Methodologie voor Sputum inductie en laboratorium Processing

De techniek van geïnduceerd sputum is ontwikkeld in de vroege jaren 90. De techniek werd voorgesteld om nieuwe informatie te onderzoeken bij obstructieve luchtwegaandoeningen zoals astma, COPD, en recentelijk is er ook interesse geweest om nieuwe informatie te onderzoeken bij pulmonale fibrose. Het grote voordeel van deze techniek is dat het relatief niet-invasief is in tegenstelling tot bronchoscopie.

De verwerking vereist laboratoriumwerk en het duurt tijd, dus het is behoorlijk veeleisend, tijdrovend en er moet enige expertise zijn in het laboratorium, dus het is duidelijk een techniek die moeilijk te verkrijgen is in alle centra. De techniek van geïnduceerd sputum bestaat uit twee delen, het eerste deel is de inductie en het tweede deel is de verwerking. Voor het induceren van sputum moeten we een spirometrie uitvoeren, wat een beoordeling is van het volume en de stroomsnelheid die de patiënt kan produceren.

En dat moeten we doen omdat de sputuminductie op zichzelf bronquispasme kan veroorzaken, dus we moeten absoluut de basiswaarde van de spirometrie van de patiënten kennen. Dus we voeren eerst een spirometrie uit, dan geven we de patiënten bronchusverwijders, we geven meestal 400 microgram salbutamol, om de luchtwegen van de patiënten maximaal te openen en ook om een bronquispasme te voorkomen dat kan optreden tijdens de inductiefase. En na 15 minuten meten we de spirometrie opnieuw, om de zogenaamde basiswaarde van spirometrie te hebben, en in het bijzonder kijken we naar de FEV1, dat is het volume dat de patiënt binnen een seconde kan uitademen.

Giet gedistilleerd water in de kamer van de vernevelaar tot het aanbevolen niveau. Plaats een schone kom in de kamer van de vernevelaar. Bedek de gevulde dop met de juiste deksel.

Vul de kom met 50 ml hypertone zoutoplossing 5% als de post-bronchodilator FEV1 groter is dan 65% voorspeld, of 50 ml isotone zoutoplossing 9% als de post-bronchodilator FEV1 minder is dan 65% voorspeld. Voeg 1,75 salbutamolsulfaatoplossing toe met een concentratie van vijf milligram per ml aan de kom. Verbind de buizen en kleppen in overeenstemming met de instructies van de fabrikant.

De techniek moet worden uitgevoerd onder medische supervisie. Leg de patiënt het principe van de test uit. Vraag de patiënt om een neusklempje te gebruiken.

Start de vernevelaar en selecteer het laagste niveau van aerosol en ventilatorinstelling. Vraag de patiënt om de aerosol in te ademen via de mondstuk met normale ademhaling. Het niveau van aerosol en ventilatorinstelling kan worden verhoogd, afhankelijk van de tolerantie van de patiënt.

In geval van pijn op de borst of ademhalingsproblemen, stop de procedure en voer een spirometrie uit om de FEV1-waarde van de patiënt te meten. Na vijf minuten inademing, of in geval van hoesten of misselijkheid, stop de vernevelaar. Vraag de patiënt om de neusklempje te verwijderen, de mond te spoelen en twee keer met kraanwater te gorgelen, en dit water weg te gooien in de gootsteen.

Vraag de patiënt vervolgens om sputum op te hoesten en wat er uit de keel komt in een plastic bakje te spugen. Voer de eerste ademhalingsmanoeuvre uit om FEV1 te meten. Na elke poging tot sputumproductie meten we de FEV1-waarde.

Als de FEV1-waarde met meer dan 20% daalt, stoppen we de procedure en geven we de patiënten een verneving van ipratropiumbromide, een anticholinergicum dat in combinatie met bèta-twee-agonisten zal werken die we al tijdens de procedure hebben toegediend. Als de FEV1-waarde niet met meer dan 20% daalt, voeren we de procedure voort voor een totale tijd van 10 tot 20 minuten, afhankelijk van de kwaliteit en het volume van sputum dat de patiënt heeft geproduceerd. Zodra u de sputummonster heeft, bewaart u deze in de koelkast tot verwerking.

De tweede fase bestaat uit de verwerking van sputum en hiervoor moeten we eerst de twee oplossingen voorbereiden die we voor deze verwerking zullen gebruiken. Dus we moeten Dithiothreitol ook bekend als DTT voorbereiden. De oplossing moet worden bereid door DTT te verdunnen met steriel water om een 6,5 millimolair oplossing te verkrijgen.

U moet ervoor zorgen dat de DTT niet wordt blootgesteld aan omgevingslucht en hiervoor gebruiken we een spuit en naald. Ten tweede moet u de trypanblauwoplossing bereiden en hiervoor moet u een verdunning van DPBS met trypanblauw doen om een oplossing van 0,08% te verkrijgen. Wat betreft het sputum, moet u het hele sputum overbrengen in een 50 mL conische bodemplastic buis en de monster wiegen. Voeg een drievoud gewicht van DPBS-oplossing toe.

Meng het monster langzaam gedurende 30 seconden, centrifugeer bij 800 g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Verzamel de supernatant in een 50 mL conische bodemplastic buis, na filtratie door twee enkele lagen steriele gaas. Verdeel de supernatant in 2 mL plastic buisjes en bewaar bij min 80 graden Celsius.

Merk op dat de supernatantmonsters voor ons nuttig zijn als driefasige component van sputum. Als het volume van de celpallet minder is dan 5 mL, voeg dan DPBS toe om een volume van 5 mL celsuspensie te bereiken. Verdun de celsuspensie met één volume DTT bij 6,5 millimolair.

Schud de celsuspensie gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur met een laboratoriumassistent. Verdun de celsuspensie minstens driemaal met DPBS. Centrifugeer de verdunde celsuspensie bij 550 g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius.

Gooi de supernatant weg. Suspensie de celpalette in ongeveer een ml DPBS. Beoordeel en noteer het exacte volume van de celsuspensie.

Voeg 50 microliter celsuspensie toe aan 50 microliter van de verdunde trypanblauwoplossing en homogeniseer. Plaats het monster onder de deksel van een hemocil cytometer en plaats het onder een optische microscoop. Beoordeel de celconcentratie van de celsuspensie, het percentage van de plaveiselc