Plaats-geleide immobilisatie van bot morfogenetische proteïne 2 op vaste oppervlakken door klik chemie
29 maart 2018
Biomaterialen doped met bot morfogenetische eiwit 2 (BMP2) zijn gebruikt als een nieuwe therapeutische strategie om non-adhesie botbreuken genezen. Om te overwinnen bijwerkingen als gevolg van een oncontroleerbare release van de factor, stellen wij voor een nieuwe strategie aan site-direct immobiliseren de factor, waardoor materialen met verbeterde mogelijkheden voor osteogenic.
Het algemene doel van dit onderzoek is de robuuste en reproduceerbare productie van een osteogeen scaffold door middel van locatie-gericht en covalent koppelen van een nieuw ontworpen BMP2-variant door middel van click chemistry. Deze methode kan helpen om problemen op te lossen die verband houden met algemeen gebruikte technieken voor de behandeling van niet-genezende defecten van lange botten. Absorptie- of incapsulatiemethoden vereisen superfysiologische hoeveelheden van BMP2 die verschillende ernstige bijwerkingen veroorzaken.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het gebruik van lagere hoeveelheden van de nieuw ontworpen BMP2-variant die covalent aan scaffolds wordt gekoppeld op een locatie-gerichte manier. Laat een enkele kolonie een nacht groeien in 50 milliliter LB-medium met 50 microgram per milliliter kanamycine en 100 microgram per milliliter ampicilline bij 37 graden Celsius. Verdun de nachtcultuur een op 20 in 800 milliliter terrific bouillonmedium aangevuld met 50 microgram per milliliter kanamycine en 100 microgram per milliliter ampicilline.
Laat de culturen groeien bij 37 graden Celsius totdat een optische dichtheid bij 600 nanometer van 0,7 is bereikt. Voeg vervolgens propofol L-Lycine toe tot een uiteindelijke concentratie van 10 millimolair. Induceer genexpressie door de toevoeging van IPTG tot een uiteindelijke concentratie van één millimolair.
Laat de cultuur groeien bij 37 graden Celsius gedurende 16 uur in een orbitale schudder bij 180 RPM. Na incubatie centrifugeert u de hele cultuur bij 9.000 keer g gedurende 30 minuten. Gooi het supernatant weg en suspendeert u de bacteriële pellet opnieuw in 30 milliliter TBSE-buffer.
Weeg een lege centrifugebeker en breng de opnieuw gesuspendeerde pellet over in de lege beker. Centrifugeer vervolgens de opnieuw gesuspendeerde pellet bij 6.360 keer g gedurende 20 minuten. Gooi het supernatant weg en weeg de beker met de pellet.
Trek het gewicht van de lege beker af om het gewicht van de pellet te berekenen. Suspendeer vervolgens de pellet opnieuw in STE-buffer. Gebruik 200 milliliter STE-buffer voor elke 10 gram pellet.
Soniceer de suspensie op ijs voordat u centrifugeert bij 6.360 keer g gedurende 20 minuten. Gooi het supernatant weg en weeg de pellet. Na het herhalen van de sonicatie- en centrifugatie stappen vier keer, suspendeer de pellet opnieuw in 100 milliliter TBS-buffer.
Centrifugeer bij 6.360 keer g gedurende 20 minuten. Gooi vervolgens het supernatant weg en weeg de pellet. Suspendeer de pellet opnieuw in nucleasebuffer met vers toegevoegde nuclease met 10 milliliter per gram pellet.
Incubeer de suspensie een nacht op kamertemperatuur op een roerplaat bij 30 RPM. De volgende dag voegt u Triton Buffer toe aan de suspensie. Het volume van Triton Buffer dat moet worden toegevoegd komt overeen met een 0,5 volumegedeelte van de suspensie.
Na incubatie gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, centrifugeert u de suspensie bij 6.360 keer g gedurende 20 minuten. Gooi het supernatant weg en weeg de pellet. Suspendeer vervolgens de pellet opnieuw in TE-buffer met acht milliliter per gram pellet.
Na centrifugatie zoals eerder, gooit u het supernatant weg en weeg de pellet. Suspendeer nu de pellet door vier milliliter per gram van 25 millimolair natriumacetaat, PH5, en vijf milliliter per gram van zes molair guanidiniumchloride met één millimolair DTT toe te voegen. Incubeer de suspensie een nacht op vier graden Celsius op een roerplaat.
Na centrifugatie bij 75.500 keer g gedurende 20 minuten bevat het supernatant het ongevouwen, monomere BMP2-eiwit. Verzamel het supernatant en concentreer dit extract tot een optische dichtheid per milliliter van 20 met behulp van een moleculair gewicht doorsnijmembrane van drie kilodalton in een concentrerende cel. Voeg de geconcentreerde monomeren in enkele druppels toe aan de renaturatiefbuffer terwijl u roert.
