Name: Karakterisering van de celmembraan extensies en het bestuderen van hun rollen in kanker cel adhesie Dynamics (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Leer hoe DKK3 lobopodia-vorming en celadhesie in adrenocorticale kankercellen bevordert. Deze methode kwantificeert celmembraanuitbreidingen om tumorcelgedrag te begrijpen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De Stichting Arbo subsidie gefinancierd dit werk.

1. mobiele extensie kenmerken
<ol><li>Handhaven van SW-13, SW-Neo en SW-DKK3 cellen in een standaard bevochtigde incubator bij 37.0 ° C en 5% CO,2 in de Dulbecco bewerkt Eagle Medium aangevuld met 10% foetale runderserum en 10.000 U/mL penicilline en streptomycine (uitgeroepen tot 'groeimedium').<ol>
<li>Cellen met behulp van een hemocytometer, tellen en plaat 5.000 cellen per putje voor SW-13, SW-Neo en SW-DKK3 lijnen in aparte 6-Wells-platen en 's nachts groeien in groeimedium op steriele glazen coverslips.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nadat overnachting groei, voor elk putje, gecombineerd het groeimedium, wassen van cellen met 1 mL warme-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), en vervolgens het herstellen van de cellen met 1 mL van 3,7% formaldehyde gedurende 10 minuten.</li>
	<li>Aspirate formaldehyde en vlek cellen in elk putje met 1 mL 0,05% kristalviolet voor 30 min. Wash overmaat kleurstof weg met behulp van drie wasbeurten van 1 mL gedeïoniseerd water. Opmerking: Afhankelijk van het niveau van opname van kleurstof, verschillende extra wasbeurten kunnen nodig zijn om achtergrond kleuring ter bevordering van de cel visualisatie te verwijderen.<ol>
<li>Met behulp van fijn omver te werpen pincet, ophalen van coverslips en leg hen gezicht naar beneden in een gelabelde glasplaatje met een daling van duidelijke montage reagens.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Onder een lichte Microscoop, willekeurig 20 weergave van niet-overlappende cellen te kiezen uit elke dekglaasje aan voor de cel extensie assay.<ol>
<li>Neem photomicrographs bij 400 x vergroting van elke gezichtsveld. Direct het aantal elk type extensie voor elk van de 20 representatieve cellen. Opmerking: zo 20 geïsoleerde cellen moeten worden onderzocht voor elke geteste voorwaarde om betrouwbare resultaten te waarborgen. Filopodia werden gedefinieerd door cellulaire extensies met een base van 5 micron of minder en een enkele apex. Lobopodia werden gedefinieerd door cellulaire extensies met een basis van 5 tot 20 micron van lengte met extensies met meerdere apices. Lamellipodia werden gedefinieerd door cel extensies die groter zijn dan 20 micron in lengte en met of zonder apices. Afhankelijk van de geteste celtype, de grootte van de cel extensies afwijken en verfijning van de identificatie van de parameters kunnen vereisen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bepaal het gemiddelde aantal de extensie van elke cel in elk celtype (d.w.z., SW-13, SW-Neo, SW-DDK) over de 6 putten onderzocht.</li>
	<li>Met behulp van een statistische toets van one-way variantieanalyse (ANOVA), vergelijk verschillen in het gemiddelde percentage van de celmembraan extensies onder de verschillende test celtypes.</li>
</ol>2. hechting Assay
<ol><li>Handhaven van SW-13, SW-Neo en SW-DKK3 cellen in een standaard bevochtigde incubator bij 37.0 ° C en 5% CO2 in groeimedium.<ol>
<li>Met behulp van een hemocytometer, tellen en plaat 100.000 cellen van SW-13, SW-Neo en SW-DKK3 per putje in aparte 6-Wells-platen en 's nachts groeien in groeimedium.</li>
		<li>Zaad 6-Wells-platen voor elk celtype getest, met behulp van één plaat voor elk van de 6 punten van de aangewezen tijd getest onder. Opmerking: De tijdstippen kunnen variëren voor verschillende soorten cellen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Na een incubatieperiode van overnachting, cellen met warme PBS keer wassen dan Voeg 0,5 mL 1 x niet-enzymatische cell dissociatie oplossing aan elk putje.<ol>
<li>Swirl de plaat om te verspreiden van de cel dissociatie oplossing. Gecombineerd de aangewezen plaat op bepaalde tijdstippen (bijvoorbeeld 1, 2, 3, 5, 10 en 15 min) en daarna wassen met 1 mL warme PBS driemaal.</li>
		<li>Tussen de wasbeurten, tik zachtjes op de platen als u wilt loskoppelen van losjes gekoppelde cellen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gecombineerd eventuele resterende PBS en fix de resterende cellen gekoppeld aan de plaat met 1 mL van 3,7% formaldehyde gedurende 10 minuten.</li>
	<li>Vlekken van cellen met 1 mL 0,05% kristalviolet voor 30 min dan wassen van overtollige kleurstof weg met 1 mL gedeïoniseerd water. Titreer wassen ter bevordering van de visualisatie van de cel. Opmerking: Afhankelijk van het niveau van opname van kleurstof, verschillende extra wasbeurten kunnen nodig zijn ter bevordering van de visualisatie van de cel.</li>
	<li>Met behulp van een lichte Microscoop op 100 x vergroting, graaf bevestigd de resterende cellen in elk putje voor elke plaat. Opmerking: Gebruik van transparante linialen of markering fijne pen gidsen aan de onderzijde van de plaat zal helpen om te voorkomen dat herhaalde tellen van dezelfde cellen.</li>
	<li>Het gemiddelde aantal gekoppelde cellen per putje voor elke plaat bepaalt.</li>
	<li>Vergelijk het tarief van onthechting van de cel tussen SW-13, SW-Neo en SW-DDK3 cellen gedurende de bepaalde periode met behulp van een two-way ANOVA statistische toets.</li>
</ol>

