumacetaat en twee volumes 100% ethanol gedurende één uur bij min 80 graden Celsius of een nacht bij min 20 graden Celsius. Pellet het DNA vervolgens door centrifugatie gedurende 15 minuten bij 13.500 g. Gooi het supernatant weg en was de pellet grondig met koud 70% ethanol en centrifugeer opnieuw gedurende vijf minuten.Gooi vervolgens het supernatant weg en laat de pellet drogen. Suspendeer de pellet vervolgens opnieuw in het oorspronkelijke volume tris HCl EDTA buffer. Meet de DNA-concentratie in een spectrofotometer door absorptie bij 260 nanometer, 280 nanometer.Pipet vervolgens 500 tot 1000 nanogram DNA samen met een DNA-grootteladder op afzonderlijke sporen van een 1,5% agarosegel. En voer elektroforese uit om de fragmentgrootte van chromatine te beoordelen. Om te optimaliseren, werd homogenisatie uitgevoerd gedurende 15 seconden of 45 seconden bij twee snelheden, 18.000 en 22.000 RPM.In alle omstandigheden konden kernen worden gescheiden van het weefseldebris, maar de opbrengst was optimaal bij lagere snelheid. Kernen konden ook worden bereid door gedurende drie tot vijf minuten te douncen. Maar mechanische homogenisatie is de voorkeursmethode, omdat optimale opbrengsten van kernen in slechts 15 seconden kunnen worden bereikt, wat een belangrijk tijdswinst oplevert, vooral als meerdere monsters moeten worden verwerkt.Met behulp van dit protocol kunnen tot 2,7 keer 10 tot de zevende kernen uit 500 milligram weefsel worden geïsoleerd om 100 microgram chromatine te genereren. Chromatine dat op deze manier is bereid, geeft schone, hoogwaardige resultaten in ChIP-sequencing-experimenten. Zoals geïllustreerd door de hoge niveaus van geacetyleerd K27 van histon H3 en RNA-polymerase 2 op de spier-geëxprimeerde Desmond-locus.De specificiteit voor spiervezels wordt aangetoond door een laag of afwezige signaal op de Pecam1 en Vcam1 loci die niet in spieren worden geëxprimeerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de homogenisator sonde goed in het monster te onderdompelen

improved-protocol-for-chromatin-immunoprecipitation-from-mouse

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Demonstreren we een chromatine immunoprecipitatie (ChIP) methode om factor interacties op weefsel-specifieke genen te identificeren tijdens of na het begin van weefsel-specifieke genexpressie in muis embryonale weefsel. Dit protocol moet worden breed toepasbaar voor de studie van weefsel-specifieke gen activatie als het zich voordoet tijdens de normale embryonale ontwikkeling.

Chromatine immunoprecipitatie assay for Tissue-specifieke genen met behulp van een vroeg stadium muizenembryo&#39;s

We beschrijven een robuuste methode voor het chromatine immunoprecipitatie met primaire T-cellen. De methode is gebaseerd op standaard methoden, maar gebruikt een specifieke set van omstandigheden en reagentia die de efficiëntie van een beperkte hoeveelheid cellen verbeteren. Belangrijk is een gedetailleerde beschrijving van de data analysefase gepresenteerd.

Efficiënte Chromatine immunoprecipitatie behulp Beperking hoeveelheden biomassa

Dit werk beschrijft een protocol voor chromatine immunoprecipitatie (ChIP) met behulp van een volwassen T-cellijn van de muis. Dit protocol is geschikt om de verdeling van specifieke histonenmerken op specifieke promotor sites of genoombreed te onderzoeken.

Chromatine Immunoprecipitatie (ChIP) in Muis T-cellijnen

Wij presenteren een protocol op basis van filtratie om hoogwaardige kernen te isoleren van de cross-linked museskeletspier waarbij we de behoefte aan ultracentrifugatie hebben verwijderd, waardoor het gemakkelijk toepasbaar is. We laten zien dat chromatine bereid uit de kernen geschikt is voor chromatine immunoprecipitatie en waarschijnlijk chromatin immunoprecipitatie sequencing studies.

