Toezicht op het Effect van de Stress van de osmotische op secretoire blaasjes en exocytose
19 februari 2018
Osmotische stress beïnvloedt exocytose en de hoeveelheid neurotransmitter uitgebracht tijdens dit proces. We laten zien hoe elektrochemische methoden samen met transmissie-elektronenmicroscopie combineren kan worden gebruikt voor het bestuderen van het effect van extracellulaire osmotische druk op exocytose activiteit, blaasje quantal grootte en de hoeveelheid neurotransmitter vrijgegeven tijdens exocytose.
Het algemene doel van deze gecombineerde analytische methodologie is om informatie te verschaffen over hoe secretoire vesiculen in cellen reageren op een fysische kracht, zoals extracellulaire osmotische druk, en hoe aanpassingen van deze organellen het exocytoseproces verder beïnvloeden. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van de neurowetenschappen, zoals hoe secretoire vesiculen direct reageren op veranderingen in de extracellulaire omgeving of op medicamenteuze behandeling? Het belangrijkste voordeel van deze aanpak is het monitoren van directe effecten op het vesiculaire gehalte bij levende cellen en het onderscheid kennen tussen veranderingen in hun chemische afgifte voor en na exocytose.
Plaats de elektrode in de houder van een microslijper en schuin elke koolstofvezelelektrode onder een hoek van 45 graden om een vlakke schijfelektrodeoppervlak te verkrijgen. Markeer daarna de capillair voor toekomstig gebruik van hoe de schijfelektrodeoppervlak op een hoek van 45 graden kan worden geplaatst wanneer de elektrode nabij cellen wordt geplaatst voor exocytosemeting. Om amperometrische opname bij enkele cellen uit te voeren, monteer de vers geslepen en geteste koolstofvezelschijfmicroelektrode in de elektrodehouder van de hoofdfase die wordt gebruikt met een potentiostaat.
Plaats voor gebruik elke koolstofvezelmicroelektrode in een testoplossing om de studiestaatstroom te controleren met behulp van cyclische voltammetrie. Voor een cyclische voltammetrie scan, pas een driehoekspotentiaalgolfvorm toe van negatief 0,2 volt tot positief 0,8 volt tegen een zilver-zilverchloridereferentie-elektrode bij 100 millivolt per seconde om een goede reactiekinetiek te garanderen. Voor amperometrische opname van exocytose, plaats de petrischaal met gekweekte chromaffine cellen in isotone buffer op een omgekeerde microscoop in een Faraday-kooi.
Gebruik een microscoopverwarmingsfase om een temperatuur van 37 graden Celsius te handhaven tijdens de celexperimenten. Gebruik vervolgens een laag-ruis patch clamp-instrument om een constante potentiaal van positief 700 millivolt aan de werkelektrode toe te passen. Voor het opnemen van exocytose van chromaffine cellen, digitaliseer het signaal bij 10 kilohertz en pas een interne laagdoorlaat Bessel-filter toe bij twee kilohertz om het opgenomen signaal te filteren.
Let erop dat de ovale schijfelektrode vlak op de cellen en parallel aan het oppervlak van de petrischaal moet worden geplaatst. Ook worden elektroden dezelfde dag als experimenten geslepen om een schone elektrodeoppervlakte te garanderen. Om de celafgifte te stimuleren, plaats een glazen micropipet gevuld met vijf millimolar bariumchloride-oplossing op een afstand van minimaal 20 micrometer van de cel.
Breng vervolgens een injectiepuls van vijf seconden van vijf millimolar bariumchloride-oplossing aan op het oppervlak van de cel om de celafgifte te stimuleren. Plaats de stampipet in de oplossing en stimuleer de celafgifte door een bariuminjectiepuls toe te passen terwijl de amperometrische stroomtransienten gedurende ongeveer drie minuten worden opgenomen. Om de exocytotische reacties onder isotone omstandigheden te vergelijken met hypertone omstandigheden, incubeer de cellen gedurende 10 minuten in hypertone bufferoplossing.
Breng vervolgens een bariuminjectiepuls toe om exocytose te stimuleren en voer drie minuten amperometrische opname uit. Voor de omkeerbare respons van cellen, incubeer de cellen opnieuw gedurende 10 minuten in een isotone bufferoplossing. Stimuleer de cellen door een bariuminjectiepuls toe te passen en voer drie minuten opname van de exocytotische respons uit.
Bereid voor het vervaardigen van de elektroden voor vesiculaire quantale groottemetingen een koolstofvezelelektrode met een diameter van vijf micrometer voor. Snijd onder een microscoop met een scalpel de koolstofvezel die uit de glazen punt steekt zodat er slechts 30 tot 100 micrometer overblijft. Gebruik een butaanvlammetje om een vlamgeëtste punt van de koolstofvezelelektrode te bereiden.