<ol><li>Libe, R., Fratticci, A., Bertherat, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adrenocortical+cancer%3A+pathophysiology+and+clinical+management%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine-related+cancer%22%5BJournal%5D)">Adrenocortical cancer: pathophysiology and clinical management.</a> Endocrine-related cancer. 14 (1), 13-28 (2007).</li>
<li>Veeck, J., Dahl, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+Wnt+pathway+in+cancer%3A+the+emerging+role+of+Dickkopf-3%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Targeting the Wnt pathway in cancer: the emerging role of Dickkopf-3.</a> Biochimica et biophysica acta. 1825 (1), 18-28 (2012).</li>
<li>Friedl, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+cell+migration+in+morphogenesis%2C+regeneration+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (7), 445-457 (2009).</li>
<li>Jacquemet, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-type+calcium+channels+regulate+filopodia+stability+and+cancer+cell+invasion+downstream+of+integrin+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">L-type calcium channels regulate filopodia stability and cancer cell invasion downstream of integrin signalling.</a> Nat Commun. 7, 13297(2016).</li>
<li>Machesky, L. M., Li, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fascin%3A+Invasive+filopodia+promoting+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">Fascin: Invasive filopodia promoting metastasis.</a> Commun Integr Biol. 3 (3), 263-270 (2010).</li>
<li>Petrie, R. J., Harlin, H. M., Korsak, L. I., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activating+the+nuclear+piston+mechanism+of+3D+migration+in+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Activating the nuclear piston mechanism of 3D migration in tumor cells.</a> J Cell Biol. 216 (1), 93-100 (2017).</li>
<li>Korah, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+silencing+of+RASSF1A+deregulates+cytoskeleton+and+promotes+malignant+behavior+of+adrenocortical+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cancer%22%5BJournal%5D)">Epigenetic silencing of RASSF1A deregulates cytoskeleton and promotes malignant behavior of adrenocortical carcinoma.</a> Molecular cancer. 12, 87(2013).</li>
<li>Cheng, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+FOXO1-mediated+dedifferentiation+blocking+role+for+DKK3+in+adrenocortical+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+cancer%22%5BJournal%5D)">A novel FOXO1-mediated dedifferentiation blocking role for DKK3 in adrenocortical carcinogenesis.</a> BMC cancer. 17 (1), 164(2017).</li>
<li>Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+source+software+for+quantification+of+cell+migration%2C+protrusions%2C+and+fluorescence+intensities%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities.</a> J Cell Biol. 209 (1), 163-180 (2015).</li>
<li>Cliffe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+3D+analysis+of+complex+single+border+cell+behaviors+in+coordinated+collective+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Quantitative 3D analysis of complex single border cell behaviors in coordinated collective cell migration.</a> Nat Commun. 8, 14905(2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier beschrijven we een in vitro kwantitatieve methode karakteriseren cel extensies met gemak, paar pit-watervallen en betrouwbare reproduceerbaarheid die kan worden toegepast voor de verschillende testomstandigheden. Eenvoudige, kwantificeerbare hechting en/of beweeglijkheid testen kunnen bovendien gelijktijdig worden uitgevoerd om te correleren potentiële functionele betekenis van waargenomen veranderingen in celmembraan extensies.
Deze methoden kunnen echter enkele mogelijke beperk...

