Visuele detectie van meerdere Nucleic Acids in een capillaire matrix
15 november 2017
Dit protocol beschrijft de fabricage van een kleine, kant-en-klare cassette die kan worden toegepast voor visuele detectie van meerdere nucleic zuren in een enkele, test die is eenvoudig te bedienen. In deze benadering werd een capillaire matrix gebruikt voor multiplex en zeer efficiënte opsporing van GGO-doelstellingen.
Het algemene doel van deze procedure is om een kleine, gebruiksklare cassette te fabriceren die kan worden toegepast voor visuele detectie van meerdere nucleïnezuren in een enkele, gemakkelijk te bedienen test. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van multiplex nucleïnezuurdetectie, zoals genetisch gemodificeerde organismen, of GMO-detectie. Om de capillairen schoon te maken, draag een laboratoriumuniform, veiligheidsbril en chemische beschermende handschoenen.
Plaats de capillairen in een beker. Reinig de capillairen gedurende vijf minuten met 30 milliliter aceton om organische materie te verwijderen. En was vervolgens de capillairen met gedeïoniseerd water.
Bereid vervolgens de piranha-oplossing voor door ongeveer tien milliliter waterstofperoxide in de beker te gieten. Voeg vervolgens 30 milliliter zwavelzuur toe aan het waterstofperoxide met langzaam schudden om oververhitting te voorkomen. Zorg ervoor dat de oplossing de capillairen minimaal 30 minuten volledig bedekt.
Was vervolgens de piranha-oplossing af met een grote hoeveelheid water. Was de capillairen vijf minuten lang met ethanol en gedeïoniseerd water. Droog de capillairen in een droogoven.
Weeg vervolgens PDMS-basis en aandrijfmiddelen met een verhouding van een-op-een in een buis van 50 milliliter. Typisch mengt u vijf gram elastomeerbasis met vijf gram elastomeerharder. Roer het mengsel gedurende ongeveer vijf minuten grondig met een glazen staaf.
Plaats de beker met de PDMS in een vacuümklok voor dertig minuten om te ontgassen. Giet vervolgens de PDMS langzaam in de cilinder van de roestvrijstalen mal. Laat de PDMS drie uur uitharden in een droogoven op 60 graden Celsius.
Na het uitharden van de PDMS verwijdert u de mal door de mal met cilinder eruit te trekken. Verwijder de PDMS uit de cilinder door de rand van de mal met een scalpel te snijden. Was de PDMS drie keer met ethanol en gedeïoniseerd water.
Droog vervolgens de PDMS-drager met stikstof. Behandel het onderste oppervlak van de PDMS-drager om hydrofoob te worden door de PDMS-drager één seconde in een superhydrofoob laagje te weken. Droog het vervolgens tien minuten op kamertemperatuur.
Plaats vervolgens de gereinigde vier millimeter capillairen in de gaten van de PDMS-drager, waarbij er nul punt vijf millimeter van de capillairen buiten het bovenoppervlak van de PDMS-drager blijft. Zorg ervoor dat de uiteinden van de capillairen op hetzelfde niveau staan. Om het buitenoppervlak van de capillairen en het bovenoppervlak van de PDMS-drager hydrofoob te maken, voegt u 15 microliters van de superhydrofoob laag toe bovenop het oppervlak van de PDMS-drager.
Laat de superhydrofoob gemodificeerde capillaire array aan de lucht drogen. Voeg vervolgens één punt zes microliters van de primer-fixeringsmix van één set primers toe om één overeenkomstige capillair van de capillaire array te vullen volgens een vooraf ontworpen volgorde. Anker de array in een transparante put van een standaard platte bodem 96-well plaat en droog de array gedurende minimaal twee uur op 60 graden Celsius.
Om de cassette samen te stellen, plaats u een laadadapter op de bovenkant van de verankerde array. Zorg ervoor dat de schotel van de adapter de blootgestelde delen van alle tien capillairen net bedekt. Om het LAMP-reactiemengsel voor te bereiden, voegt u reagensen toe aan het mengsel volgens het tekstprotocol en klopt u het reactiemengsel vijf seconden na het toevoegen van calcine.
