Karakterisering van de celmembraan extensies en het bestuderen van hun rollen in kanker cel adhesie Dynamics
26 maart 2018
Deze studie toont het nut en het gemak van kwantitatieve celmembraan extensie meting en de correlatie met zelfklevende capaciteit van cellen. Als een representatief voorbeeld, laten we zien hier dat Dickkopf-gerelateerde eiwitten 3 (DKK3) bevordert de vorming van de verhoogde lobopodia en cel hechting in adrenocortical carcinoom cellen in vitro.
Het algemene doel is om het effect van experimentele veranderingen op het repertoire van celadhesie te bepalen en hoe dit verband houdt met de functie van celadhesie bij kanker. Deze methode kan helpen bij het identificeren van sleutelrollen van het repertoire van celadhesie bij het moduleren van celadhesie, mobiliteit en invasie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het relatief eenvoudig is om uit te voeren en gemakkelijk kan worden aangepast aan verschillende experimentele omstandigheden.
De implicaties van deze techniek breiden zich uit tot onze therapie of diagnose van lokaal gevorderde of metastaserende kanker omdat het helpt om veranderingen in het repertoire van celadhesie die gepaard gaan met veranderingen in tumorcellen in kleef- en invasieve capaciteiten nauwkeurig te kwantificeren. Het kan ook worden toegepast op andere systemen zoals ionenkanaalregulatie waarvan bekend is dat het een belangrijke rol speelt in de vorming van celadhesie en normale fysiologische processen. Visuele demonstratie en opname van deze methode is cruciaal omdat het tellen van celadhesiestappen moeilijk te leren is vanwege de subtiliteiten van hun verschijning op tijden.
Een dag voor het beeldvorming, tel SW 13, SW Neo en SW DKK3 cellen gekweekt in een incubator van 37 graden Celsius en vijf procent koolstofdioxide met behulp van een hemocytometer. Plaats steriele glazen deksels in afzonderlijke putjes van drie zes-putjes platen. Gebruik een aparte plaat voor elke cellijn en plant de drie cellijnen met een dichtheid van 5.000 cellen per putje in deze zes-putjes platen.
Plaats de cellen in een incubator bij 37 graden Celsius en vijf procent koolstofdioxide overnacht. De volgende dag, uit elke put het groeimedium aspireren. Was vervolgens de cellen in een milliliter warm PBS.
Voeg vervolgens een milliliter 3,7 procent formaldehyde toe aan elke put om de cellen te fixeren. Laat de cellen 10 minuten in de fixeervloeistof. Nadat de fixatie is voltooid, aspireer de formaldehyde.
Voeg een milliliter 0,05 procent kristalviolet toe aan elke put om de cellen 30 minuten te kleuren. Vervolgens verwijdert u de overtollige kleurstof door de cellen met een milliliter gedeïoniseerd water per putje drie keer te wassen. Plaats vervolgens een druppel helder montagemiddel op een gelabelde glazen dia.
Vervolgens, met behulp van een fijne pincet, haal de deksels voorzichtig op en plaats ze met de zijde naar beneden op de montagemiddelen. Nadat alle gekleurde deksels op dia's zijn gemonteerd, kiest u onder een lichtmicroscoop 20 willekeurige weergaven van niet overlappende cellen van elke deksel. Maak fotomicrografieën van 400 versterking voor elk gezichtsveld.
Bekijk vervolgens en tel het aantal extensietypen in elk van de 20 representatieve cellen. Gebruik de definities en het tekstprotocol om uw classificatie van de membranextensie als filopodia, lobopodia of lamellipodia te begeleiden. Bij het eerst tellen van celextensietypen, kan het nuttig zijn om een referentieafbeelding beschikbaar te houden voor herziening.
Indien mogelijk, tellen op een blinde manier met betrekking tot hun experimentele monsters zal extra objectiviteit bieden. Bepaal het gemiddelde aantal extensies van elk type per cel in elk van de drie onderzochte cellijnen. Gebruik een weg-ANOVA om te testen of het verschil in het gemiddelde percentage celmembranextensies tussen de verschillende celtypen statistisch significant is.
Een dag voor de test, tel met behulp van een hemocytometer SW 13, SW Neo en SW DKK3 cellen. Bereid deze cellen voor met een dichtheid van 100.000 cellen per putje in zes-putjes platen met één plaat voor elk van de zes aangewezen tijdstippen die worden getest. Plaats de cellen in een incubator bij 37 graden Celsius en vijf procent koolstofdioxide overnacht.
De volgende dag, verwijder de plaat uit de incubator en was de cellen eenmaal met warm PBS. Voeg vervolgens 0,5 milliliter eenvoudige niet-enzymatische celdissociatieoplossing toe aan elke put. Zwaai voorzichtig met de platen om de toegevoegde oplossing gelijkmatig te verspreiden.