Dysregulated WNT signalering speelt een cruciale rol in adrenocortical maligniteiten1. De methoden die worden gebruikt in deze studie onderzoeken of zwijgen van DKK3, een negatieve regulator van de WNT signalering, vertegenwoordigt een dedifferentiation gebeurtenis in de bijnierschors en bevordert de vorming van de tumor in het kader van cel-extensie repertoire wijzigingen. DKK3 is een 38 kDa glycoproteïne met een N-terminal signaal peptide afgescheiden en vorige studies hebben aangetoond dat haar gedwongen meningsuiting in de arrestatie van de celcyclus resulteerde, geremd agressief gedrag van de kwaadaardige en omgekeerd epitheliale-mesenchymale overgang2.
Het maligne gedrag van adrenocortical carcinoom (ACC) en andere vormen van kanker is, gedeeltelijk beïnvloed door het vermogen van tumorcellen met de omringende oppervlakken, met inbegrip van de extracellulaire matrix, wat op zijn beurt tumor cel invasie vergemakkelijkt en migratie3. De rol van specifieke celmembraan extensies in de progressie van kanker wordt steeds worden aangetoond in verschillende contexten, vooral via de vorming van filopodia. Bijvoorbeeld, is overexpressie van L-type calcium kanalen gebleken dat induceren filopodia vorming te bevorderen van tumor cel invasie4. Ook Fascin, een bindende eiwit minimaal actine uitgedrukt in normale weefsel, is ook overexpressie in kankercellen i.s.m. filopodia formatie5. Lobopodia formatie laat niet-maligne fibroblasten effectief migreren door middel van de extra-cellulaire matrix, echter het heeft aangetoond dat fibrosarcoma cellen vertrouwen op metalloproteinase activiteit in plaats van lobopodia te vergemakkelijken van cel migratie en invasie6. We hebben aangetoond dat tumor suppressors, met inbegrip van de Ras vereniging domein familie 1 isovorm een (RASSF1A) en DKK3, kan functioneren te veranderen cytoskeletal elementen en bevordering van de vorming van de lamellipodia en invasieve eigenschappen7,8te belemmeren.
Als zodanig, is het cruciaal voor het karakteriseren van de effecten van genen betrokken bij carcinogenese en hun relatie tot de celmembraan extensie, wijzigingen specifiek beoordeling van filopodia, lobopodia en lamellipodia vorming onder testomstandigheden. Huidige state-of-the art technieken omvatten het gebruik van steeds geavanceerdere Microscopie methodes, fluorescerende labelen en/of complexe algoritmes voor data-acquisitie en interpretatie. Hoewel deze methoden nieuwe en krachtige analytische instrumenten bieden, beperkt hun complexiteit hun wijdverbreid gebruik en aanpassingsvermogen in cel biologie-experimenten. Bovendien, de precieze kwantificering en de observatie van veranderingen in cel extensie morfologie is niet typisch gemeten9,10. In tegenstelling, introduceren we een techniek hier die nauwkeurig kwantificeert cel extensie wijzigingen met behulp van standaard microscopische technieken en gemakkelijk aanpasbaar in vitro methoden. Deze methoden ook kwantificeren van elk celtype uitbreiding gelijktijdig voor elke cel geanalyseerd en algemene wijzigingen in het celmembraan extensie repertoire vaststellen. Ook laten we zien hoe deze veranderingen kunnen betrekking hebben op de eigenschappen van de hechting van de cel.
Als een experimentele voorbeeld gebruiken we een eerder gemaakte cellijn van SW-13, aangewezen SW-DDK3, die heeft zijn stabiel transfected met pCMV6-post/DKK3 plasmide vectoren en constitutively overexpresses DKK3, een onderscheidende factor in de bijnier. Non-transfected cellen van het SW-13 en SW-13 cellen stabiel transfected met lege vector (pCMV6-Entry), aangewezen SW-Neo, zal dienen als experimentele besturingselementen.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>ThermoFisher</td><td>11965-092</td><td>Aangevuld met foetaal runderserum en penicilline en streptomycine</td></tr><tr><td>Deulbeco's Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>1X oplossing, direct gebruikt</td></tr><tr><td>3,7% formaldehyde&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>Verdunde stamoplossing</td></tr><tr><td>0,05% kristalviolet&nbsp;</td><td>Harleco</td><td>192-12</td><td>Verdunde stamoplossing</td></tr><tr><td>De-geïoniseerd water</td><td>NA</td><td>NA</td><td>NA</td></tr><tr><td>Microscoop met 400X vergroting&nbsp;</td><td>NA</td><td>NA</td><td>NA</td></tr><tr><td>6-well platen</td><td>Corning</td><td>353046</td><td>NA</td></tr><tr><td>Celdissociatie-oplossing niet-enzymatische 1X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5914&nbsp;</td><td>1X oplossing, direct gebruikt</td></tr></tbody></table>