Keer de buis zachtjes twintig keer om nadat de Bst-polymerase is toegevoegd. DNA dat in het milieu aanwezig is, kan worden geëlimineerd door eerder te reinigen met één mol per liter zoutzuur voordat u de LAMP-mix aanraakt. Zuig 20 microliters van het LAMP-reactiemengsel op met een standaard 100 microliter tip.
Steek de tip in de inlaat van de laadadapter om deze te vergrendelen. Injecteer voorzichtig het reactiemengsel in de schotel van de adapter. Het reactiemengsel zal snel de schotel vullen en vervolgens automatisch de capillairen laden door capillaire kracht.
Verwijder de adapter met de vergrendelde tip en verzegel de put met een PCR-compatibele transparante verzegelingsfolie. Bewaar vervolgens de capillaire array gedurende één uur in een incubator op 63 graden Celsius. Gebruik een UV-zaklamp om de dissociatieve calcine te exciteren om fluoresceren te laten uitstralen om beelden van de fluorescering te verkrijgen.
Neem beelden vanaf de bovenkant van de capillaire array op met een digitale camera of een smartphone. Zorg er bij het nemen van een foto voor dat de camera zo veel mogelijk op de capillairen is ingezoomd om hoge kwaliteit, duidelijke beelden te krijgen. Open vervolgens het beeld door middel van beeldanalysesoftware.
Selecteer vervolgens afbeelding, mal, grijswaarden, ja en afbeelding, mal, 16-bits, ja. Selecteer bestand, opslaan als, formaat, TIFF, om het beeld om te zetten naar 16-bits TIFF-formaat. Om de waarde van de fluorescentie-intensiteit te extraheren, opent u de microarray-analysesoftware.
Sleep het 16-bits TIFF-formaatbeeld naar de interface van de software en selecteer vervolgens de golflengte van 532 nanometer en een groene kleur om het beeld weer te geven. Maak vervolgens een nieuw blok om het fluorescentiesignaal van de capillairen te lokaliseren. Selecteer gereedschappen, nieuwe blokken, en plaats vervolgens het aantal kolommen en rijen als één-op-één en twee-op-vijf in de blokken en functies interfaces afzonderlijk.
Klik met de rechtermuisknop en selecteer het functiemodel. Pas vervolgens de locatie en diameter aan om de fluorescentiegebied van de capillairen te passen. Selecteer analyseren om de waarde van de fluorescentie-intensiteit te extraheren.
Selecteer ten slotte bestand, instellingen opslaan als, om de documenten van het blok op te slaan. Selecteer vervolgens bestand, resultaten opslaan als om de resultaten van de fluorescentie-intensiteit op te slaan. Hier wordt de lay-out van de capillaire array getoond.
Capillairen één tot en met acht, voorafgegaan door LAMP-primer sets. Capillairen negen en tien vertegenwoordigen twee, geen primer control
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft de fabricage van een kleine, gebruiksklare cassette voor de visuele detectie van meerdere nucleïnezuren in één enkele, eenvoudig te bedienen test. Deze methode is bijzonder nuttig voor het detecteren van genetisch gemodificeerde organismen (GGO's) met behulp van een capillaire array voor multiplexdetectie.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Biotechnologie
- Moleculaire biologie
- Genetische manipulatie
Achtergrond
- De detectie van meerdere nucleïnezuren is cruciaal in diverse vakgebieden.
- Genetisch gemodificeerde organismen (GGO's) vormen een aanzienlijke uitdaging voor de voedselveiligheid.
- Efficiënte detectiemethoden zijn noodzakelijk voor snelle analyse.
- Capillaire arrays kunnen de mogelijkheden voor multiplex-detectie verbeteren.
Doel van de studie
- Om een gebruiksvriendelijke cassette te ontwikkelen voor de detectie van nucleïnezuren.
- Om de efficiëntie van ggo-detectie te verbeteren.
- Om onderzoek naar multiplex detectie van nucleïnezuren te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Fabricage van een kleine cassette voor de detectie van nucleïnezuren.
- Gebruik van capillaire arrays voor multiplex-detectie.