Incubeer de platen met de oplossing gedurende gedefinieerde tijdsduur. Aspireer de aangegeven plaat aan het einde van elk tijdstip. Spoel kort na elke aspiratie de cellen met een milliliter warm PBS.
Tik vervolgens voorzichtig op de plaat om losjes gehechtte cellen los te maken. Herhaal het wassen samen met het intermitterende tikken nog twee keer. Aspireer ten slotte alle resterende PBS en fixeer de cellen die in de plaat zijn achtergebleven met een milliliter 3,7 procent formaldehyde.
Nadat de fixatie is voltooid, aspireer de formaldehyde. Voeg vervolgens een milliliter 0,05 procent kristalviolet toe aan elke put om de cellen te kleuren. Zodra het kleuren voltooid is, verwijdert u de overtollige kleurstof door de cellen met een milliliter gedeïoniseerd water per putje drie keer te wassen.
Tel met behulp van een lichtmicroscoop bij 100 versterking de resterende gehechtte cellen in elke put voor elke plaat. Bepaal vervolgens het percentage cellen dat tijdens de verschillende tijdstippen losgekoppeld is gebleven voor de drie geteste cellijnen. Gebruik een tweeweg-ANOVA om te testen of de verschillen en de snelheden van celdetachment tussen de drie cellijnen statistisch significant zijn.
Kristalviolet gekleurde controle SW 13 en SW Neo cellen vormden meestal filopodia en lamellipodia. In tegenstelling hiermee, vormden DKK3-expresserende cellen meer lobopodia met bijna volledige afwezigheid van lamellipodia en zeer weinig filopodia. Let ook op de verschillen in polariteit tussen de DKK3-expresserende cellen en de controlecellijnen.
De grafiek toont de verhouding van verschillende celextensies in de drie geteste cellijnen. Let op, het significant hogere percentage lobopodia in DKK3-expresserende cellen. Lijngrafieken tonen het percentage cellen dat na behandeling met de dissociatieoplossing nog aan de plaat hechtte voor de op de X-as aangegeven tijdstippen.
Bij alle tijdstippen tot 10 minuten toonden DKK3-expresserende cellen een significant hogere celadhesiekracht in
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie onderzoekt de relatie tussen celmembraanextensies en celadhesie in kankercellen. In het bijzonder wordt belicht hoe Dickkopf-related protein 3 (DKK3) de vorming van lobopodia en de celadhesiviteit in adrenocorticale carcinoomcellen in vitro versterkt.
Belangrijkste Componenten van de Studie
Wetenschappelijk gebied
- Celbiologie
- Kankeronderzoek
- Celadhesiemechanismen
Achtergrond
- Celmembraanuitstulpingen spelen een cruciale rol in het celgedrag.
- Het begrijpen van deze uitstulpingen kan inzicht bieden in de mobiliteit en invasie van kankercellen.
- Kwantitatieve meettechnieken zijn essentieel voor het bestuderen van celgedrag.
- Het is bekend dat DKK3 de celadhesie-eigenschappen beïnvloedt.
Doel van de studie
- Om de impact van celmembraanextensies op de adhesie in kankercellen te beoordelen.
- Om de rol van DKK3 bij het bevorderen van de vorming van lobopodia te evalueren.
- Om een methode te ontwikkelen voor het kwantificeren van celextensie en adhesie.
Gebruikte methoden
- Kwantitatieve meting van celmembraanextensies.
- In vitro experimenten met adrenocorticale carcinoomcellen.
- Analyse van de correlatie tussen lobopodia-vorming en celadhesie.
- Visuele demonstraties ter ondersteuning van het begrip van de meettechniek.
Belangrijkste resultaten
- DKK3 verhoogt de vorming van lobopodia in kankercellen significant.
- Er werd een verbeterde celadhesie waargenomen in combinatie met toegenomen membraanextensies.
- De ontwikkelde methode is eenvoudig en aanpasbaar aan diverse experimentele condities.
- Kwantitatieve analyse helpt bij het begrijpen van het gedrag van tumorcellen.
Conclusies
- Celmembraanextensies zijn essentieel voor het begrijpen van het gedrag van kankercellen.
- DKK3 speelt een significante rol bij het bevorderen van celadhesie via lobopodia.
- Deze techniek kan worden toegepast op andere onderzoeksgebieden, waaronder de regulatie van ionkanalen.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Deze methode stelt biofarmaceutische onderzoekers in staat om fenotypes van membraanextensie in kankercellen kwantitatief te koppelen aan functionele adhesieresultaten, waardoor een mechanische uitlezing wordt verkregen voor doelwitvalidatie bij de ontdekking van oncologische geneesmiddelen. Door de vorming van lobopodia te correleren met een verhoogde celhechtingsterkte, biedt de assay voorspellend vertrouwen bij het evalueren van modulatoren van celgedrag, zoals DKK3 of gerelateerde signaalpaden. De aanpak biedt een schaalbaar, reproduceerbaar platform voor het verminderen van risico's bij vroege hypothesen over metastase- en invasiemechanismen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door te kwantificeren hoe specifieke moleculaire veranderingen de repertoires van membraanextensies beïnvloeden die gekoppeld zijn aan adhesie en motiliteit van kankercellen.
