Verbeterde Protocol voor chromatine Immunoprecipitation van muis skeletspieren
6 november 2017
Een nieuw protocol voor de voorbereiding van de chromatine van volwassen muis skeletspieren aangepast aan de studie van genregulatie in spiervezels door chromatine immunoprecipitation wordt gepresenteerd.
Het algemene doel van deze procedure is om chromatine uit volwassen muisskeletspier voor te bereiden. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over genexpressie en skeletspiervezels. Het grote voordeel van deze techniek is dat het de voorbereiding van ChIP-kwaliteit chromatine uit muisskeletspier mogelijk maakt.
Een fysiek resistent weefsel met een hoog gehalte aan structurele eiwitten. We hadden het idee voor deze methode toen we de moleculaire mechanismen wilden karakteriseren die ten grondslag liggen aan gluco-gearticuleerde gebruiksspieratrofie, wat de identificatie vereist van de gluco-gearticuleerde receptor, DNA-bindende sites in muisskeletspiervezels. De procedure zal worden gedemonstreerd door Shilpy Joshi, een post-doc uit ons lab.
Om met deze procedure te beginnen, haalt u bevroren of vers gedissekteerde achterste ledematenspieren terug. Hak vervolgens de spieren in een twee-milliliter testbuisje, met één milliliter ijskoude hypotone buffer, in een homogene bereiding van kleine stukjes, met behulp van fijne schaars. Laat de buis vervolgens vijf tot tien minuten schudden op een tafelroerder bij vier graden Celsius.
Breng vervolgens het gedissekteerde weefsel over naar een ronde bodembuis van 14 milliliter met vier milliliter koude hypotone buffer. Homogeniseer het gehakte weefsel gedurende 15 tot 30 seconden met een mechanische weefselhomogenisator. Breng vervolgens het homogenaat over naar een 15-milliliterbuis.
Voeg koude hypotone buffer toe om een totaal van 10 milliliter aan het monster te bereiken en fixeer het homogenaat voordat u doorgaat met de volgende muis. Voeg in deze procedure formaldehyde toe aan het monster om een eindconcentratie van 1% te bereiken. Schud vervolgens gedurende 10 minuten op kamertemperatuur.
Voeg vervolgens glycine toe om een eindconcentratie van 0,125 molair in elke buis te bereiken om de fixatie te stoppen. Schud gedurende vijf tot tien minuten op kamertemperatuur. Homogeniseer vervolgens het gefixeerde lysaat met een losse dounce.
Breng het vervolgens over naar een 15-milliliterbuis en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 1000 g bij vier graden Celsius om kernen en cellulaire deeltjes te verkrijgen. Verwijder na vijf minuten het supernatant en suspendeer de pellet opnieuw in vijf milliliter verse hypotone buffer. Filter het lysaat door een 70-micrometer celzevener in een 50-milliliterbuis.
Was vervolgens het zevener met één milliliter koude hypotone buffer met behulp van een pipettentip. Filter daarna het filtraat opnieuw door een 40-micrometer celzevener. Breng vervolgens het filtraat over in een 15-milliliterbuis.
En centrifugeer gedurende vijf minuten bij 1000 g bij vier graden Celsius om het nucleaire pellet te verkrijgen. Gooi het supernatant weg en gebruik één milliliter hypotone buffer om de drie pellets samen te brengen en over te brengen naar een 1,5 tot twee-milliliterbuis. Centrifugeer gedurende vijf minuten bij 1000 g.
Bepaal vervolgens het volume van het nucleaire pellet door vergelijking met buisjes met een bekend volume vloeistof en suspendeer het opnieuw in sonificatiebuffer tot drie tot vier keer het volume van het verpakte nucleaire pellet. Soniceer vervolgens de suspensie gedurende 10 tot 15 minuten bij vier graden Celsius met behulp van een sonicator. Centrifugeer het gesonificeerde monster en breng het chromatinesupernatant over naar een verse 1,5-milliliterbuis.
Voer voor de ontkruising een behandeling uit met 30 microliter chromatine in een 1,5-milliliter testbuisje en voeg 20 microliter vijf molair natriumchloride en 450 microliter water toe. Breng het volume aan tot 500 microliter en incubeer gedurende een nacht bij 65 graden Celsius. De volgende dag voert u een behandeling uit met één microliter Proteinase K, 10 microliter twee molair tris bij pH 6,8 en 10 microliter 0,5 molair EDTA gedurende één uur bij 42 graden Celsius.
