Visuele detectie van meerdere Nucleic Acids in een capillaire matrix
November 15th, 2017
Dit protocol beschrijft de fabricage van een kleine, kant-en-klare cassette die kan worden toegepast voor visuele detectie van meerdere nucleic zuren in een enkele, test die is eenvoudig te bedienen. In deze benadering werd een capillaire matrix gebruikt voor multiplex en zeer efficiënte opsporing van GGO-doelstellingen.
Het algemene doel van deze procedure is om een kleine, gebruiksklare cassette te fabriceren die kan worden toegepast voor visuele detectie van meerdere nucleïnezuren in een enkele, gemakkelijk te bedienen test. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van multiplex nucleïnezuurdetectie, zoals genetisch gemodificeerde organismen, of GMO-detectie. Om de capillairen schoon te maken, draag een laboratoriumuniform, veiligheidsbril en chemische beschermende handschoenen.
Plaats de capillairen in een beker. Reinig de capillairen gedurende vijf minuten met 30 milliliter aceton om organische materie te verwijderen. En was vervolgens de capillairen met gedeïoniseerd water.
Bereid vervolgens de piranha-oplossing voor door ongeveer tien milliliter waterstofperoxide in de beker te gieten. Voeg vervolgens 30 milliliter zwavelzuur toe aan het waterstofperoxide met langzaam schudden om oververhitting te voorkomen. Zorg ervoor dat de oplossing de capillairen minimaal 30 minuten volledig bedekt.
Was vervolgens de piranha-oplossing af met een grote hoeveelheid water. Was de capillairen vijf minuten lang met ethanol en gedeïoniseerd water. Droog de capillairen in een droogoven.
Weeg vervolgens PDMS-basis en aandrijfmiddelen met een verhouding van een-op-een in een buis van 50 milliliter. Typisch mengt u vijf gram elastomeerbasis met vijf gram elastomeerharder. Roer het mengsel gedurende ongeveer vijf minuten grondig met een glazen staaf.
Plaats de beker met de PDMS in een vacuümklok voor dertig minuten om te ontgassen. Giet vervolgens de PDMS langzaam in de cilinder van de roestvrijstalen mal. Laat de PDMS drie uur uitharden in een droogoven op 60 graden Celsius.
Na het uitharden van de PDMS verwijdert u de mal door de mal met cilinder eruit te trekken. Verwijder de PDMS uit de cilinder door de rand van de mal met een scalpel te snijden. Was de PDMS drie keer met ethanol en gedeïoniseerd water.
Droog vervolgens de PDMS-drager met stikstof. Behandel het onderste oppervlak van de PDMS-drager om hydrofoob te worden door de PDMS-drager één seconde in een superhydrofoob laagje te weken. Droog het vervolgens tien minuten op kamertemperatuur.
Plaats vervolgens de gereinigde vier millimeter capillairen in de gaten van de PDMS-drager, waarbij er nul punt vijf millimeter van de capillairen buiten het bovenoppervlak van de PDMS-drager blijft. Zorg ervoor dat de uiteinden van de capillairen op hetzelfde niveau staan. Om het buitenoppervlak van de capillairen en het bovenoppervlak van de PDMS-drager hydrofoob te maken, voegt u 15 microliters van de superhydrofoob laag toe bovenop het oppervlak van de PDMS-drager.
Laat de superhydrofoob gemodificeerde capillaire array aan de lucht drogen. Voeg vervolgens één punt zes microliters van de primer-fixeringsmix van één set primers toe om één overeenkomstige capillair van de capillaire array te vullen volgens een vooraf ontworpen volgorde. Anker de array in een transparante put van een standaard platte bodem 96-well plaat en droog de array gedurende minimaal twee uur op 60 graden Celsius.
Om de cassette samen te stellen, plaats u een laadadapter op de bovenkant van de verankerde array. Zorg ervoor dat de schotel van de adapter de blootgestelde delen van alle tien capillairen net bedekt. Om het LAMP-reactiemengsel voor te bereiden, voegt u reagensen toe aan het mengsel volgens het tekstprotocol en klopt u het reactiemengsel vijf seconden na het toevoegen van calcine.
Keer de buis zachtjes twintig keer om nadat de Bst-polymerase is toegevoegd. DNA dat in het milieu aanwezig is, kan worden geëlimineerd door eerder te reinigen met één mol per liter zoutzuur voordat u de LAMP-mix aanraakt. Zuig 20 microliters van het LAMP-reactiemengsel op met een standaard 100 microliter tip.
Steek de tip in de inlaat van de laadadapter om deze te vergrendelen. Injecteer voorzichtig het reactiemengsel in de schotel van de adapter. Het reactiemengsel zal snel de schotel vullen en vervolgens automatisch de capillairen laden door capillaire kracht.
Verwijder de adapter met de vergrendelde tip en verzegel de put met een PCR-compatibele transparante verzegelingsfolie. Bewaar vervolgens de capillaire array gedurende één uur in een incubator op 63 graden Celsius. Gebruik een UV-zaklamp om de dissociatieve calcine te exciteren om fluoresceren te laten uitstralen om beelden van de fluorescering te verkrijgen.
Neem beelden vanaf de bovenkant van de capillaire array op met een digitale camera of een smartphone. Zorg er bij het nemen van een foto voor dat de camera zo veel mogelijk op de capillairen is ingezoomd om hoge kwaliteit, duidelijke beelden te krijgen. Open vervolgens het beeld door middel van beeldanalysesoftware.