- Operationele waarde: Biedt een geblindeerd, objectief classificatiesysteem voor filopodia, lobopodia en lamellipodia om waarnemersbias bij fenotypische screening te verminderen.
- Predictieve waarde: Maakt mechanistische risicoreductie mogelijk door extensiefenotypen te koppelen aan functionele adhesie-assays, wat go/no-go-beslissingen bij de prioritering van targets ondersteunt.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Klaarheid voor assay: Genereert gestandaardiseerde, kwantitatieve output (aantallen extensietypen en adhesiepercentages) die geschikt zijn voor high-content screening-workflows.
- Reproduceerbaarheid: Maakt gebruik van gedefinieerde fixatie-, kleurings- en beeldgevingsprotocollen om consistente resultaten over experimentele condities en tijdspunten te waarborgen.
- Platformnut: Aanpasbaar aan diverse kankermodellen en perturbagenen, waardoor hergebruik mogelijk is in ontdekkingsprojecten die gericht zijn op celadhesie- of motiliteitspaden.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor de ziekte: Modelleert direct de adhesieve en invasieve capaciteiten in een gevestigd in vitro systeem voor adrenocorticaal carcinoom, een klinisch relevant kankertype.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen moleculaire perturbaties (bijv. DKK3-expressie) en fenotypische veranderingen in membraanextensies en functionele adhesie, wat de validatie van targets die zijn afgestemd op biomarkers ondersteunt.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Ondersteunt preklinische besluitvorming door statistisch significante, kwantitatieve metrieken te leveren (via één-weg en twee-weg ANOVA) over de proporties van extensies en detachementsnelheden.
Integratie van Pipeline en Workflow
De methode past binnen het vroege ontdekkingscontinuüm, ondersteunt targetvalidatie via fenotypische screening en maakt translationele vervolgstappen in preklinische modellen mogelijk door moleculaire effectoren te koppelen aan adhesie-gerelateerd gedrag.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt het testen van hypothesen door te kwantificeren hoe experimentele wijzigingen (bijv. DKK3-overexpressie) fenotypen van membraanextensies verschuiven en correleren met functionele veranderingen in adhesie.
- Screening: Levert assay-klare, kwantitatieve resultaten over extensietypes en celhechtingssterkte die een betrouwbare evaluatie van verbindingen of genetische perturbaties mogelijk maken.
- Analytica: Maakt gebruik van statistische toetsing (eenweg-ANOVA voor extensieproporties, tweeweg-ANOVA voor detachementssnelheden) om significante verschillen tussen condities te bepalen, wat bijdraagt aan de vergelijkende analyse.
- Translationeel onderzoek: Verbindt moleculaire mechanismen met fenotypische uitkomsten in een ziekte-relevant systeem, wat de continuïteit ondersteunt van ontdekking naar preklinische validatie.
- Herbruikbaarheid binnen de organisatie: Ontworpen als een eenvoudige, aanpasbare techniek die toepasbaar is op meerdere cellijnen en experimentele opstellingen, waardoor standaardisatie en nut over verschillende projecten heen worden bevorderd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in doelwitvalidatie door membraanextensie-fenotypes mechanistisch te koppelen aan de adhesiefunctie van kankercellen.
- Operationele waarde: Waarborgt standaardisatie en reproduceerbaarheid via geblindeerd tellen, gedefinieerde kleuringsprotocollen en statistische validatie.
- Strategische waarde: Verbetert de kwaliteit van go/no-go-beslissingen door biologische ambiguïteit bij doelwitbeoordeling in een vroeg stadium te verminderen, wat de kapitaalefficiëntie verhoogt.
- Impact op portfolio: Maakt risicogecorrigeerde prioritering van doelwitten mogelijk op basis van kwantitatieve, reproduceerbare gegevens die moleculaire effectoren koppelen aan adhesie-gerelateerd maligne gedrag.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in celkweek, microscopie en morfologische classificatie van membraanextensies.
- Afhankelijk van lichtmicroscopie en beeldvastleggingsapparatuur voor visualisatie bij 400x vergroting en adhesiebeoordeling bij 100x.
- Noodzaakt standaardisatie tussen teams voor blind tellen en consistente toepassing van definities voor extensies (filopodia, lobopodia, lamellipodia).
- Overwegingen voor aanpassing omvatten variërende cellijnen, incubatietijden en concentraties van de dissociie-oplossing, terwijl de integriteit van het protocol behouden blijft.
- Praktische beperkingen omvatten subjectiviteit bij de classificatie van extensies zonder adequate training en referentiebeelden, zoals vermeld in het bronmateriaal.