Voer vervolgens een reguliere fenol-chloroform chloroform extractie uit en precipiteer het DNA met één volume natriumacetaat en twee volumes 100% ethanol gedurende één uur bij min 80 graden Celsius of een nacht bij min 20 graden Celsius. Pellet het DNA vervolgens door centrifugatie gedurende 15 minuten bij 13.500 g. Gooi het supernatant weg en was de pellet grondig met koud 70% ethanol en centrifugeer opnieuw gedurende vijf minuten.
Gooi vervolgens het supernatant weg en laat de pellet drogen. Suspendeer de pellet vervolgens opnieuw in het oorspronkelijke volume tris HCl EDTA buffer. Meet de DNA-concentratie in een spectrofotometer door absorptie bij 260 nanometer, 280 nanometer.
Pipet vervolgens 500 tot 1000 nanogram DNA samen met een DNA-grootteladder op afzonderlijke sporen van een 1,5% agarosegel. En voer elektroforese uit om de fragmentgrootte van chromatine te beoordelen. Om te optimaliseren, werd homogenisatie uitgevoerd gedurende 15 seconden of 45 seconden bij twee snelheden, 18.000 en 22.000 RPM.
In alle omstandigheden konden kernen worden gescheiden van het weefseldebris, maar de opbrengst was optimaal bij lagere snelheid. Kernen konden ook worden bereid door gedurende drie tot vijf minuten te douncen. Maar mechanische homogenisatie is de voorkeursmethode, omdat optimale opbrengsten van kernen in slechts 15 seconden kunnen worden bereikt, wat een belangrijk tijdswinst oplevert, vooral als meerdere monsters moeten worden verwerkt.
Met behulp van dit protocol kunnen tot 2,7 keer 10 tot de zevende kernen uit 500 milligram weefsel worden geïsoleerd om 100 microgram chromatine te genereren. Chromatine dat op deze manier is bereid, geeft schone, hoogwaardige resultaten in ChIP-sequencing-experimenten. Zoals geïllustreerd door de hoge niveaus van geacetyleerd K27 van histon H3 en RNA-polymerase 2 op de spier-geëxprimeerde Desmond-locus.
De specificiteit voor spiervezels wordt aangetoond door een laag of afwezige signaal op de Pecam1 en Vcam1 loci die niet in spieren worden geëxprimeerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de homogenisator sonde goed in het monster te onderdompelen
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een nieuw protocol voor het prepareren van chromatine uit skeletspierweefsel van volwassen muizen, specifiek aangepast voor het bestuderen van genregulatie in spiervezels via chromatine-immunoprecipitatie (ChIP). De methode pakt de uitdagingen aan die ontstaan door de fysieke resistentie en het gehalte aan structurele eiwitten in skeletspierweefsel.
Belangrijkste Onderdelen van het Onderzoek
Wetenschapsgebied
- Genregulatie
- Chromatine-immunoprecipitatie
- Skeletspierbiologie
Achtergrond
- De preparatie van chromatine is cruciaal voor het bestuderen van genregulatie.
- Skeletspierweefsel van muizen is een complex weefsel met een hoog gehalte aan structurele eiwitten.
- Het begrijpen van de moleculaire mechanismen bij spieratrofie is essentieel voor therapeutische strategieën.
- De identificatie van DNA-bindingsplaatsen is noodzakelijk voor het karakteriseren van genregulatie.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor het prepareren van chromatine van ChIP-kwaliteit uit skeletspierweefsel van muizen.
- Om de studie naar genregulatie in spiervezels te vergemakkelijken.
- Om de moleculaire mechanismen die ten grond liggen aan spieratrofie te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- Preparatie van chromatine uit skeletspierweefsel van volwassen muizen.
- Toepassing van chromatin immunoprecipitatie-technieken.
- Karakterisering van gluco-gearticuleerde receptoren en DNA-bindingsplaatsen.
- Demonstratie van de procedure door een postdoctoraal onderzoeker.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle preparatie van chromatine van ChIP-kwaliteit uit resistent skeletspierweefsel.
- Identificatie van cruciale DNA-bindingsplaatsen die relevant zijn voor de regulatie van spiergenen.
- Inzichten in de moleculaire mechanismen van spieratrofie.