Selecteer vervolgens afbeelding, mal, grijswaarden, ja en afbeelding, mal, 16-bits, ja. Selecteer bestand, opslaan als, formaat, TIFF, om het beeld om te zetten naar 16-bits TIFF-formaat. Om de waarde van de fluorescentie-intensiteit te extraheren, opent u de microarray-analysesoftware.
Sleep het 16-bits TIFF-formaatbeeld naar de interface van de software en selecteer vervolgens de golflengte van 532 nanometer en een groene kleur om het beeld weer te geven. Maak vervolgens een nieuw blok om het fluorescentiesignaal van de capillairen te lokaliseren. Selecteer gereedschappen, nieuwe blokken, en plaats vervolgens het aantal kolommen en rijen als één-op-één en twee-op-vijf in de blokken en functies interfaces afzonderlijk.
Klik met de rechtermuisknop en selecteer het functiemodel. Pas vervolgens de locatie en diameter aan om de fluorescentiegebied van de capillairen te passen. Selecteer analyseren om de waarde van de fluorescentie-intensiteit te extraheren.
Selecteer ten slotte bestand, instellingen opslaan als, om de documenten van het blok op te slaan. Selecteer vervolgens bestand, resultaten opslaan als om de resultaten van de fluorescentie-intensiteit op te slaan. Hier wordt de lay-out van de capillaire array getoond.
Capillairen één tot en met acht, voorafgegaan door LAMP-primer sets. Capillairen negen en tien vertegenwoordigen twee, geen primer control
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol beschrijft de fabricage van een kleine, kant-en-klare cassette voor de visuele detectie van meerdere nucleotiden in een enkele, gemakkelijk te bedienen test. Deze methode is bijzonder nuttig voor het detecteren van genetisch gemodificeerde organismen (GGO's) met behulp van een capillairarray voor multiplexdetectie.
Belangrijke studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Biotechnologie
- Molecuulbiologie
- Genetische manipulatie
Achtergrond
- Detectie van meerdere nucleotiden is cruciaal in verschillende vakgebieden.
- Genetisch gemodificeerde organismen (GGO's) stellen aanzienlijke uitdagingen in de voedselveiligheid.
- Efficiënte detectiemethoden zijn nodig voor snelle analyse.
- Capillairarrays kunnen de mogelijkheden voor multiplexdetectie verbeteren.
Doel van studie
- Om een gebruiksvriendelijke cassette voor nucleotidendetectie te ontwikkelen.
- Om de efficiëntie van GGO-detectie te verbeteren.
- Om onderzoek naar multiplex nucleotidendetectie te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Fabricage van een kleine cassette voor nucleotidendetectie.
- Gebruik van capillairarrays voor multiplexdetectie.
- Reiniging van capillairen met aceton en gedeïoniseerd water.
- Visuele detectiemethoden voor gebruiksgemak.
Belangrijkste resultaten
- De cassette maakt de detectie van meerdere nucleotiden tegelijkertijd mogelijk.
- Capillairarrays verhogen de efficiëntie van het detectieproces.
- De methode is eenvoudig en gebruiksvriendelijk.
- Mogelijke toepassingen in GGO-detectie en andere vakgebieden.
Conclusies
- Dit protocol biedt een nieuwe aanpak voor nucleotidendetectie.
- De ontwikkelde cassette is effectief voor multiplextesten.
- Toekomstig onderzoek kan de toepassingen in de biotechnologie uitbreiden.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This platform enables multiplex nucleic acid detection in a single cassette, supporting high-throughput screening needs in GMO testing and microbial monitoring. By combining capillary array technology with LAMP amplification, it reduces assay complexity and resource requirements while maintaining specificity and sensitivity. The visual readout via UV illumination allows rapid, instrument-free results, aligning with decentralized testing demands in biopharma and agricultural biotechnology workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables simultaneous interrogation of multiple genetic targets for hypothesis testing in pathway analysis.
- Operational Value: Reduces reagent consumption and hands-on time through capillary-force-driven sample loading.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides standardized, isolated reaction chambers for reproducible amplification across targets.
- Operational Value: Supports parallel processing of up to eight assays with internal controls for assay validation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates detection of genetically modified elements in complex matrices, supporting GMO safety assessment.
- Operational Value: Enables field-deployable testing with minimal equipment, suitable for process monitoring in biomanufacturing.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to preclinical workflows where rapid nucleic acid profiling informs target selection and assay readiness.
- Discovery Biology: Allows parallel testing of gene variants or constructs to clarify functional roles in biological pathways.
- Screening: Generates quantitative fluorescence intensity data for hit confirmation and cross-capillary comparison.
- Analytics: Outputs enable signal threshold setting and contamination assessment via blank capillary controls.
- Translational Research: Supports continuity from target identification to preclinical validation through consistent nucleic acid readouts.
- Enterprise Reuse: Cassette design allows reuse across multiple nucleic acid panels with reconfiguration of primer sets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in multiplex assays by minimizing cross-talk and false positives.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized capillary preparation and isolated reaction volumes.
- Strategic Value: Reduces time-to-result for critical decision points in GMO detection and microbial monitoring.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on simultaneous multi-parameter readouts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in surface treatment and capillary array assembly for hydrophobic/hydrophilic patterning.
- Depends on access to vacuum degassing and thermal curing equipment for PDMS microfluidic fabrication.
- Necessitates standardization of primer fixation protocols across capillary arrays for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when extending beyond eight targets due to capillary array limitations.
- Relies on user training for consistent UV excitation and image capture to ensure fluorescence quantification accuracy.