karakterisering van de celmembraan extensies en het bestuderen van hun rollen in kanker cel adhesie dynamics

Characterization of Cell Membrane Extensions and Studying Their Roles in Cancer Cell Adhesion Dynamics

De celmembraan extensie repertoire moduleert verschillende kwaadaardige gedrag van kankercellen, met inbegrip van hun potentieel zelfklevende en trekvogels. De mogelijkheid om nauwkeurig te classificeren en te kwantificeren cel extensies en te meten van het effect op van een cel zelfklevende capaciteit is van cruciaal belang om te bepalen hoe cel-signalering gebeurtenissen effect kanker cel gedrag en agressie. Hier beschrijven we de in vitro ontwerp en het gebruik van een cel kwantificering uitbreidingsmethode in combinatie met een hechting capaciteit test in een vastgestelde in vitro model voor adrenocortical carcinoom (ACC). Specifiek, testen we de effecten van DKK3, een vermeende tumor suppressor en een Pro-differentiatie factor, op het membraan extensie fenotype van de ACC cellijn, SW-13. Stellen wij voor deze tests om relatief eenvoudige, betrouwbare en makkelijk interpreteerbaar maatstelsel meet deze kenmerken onder verschillende experimentele omstandigheden.

Met behulp van de bovenstaande testen, werden de gevolgen van DKK3 overexpressie voor cel extensie morfologie en eigenschappen van cel adhesie getest in de gevestigde ACC cellijn SW-13, in vitro. Overexpressing van DKK3 cellen werden gegenereerd door stabiel transfecting SW-13 cellen met Myc-DDK tagged pCMV6-post/DKK3 plasmide vectoren en uitgeroepen tot SW-DKK3. Stabiel met lege vector pCMV6-Entry transfected cellen werden op dezelfde manier gemaakt als een transfectie en passag...

Deze studie toont het nut en het gemak van kwantitatieve celmembraan extensie meting en de correlatie met zelfklevende capaciteit van cellen. Als een representatief voorbeeld, laten we zien hier dat Dickkopf-gerelateerde eiwitten 3 (DKK3) bevordert de vorming van de verhoogde lobopodia en cel hechting in adrenocortical carcinoom cellen in vitro.

Karakterisering van de celmembraan extensies en het bestuderen van hun rollen in kanker cel adhesie Dynamics

The cell membrane&#39;s extension repertoire modulates various malignant behaviors of cancer cells, including their adhesive and migratory potentials. The ...

Het algemene doel is om het effect van experimentele veranderingen op het repertoire van celadhesie te bepalen en hoe dit verband houdt met de functie van celadhesie bij kanker. Deze methode kan helpen bij het identificeren van sleutelrollen van het repertoire van celadhesie bij het moduleren van celadhesie, mobiliteit en invasie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het relatief eenvoudig is om uit te voeren en gemakkelijk kan worden aangepast aan verschillende experimentele omstandigheden.De implicaties van deze techniek breiden zich uit tot onze therapie of diagnose van lokaal gevorderde of metastaserende kanker omdat het helpt om veranderingen in het repertoire van celadhesie die gepaard gaan met veranderingen in tumorcellen in kleef- en invasieve capaciteiten nauwkeurig te kwantificeren. Het kan ook worden toegepast op andere systemen zoals ionenkanaalregulatie waarvan bekend is dat het een belangrijke rol speelt in de vorming van celadhesie en normale fysiologische processen. Visuele demonstratie en opname van deze methode is cruciaal omdat het tellen van celadhesiestappen moeilijk te leren is vanwege de subtiliteiten van hun verschijning op tijden.Een dag voor

characterization-cell-membrane-extensions-studying-their-roles-cancer

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Een real-time elektrische Impedantie Gebaseerd Techniek om invasie van endotheelcellen monolaag meten door Cancer Cells