Om een gelijkmatig geëtste, cilindrisch gevormde elektrodenpunt te verkrijgen, houd de cilindrisch gevormde koolstofvezelelektrode vast terwijl deze draait. Plaats de koolstofvezel die vanuit het glas uitsteekt in de blauwe rand van de butaanvlammetje totdat het punt van de koolstof een rode kleur krijgt. Na vlametsen, plaats de elektrode onder een microscoop om de elektrodepunt te evalueren.
De grootte van de geëtste elektrodepunt moet ongeveer 50 tot 100 nanometer in diameter zijn. Plaats vervolgens de cilindrische nanotipmicroelektrode gedurende drie minuten in de epoxyoplossing gevolgd door een 15 seconden durende dompeling van de elektrodepunt in de acetonoplossing. Dit laat de epoxy de potentiële opening tussen de koolstofvezel en de isolerende gas capillaire wand afsluiten.
Terwijl het aceton de epoxy van de geëtste koolstofvezelelektrodeoppervlak verwijdert. Bak de elektroden om de epoxy te harden in een oven 's nachts bij 100 graden Celsius. Test voor gebruik de stabiele stroom van elke koolstofvezelmicroelektrode met behulp van cyclische voltammetrie.
Gebruik voor experimenten alleen elektroden die een plateaustroom rond 1,5 tot 2,5 nanoampère weergeven. Gebruik voor intracellulaire amperometrische metingen dezelfde experimentele instellingen van de potentiostaat en plaats de cellen onder de microscoop. Voorkom aanzienlijk fysiek letsel aan de cel.
Breng de cilindrische nanotipmicroelektrode in de cel in door een zachte mechanische kracht toe te passen. Net genoeg om de elektrode door het celplasmamembraan en in het celcytoplasma te duwen met behulp van een micromanipulator. Start na inbrenging, en met het celmembraan rond de cilindrische elektrode verzegeld, de amperometrische opname in-situ bij de levende cel.
Bij het oxidatiepotentiaal dat op de elektrode wordt toegepast, worden blaasjes geadsorbeerd aan het elektrodeoppervlak en stochastisch scheuren. Daarom is er geen behoefte aan enige vorm van stimulus om dit proces te initiëren. Om het osmotische effect op de vesiculaire quantale grootte te bepalen, verzamel de intracellulaire cytometriemetingen van een groep cellen die zijn geïncubeerd in isotone en in hypertone buffer
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie onderzoekt de effecten van osmotische stress op exocytose en de afgifte van neurotransmitters met behulp van een combinatie van elektrochemische methoden en transmissie-elektronenmicroscopie. Het onderzoek richt zich op de manier waarop secretoire blaasjes in cellen reageren op extracellulaire osmotische druk en de daaropvolgende effecten op de exocytose-activiteit, de kwantalgrootte van de blaasjes en de afgifte van neurotransmitters.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Elektrofysiologie
Achtergrond
- Het begrijpen van exocytose in de context van fysieke krachten is essentieel voor inzichten in de neuronale functie.
- Osmotische druk kan de vesiculaire dynamiek en de afgifte van neurotransmitters beïnvloeden.
- Huidige methodologieën maken directe observaties mogelijk van de reacties van vesicles op omgevingsveranderingen.
- Dit onderzoek verkent kritische vragen met betrekking tot vesiculaire reacties op behandeling en omgevingsverschuivingen.
Doel van de studie
- Om te onderzoeken hoe osmotische stress de exocytose en de afgifte van neurotransmitters beïnvloedt.
- Om een methodologie te ontwikkelen die real-time monitoring van ventriculaire responsen mogelijk maakt.
- Om de effecten van extracellulaire condities op cellulaire signaleringsmechanismen te verduidelijken.
Gebruikte methoden
- Er werd gebruikgemaakt van elektrochemische technieken en transmissie-elektronenmicroscopie.
- Gekweekte chromaffiene cellen dienden als biologisch model, waarbij specifiek de exocytose onder verschillende osmotische omstandigheden werd onderzocht.
- De belangrijkste experimentele stappen omvatten amperometrische registraties om exocytose-gebeurtenissen vast te leggen.
- Cellen werden geïncubeerd in isotone en hypertone buffers om osmotische effecten over gedefinieerde tijdsintervallen te analyseren.
Belangrijkste resultaten
- De studie toonde significante veranderingen in de frequentie van exocytose aan onder verschillende osmotische drukken.
- De bevindingen benadrukten de correlatie tussen osmotische omstandigheden en de quantale grootte van vesikels.
- De responsen werden gevalideerd via nauwkeurige amperometrische registraties waarmee de dynamiek van neurotransmittervrijgave in real-time werd vastgelegd.
- Inzichten in het gedrag van vesikels onder stressomstandigheden werden duidelijk gedefinieerd.
Conclusies
- Deze studie biedt een nieuw analytisch kader voor het begrijpen van vesiculaire reacties op osmotische stress.