- Reinigen van capillairen met aceton en gedeïoniseerd water.
- Visuele detectiemethoden voor gebruiksgemak.
Belangrijkste resultaten
- De cassette maakt de gelijktijdige detectie van meerdere nucleïnezuren mogelijk.
- Capillaire arrays verbeteren de efficiëntie van het detectieproces.
- De methode is eenvoudig en gebruiksvriendelijk.
- Potentiële toepassingen in GMO-detectie en andere vakgebieden.
Conclusies
- Dit protocol biedt een nieuwe benadering voor de detectie van nucleïnezuren.
- De ontwikkelde cassette is effectief voor multiplex-testen.
- Toekomstig onderzoek kan de toepassingen ervan in de biotechnologie uitbreiden.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Dit platform maakt multiplex detectie van nucleïnezuren in één enkele cassette mogelijk, wat voldoet aan de behoeften voor high-throughput screening bij GMO-testen en microbiële monitoring. Door capillaire array-technologie te combineren met LAMP-amplificatie, wordt de complexiteit van de assay en de benodigde middelen verminderd, terwijl de specificiteit en sensitiviteit behouden blijven. De visuele uitlezing via UV-verlichting maakt snelle resultaten zonder instrumentarium mogelijk, wat aansluit bij de eisen voor gedecentraliseerd testen in biopharma- en agrarische biotechnologie-workflows.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt gelijktijdige analyse van meerdere genetische targets mogelijk voor hypothesetoetsing in padanalyse.
- Operationele waarde: Vermindert het reagensverbruik en de handmatige verwerkingstijd door monsterlading op basis van capillaire krachten.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Biedt gestandaardiseerde, geïsoleerde reactiekamers voor reproduceerbare amplificatie van verschillende targets.
- Operationele waarde: Ondersteunt parallelle verwerking van maximaal acht assays met interne controles voor assay-validatie.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert de detectie van genetisch gemodificeerde elementen in complexe matrices, ter ondersteuning van de veiligheidsbeoordeling van ggo's.
- Operationele waarde: Maakt testen in het veld mogelijk met minimale apparatuur, geschikt voor procesbewaking in de biomanufacturing.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen workflows van vroege ontdekking tot preklinisch onderzoek, waarbij snelle profilering van nucleïnezuren bijdraagt aan de selectie van targets en de gereedheid van assays.
- Discovery Biology: Maakt parallel testen van genvarianten of constructen mogelijk om functionele rollen in biologische paden te verduidelijken.
- Screening: Genereert kwantitatieve fluorescentie-intensiteitsgegevens voor hit-bevestiging en cross-capillaire vergelijking.
- Analytics: De output maakt het mogelijk om signaaldrempels in te stellen en contaminatie te beoordelen via blanco capillaire controles.
- Translationeel Onderzoek: Ondersteunt continuïteit van targetidentificatie tot preklinische validatie via consistente nucleïnezuur-readouts.
- Enterprise Hergebruik: Het cassette-ontwerp maakt hergebruik mogelijk over meerdere nucleïnezuurpanels door reconfiguratie van primer-sets.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen in multiplex-assays door crosstalk en fout-positieven te minimaliseren.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde capillaire preparatie en geïsoleerde reactievolumes.
- Strategische waarde: Verkort de doorlooptijd tot het resultaat voor kritieke beslissingspunten bij de detectie van ggo's en microbiële monitoring.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets mogelijk op basis van simultane multi-parameter read-outs.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist expertise in oppervlaktebehandeling en de assemblage van capillaire arrays voor hydrofobe/hydrofiele patroons.
- Is afhankelijk van toegang tot vacuümontgassings- en thermische uithardingsapparatuur voor de fabricage van PDMS-microfluidica.
- Vereist standaardisatie van primerfixatieprotocollen over de capillaire arrays voor reproduceerbare resultaten.
- Omvat aanpassingen bij uitbreiding naar meer dan acht targets vanwege beperkingen van de capillaire array.
- is afhankelijk van gebruikers training voor consistente UV-excitatie en beeldvastlegging om de nauwkeurigheid van de fluorescentiekwantificering te waarborgen.