Een filtratie-gebaseerde methode om hoogwaardige kernen uit kruisgebonden skeletspier voor chromatine immunoprecipitatie te bereiden

Presenteren we een effectieve en reproduceerbare methode om te isoleren en cultuur van neurale voorlopercellen van embryonale en postnatale hersenweefsel voor chromatine immunoprecipitation (ChIP) van Histon 3 lysine 79 dimethylation (H3K79me2) - een Histon mark gelegen binnen de bolvormige domein van Histon 3.

Isolatie en teelt van neurale progenitoren gevolgd door chromatine-Immunoprecipitation van Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

Hier beschrijven we een protocol voor het chromatine immunoprecipitation van gemodificeerde histonen uit de ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecipitated DNA wordt vervolgens gebruikt voor kwantitatieve PCR te ondervragen de overvloed en lokalisatie van Histon posttranslationele modificaties in het genoom.

Chromatine Immunoprecipitation (ChIP) van Histone modificaties van Saccharomyces cerevisiae

Hier beschrijven we een protocol voor efficiënte chromatine immunoprecipitation (ChIP), gevolgd door high-throughput DNA sequentiebepaling (ChIP-seq) van bruin vetweefsel (BAT) geïsoleerd van een muis. Dit protocol is geschikt voor zowel mapping histone modificaties en genoom-brede lokalisatie van niet-Histon proteïnen van belang in vivoonderzoeken.

Chromatine Immunoprecipitation van lymfkliertest bruin vetweefsel

Chromatin immunoprecipitatie (chip) is een krachtig hulpmiddel voor het begrijpen van de moleculaire mechanismen van genregulatie. De methode omvat echter moeilijkheden bij het verkrijgen van reproduceerbare chromatine fragmentatie door mechanische afschuiving. Hier bieden we een verbeterd protocol voor een ChIP assay met enzymatische spijsvertering.

Chromatische immunoprecipitatie test met behulp van Micrococcal nucleasen in zoogdiercellen

Dit protocol richt zich op chromatinepreparatie uit snap bevroren weefsels en is geschikt voor Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) gevolgd door kwantitatieve PCR-analyse (X-ChIP-qPCR) of next generation sequencing-benaderingen (X-ChIP-seq).

Chromatine-extractie uit bevroren chimere leverweefsel voor chromatine-immunoprecipitatieanalyse

Hier wordt een efficiënt protocol gepresenteerd voor de fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) isolatie van spiersatellietcellen van muizenledematen, aangepast aan de studie van transcriptieregulatie in spiervezels door splitsing onder doelen en afgifte met behulp van nuclease (CUT&amp;RUN).

Een efficiënt protocol voor CUT&amp;RUN-analyse van FACS-geïsoleerde muissatellietcellen

Onderzoekers die nieuw zijn in het epigenetische veld zullen CUT&amp;Tag een aanzienlijk eenvoudiger alternatief vinden voor ChIP-tests. CUT&amp;Tag heeft enorm geprofiteerd van de epigenetische studies op zeldzame en primaire celpopulaties, door hoogwaardige gegevens te genereren uit zeer weinig cellen. Dit protocol beschrijft het uitvoeren van H3K4me1 CUT&amp;Tag-assays op muizenmyoblasten geïsoleerd uit de achterpotspieren van muizen.

Met behulp van splitsing onder doelen en tagmentatie (CUT&#38;tag) assay in muizenmyoblastonderzoek

Leer een verbeterd protocol voor chromatine-immunoprecipitatie van muis skeletspieren. Deze methode maakt ChIP-kwaliteit chromatin preparatie mogelijk uit weefsel met hoge structurele eiwitgehalte.

Verbeterde Protocol voor chromatine Immunoprecipitation van muis skeletspieren

Meer video's verkennen