Een methode wordt beschreven voor de bereiding van een 3-dimensionale matrix van collageen type I en primaire humane fibroblasten. Deze organotypische gel dient als nuttige substraat invasieve celmigratie beoordelen omdat het bootst basiskenmerken van weefsel stroma en vatbaar is voor vele vormen van microscopie.

Organotypische Collageen I Assay: een Smeedbaar Platform to Cell Gedrag beoordelen in een 3-dimensionale Context

Modellen van de tumorcel invasie in drie-dimensionale extracellulaire matrix beter aansluiten bij...

Modeling and Imaging 3-Dimensionale Collectief Cell Invasion

This video describes the technique of studying the cytoskeleton and focal adhesions in primary human colon cancer cells to understand its variations depending on substrate rigidity. This culture of cancer cells on soft and hard substrates allows various downstream biophysical measurements for cancer prognosis.

Cytoskeleton and Focal Adhesion Organization Assay: An Immunofluorescence-based Method to Study Cell Adhesion and Spreading on Substrates

Dit artikel behandelt een methode om fluorescerend label collageen dat verder kan worden gebruikt voor zowel vaste en levende beeldvorming van 3D celculturen. Wij bieden ook een geoptimaliseerd protocol om endogene cytoskeleteiwitten van cellen gekweekt in 3D-omgevingen te visualiseren.

Het openbaren van de organisatie van het cytoskelet van invasieve kankercellen in 3D

De processen die blaas kanker invasie vertegenwoordigen mogelijkheden voor biomerker en therapeutische ontwikkeling. Hier presenteren we een blaas kanker invasie model waarin 3D-cultuur tumor spheroïden, time-lapse beeldvorming en confocale microscopie. Deze techniek is handig voor het definiëren van de kenmerken van de invasieve proces en voor het screenen van therapeutische agenten.

3D-celcultuur voor het bestuderen van de invasie en evalueren van Therapeutics in blaaskanker

Deze methode is nuttig voor het kwantificeren van de vroege dynamiek van cellulaire adhesie en het verspreiden van verankerings afhankelijke cellen op het fibronectin. Bovendien kan deze test worden gebruikt om de effecten van veranderde redox homeostase op celspreiding en/of celadhesie-gerelateerde intracellulaire signalering trajecten te onderzoeken.

Onderzoek van de dynamiek van cellulaire hechting en verspreiding van epitheliale cellen op fibronectine tijdens oxidatieve stress

Het artikel beschrijft kwantificering van 1) de grootte en het aantal focale verklevingen en 2) celvormindex en de verdeling ervan van confocale beelden van de confluent monolagen van MCF7-cellen.

Kwantificering van celsubstraatadhesiegebied en celvormverdelingen in MCF7-celmonolagen

In dit protocol presenteren we de experimentele procedures van een celverspreidende test die is gebaseerd op live-cell microscopie. We bieden een open-source computationele tool voor de onbevooroordeede segmentatie van fluorescerend gelabelde cellen en kwantitatieve analyse van lamellipodiadynamiek tijdens celverspreiding.

Kwantitatieve analyse van celranddynamiek tijdens celspreiding

Dit protocol presenteert de experimentele procedures om de adhesievoetafdruktest uit te voeren om de adhesiegebeurtenissen tijdens snelle celrollende adhesie in beeld te brengen.

Beeldvorming van moleculaire adhesie in celrollen door adhesievoetafdruktest

Dit protocol heeft tot doel de dynamische parameters (uitsteeksels, retracties, ruches) van uitsteeksels aan de rand van zich verspreidende cellen te meten.

Cell-Edge uitsteekseldynamiek meten tijdens het verspreiden met behulp van Live-Cell Microscopie

Leer hoe DKK3 lobopodia-vorming en celadhesie in adrenocorticale kankercellen bevordert. Deze methode kwantificeert celmembraanuitbreidingen om tumorcelgedrag te begrijpen.

Karakterisering van de celmembraan extensies en het bestuderen van hun rollen in kanker cel adhesie Dynamics

Meer video's verkennen