- Validatie van de effectiviteit van de methode voor toekomstig onderzoek.
Conclusies
- Het ontwikkelde protocol verbetert de studie naar genregulatie in skeletspieren.
- Het biedt een waardevol instrument voor onderzoekers die spierbiologie bestuderen.
- Toekomstige toepassingen kunnen leiden tot een verbeterd begrip van spieratrofie en gerelateerde aandoeningen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Het verkrijgen van hoogwaardig chromatine uit fysiek resistente weefsels, zoals skeletspierweefsel, blijft een knelpunt bij de epigenetische validatie van targets. Dit protocol maakt de reproduceerbare isolatie van kernen en sonicatie van chromatine mogelijk die geschikt is voor immunoprecipitatie, wat bijdraagt aan de mechanische risicoreductie van transcriptiefactoren en histonmodificerende targets in ziektemodellen gerelateerd aan spieren. Door een schaalbare, gestandaardiseerde aanpak voor de bereiding van chromatine van ChIP-kwaliteit te bieden, wordt het voorspellend vertrouwen vergroot in vroege discovery-workflows die gericht zijn op de pathofysiologie van skeletspieren.
Strategische toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om transcriptionele regulatie in skeletspiervezels te onderzoeken om targets te valideren die betrokken zijn bij atrofie en metabole paden.
- Operationele waarde: Levert consistente chromatinopbrengsten uit resistent weefsel, waardoor de variabiliteit in target engagement assays wordt verminderd.
Screening & assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Produceert ChIP-klaar chromatine voor high-throughput screening van verbindingen die epigenetische regulatoren in spieren beïnvloeden.
- Operationele waarde: Gestandaardiseerde stappen voor kernzuivering en sonicatie ondersteunen de reproduceerbaarheid van de assay tussen verschillende laboratoria.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert de afstemming van biomarkers door histonmodificaties en de bezetting van transcriptiefactoren in ziekterelevante spiermodellen in kaart te brengen.
- Operationele waarde: Maakt longitudinale chromatineanalyse uit bevroren weefsel mogelijk, wat de preklinische continuïteit en doelwitvalidatie over verschillende studiefasen ter ondersteuning.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode past binnen het ontdekkingscontinuüm door chromatine-preparatie voor doelwitvalidatie mogelijk te maken, gevolgd door immunoprecipitatie en sequencing om leidingidentificatie en preklinische beoordeling van epigenetische modulatoren in skeletspierweefsel te informeren.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothese-testen van genreguleringsmechanismen in modellen voor spieratrofie en metabole ziekten.
- Screening: Biedt een gestandaardiseerd chromatinesubstraat voor het evalueren van compound-effecten op epigenetische targets.
- Analytics: Genereert kwantitatieve ChIP-seq read-outs voor het vergelijken van target-binding over verschillende condities.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt epigenetische bevindingen uit de ontdekkingsfase met preklinische validatie door middel van consistente chromatinepreparatie.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor kernisolatie en chromatinepreparatie voor epigenetica-programma's van skeletspieren.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verbetert de betrouwbaarheid van targetvalidatie door ruis van chromatine uit niet-spiercellen in skeletspiermonsters te verminderen.
- Operationele waarde: Verhoogt de doorvoer via snelle mechanische homogenisatie, waardoor meerdere monsters in korte tijdsbestekken kunnen worden verwerkt.
- Strategische waarde: Ondersteunt go/no-go-beslissingen in epigenetische targetprogramma's door betrouwbare, spierspecifieke chromatinegegevens te leveren.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets mogelijk op basis van reproduceerbare epigenetische profilering in ziekterelateerd weefsel.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in weefselhomogenisatie, nuclei-isolatie en de omgang met chromatine om degradatie te voorkomen.
- Is afhankelijk van toegang tot sonicatie-apparatuur die geoptimaliseerd is voor chromatinefragmentatie zonder oververhitting.
- Vereist gestandaardiseerde buffercondities en filtratiestappen om reproduceerbaarheid tussen gebruikers en locaties te garanderen.
- Moet rekening houden met weefselspecifieke variabelen, zoals vezeltype en letselstatus, bij het toepassen van het protocol op ziektemodellen.
- Praktische beperkingen omvatten de noodzaak voor zorgvuldige optimalisatie van de sonicatietijd en temperatuur om een optimale fragmentgrootte te bereiken.