- De methodologie maakt een gedetailleerde analyse van de dynamiek van neurotransmittervrijgave mogelijk, wat essentieel is voor neurowetenschappelijke toepassingen.
- De bevindingen verbeteren ons begrip van neuronale mechanismen en potentiële plasticiteit als reactie op omgevingsveranderingen.
Veelgestelde Vragen
Industriële Relevantie voor Management
Inzicht in hoe secretoire blaasjes reageren op extracellulaire osmotische stress biedt mechanistische inzichten in de regulatie van de afgifte van neurotransmitters, wat relevant is voor targetvalidatie bij de ontwikkeling van geneesmiddelen in de neurowetenschappen. De gecombineerde analytische benadering maakt directe meting van de vesiculaire inhoud en de dynamiek van exocytose mogelijk, wat bijdraagt aan de voorspellende betrouwbaarheid bij het beoordelen van de effecten van verbindingen op de synaptische functie. Deze methodologie helpt bij het verminderen van risico's bij hypothesen in een vroeg stadium door fysieke stressfactoren te koppelen aan quantale veranderingen in neurotransmitters in een reversibel, fysiologisch relevant model.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen over hoe fysieke stressoren de opslag en afgifte van vesiculaire neurotransmitters moduleren.
- Operationele waarde: Maakt functionele validatie mogelijk van targets die betrokken zijn bij vesikelmechanismen door osmotische stress te correleren aan een vermindering van de quantaalgrootte.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door verbindingen te identificeren die de vesiculaire hervulling of afgiftekinetiek onder stressomstandigheden veranderen.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream screening door de baseline vesiculaire kwantalgrootte en het neurotransmittergehalte vast te stellen.
- Operationele waarde: Pakt assay-standaardisatie aan via reproduceerbare amperometrische en intracellulaire cytometrische uitlezingen onder isotone en hypertone omstandigheden.
- Schaalbaarheidswaarde: Benadrukt het potentieel voor hergebruik van het platform bij het evalueren van compound-effecten op vesikelvulling en exocytosefrequentie.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele waarde: Gebruikt ziekterelevante chromaffiene cellen om stress-geïnduceerde veranderingen in de afgifte van neurotransmitters te modelleren.
- Mechanistische risicoreductie: Koppelt extracellulaire osmotische veranderingen aan intracellulaire blaasjesaanpassingen, waardoor pre- en postsynaptische mechanismen worden verduidelijkt.
- Predictieve betrouwbaarheid: Demonstreert de omkeerbaarheid van de hervulling van blaasjes na stress, wat de analyse van biomarkers in de herstelfase ondersteunt.
Pipeline- & workflowintegratie
De methode kan worden geïntegreerd in vroege discovery-workflows door het vesiculaire fenotype te koppelen aan de functionele exocytose-output, wat hypothese-gestuurde screening van neuroactieve verbindingen mogelijk maakt.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing over hoe extracellulaire krachten de vesiculaire neurotransmitterconcentratie en de afgiftekans beïnvloeden.
- Screening: Levert kwantitatieve resultaten over de vesiculaire quantalgrootte en exocytosefrequentie voor het vergelijken van effecten van verbindingen.
- Analytics: Biedt statistische distributies van afgiftegebeurtenissen van enkele vesicles en frequentieverschuivingen tijdens stress en herstel.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt de stressrespons van vesicles met preklinische continuïteit via reversibele neurotransmittervulling onder isotone omstandigheden.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor het beoordelen van de vesiculaire integriteit over meerdere screens van verbindingen en stressparadigma's.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen in targetvalidatie door directe correlatie van osmotische stress met vesiculaire quantalgrootte en neurotransmittergehalte.
- Operationele waarde: Standaardisatie en reproduceerbaarheid via gekalibreerde nanotip-elektroden en gecontroleerde osmotische incubatieprotocollen.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen door het identificeren van verbindingen die de vesiculaire hervulling verstoren of stress-geïnduceerde tekorten in de afgifte verergeren.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering op basis van mechanistische risicoreductie van neurotransmitter-afgiftepaden onder fysiologische stress.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in elektrochemische cytometrie, ampérometrie en manipulatie van levende cellen.
- Afhankelijk van gespecialiseerde instrumentatie, waaronder een potentiostaat, nanotip-microelektroden en fluorescentie- of elektronenmicroscopie voor aanvullende validatie.
- Necessiteert cross-team standaardisatie van de elektrodevoorbereiding, de formulering van de osmotische buffer en de timing van de stimulatie.
- Omvat overwegingen voor adaptatie bij uitbreiding naar niet-chromaffiene celtypen of alternatieve secretoire blaasjes.
- Praktische beperkingen omvatten variabiliteit bij de insertie van elektroden en de noodzaak van stabilisatie van het osmotisch evenwicht vóór de meting.