Incubeer vervolgens de oplossing gedurende 120 uur bij kamertemperatuur in het donker. Pas de pH van de oplossing aan tot 3,0 met behulp van geconcentreerd zoutzuur voordat u de oplossing dialyseert tegen een millimolair zoutzuur. Concentreer de gedialyseerde oplossing met behulp van een moleculair gewicht doorsnijmembrane van 10 kilodalton in een concentrerende cel.
Laad vervolgens de eiwitoplossing op de geëquilibreerde kolom, verdun fracties met behulp van een lineair gradiënt van Buffer B en verzamel fracties van twee milliliter. Analyseer 20 microliter van elke fractie met behulp van SDS-polyacrylamidegelelektroforese gevolgd door Coomassie Brilliant Blue-kleuring om de fracties met monomeren en de fracties met dimeren te bepalen. Trek vervolgens de fracties met dimeren aan.
Dialyseer de pool van fracties met dimeren een nacht bij vier graden Celsius tegen vijf liter van een millimolair zoutzuur. Concentreer het product met behulp van een concentrerende centrifugaalfiltereenheid van 10 kilodalton voordat u het eindproduct analyseert met behulp van SDS-PAGE en Coomassie Brilliant Blue-kleuring. Combineer 20 micromolair van BMP2-K3Plk of BMP2-while type dat wordt gebruikt als een negatieve controle met 20 microliter Azide-geactiveerde agarosekralen in Reactiebuffer bij een totaal volume van 500 microliter.
Incubeer gedurende twee uur bij kamertemperatuur op een roterende mixer bij 20 RPM. Stop de reactie door een uiteindelijke concentratie van vijf millimolair EDTA toe te voegen. Incubeer de oplossing gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur op een roterende mixer bij 20 RPM.
Centrifugeer vervolgens de monsters bij 20.000 keer g gedurende één minuut bij kamertemperatuur en verzamel de supernatanten. Was vervolgens het pellet met de kralen met 1.000 microliter HBS 500-buffer. Centrifugeer het monster bij 20.000 keer g gedurende één minuut bij kamertemperatuur en verzamel het supernatant.
Herhaal deze wasprocedure nog twee keer met HBS 500-buffer, drie keer met vier molair magnesiumchloride en twee keer met PBS, en verzamel elke keer het supernatant. Bewaar de gekoppelde kralen in 1.000 microliter PBS bij vier graden Celsius. Voer de ALP-test uit zoals beschreven in het tekstprotocol.
Om ALP-kleuring uit te voeren, kweek promyoblast
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een nieuwe methode voor het produceren van osteogene scaffolds via de plaatsgerichte en covalente koppeling van een BMP2-variant met behulp van clickchemie. Deze aanpak is erop gericht de bijwerkingen te verminderen die geassocieerd worden met traditionele BMP2-toedieningsmethoden bij de behandeling van niet-genezende botdefecten.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Biomaterialen
- Botgenezing
- Osteogenese
Achtergrond
- Botmorfogenetisch eiwit 2 (BMP2) is essentieel voor botgenezing.
- Traditionele toedieningsmethoden kunnen ernstige bijwerkingen veroorzaken door hoge doses BMP2.
- Plaatsgerichte immobilisatie van BMP2 kan de therapeutische effectiviteit verbeteren.
- Clickchemie biedt een nauwkeurige methode voor het koppelen van BMP2 aan scaffolds.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een robuuste methode voor de productie van scaffolds met behulp van een BMP2-variant.
- Het verminderen van de hoeveelheid BMP2 die nodig is voor effectieve botgenezing.
- Het verbeteren van de veiligheid en effectiviteit van de toediening van BMP2 bij botherstel.
Gebruikte methoden
- Productie van isang BMP2-variant via recombinante technieken.
- Covalente koppeling van BMP2 aan scaffolds met behulp van clickchemie.
- Evaluatie van de osteogene eigenschappen van de gemodificeerde scaffolds.
- Vergelijking met traditionele methoden voor de afgifte van BMP2.
Belangrijkste resultaten
- De nieuwe BMP2-variant werd succesvol gekoppeld aan scaffolds.
- Lagere doses BMP2 waren effectief bij het bevorderen van osteogenese.
- De methode vertoonde minder bijwerkingen in vergelijking met traditionele technieken.
- Scaffolds vertoonden verbeterde mechanische en biologische eigenschappen.
Conclusies
- Site-gerichte immobilisatie van BMP2 verbetert de prestaties van het scaffold.
- Deze methode zou de behandeling van niet-愈genezende botfracturen kunnen revolutioneren.
- Verdere studies zijn nodig om de langetermijneffecten en toepassingen te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Site-specifieke covalente immobilisatie van BMP2 via clickchemie maakt de reproduceerbare productie van osteogene scaffolds mogelijk met een lagere dosering van de groeifactor. Deze aanpak pakt de beperkingen van niet-specifieke BMP2-toediening aan, zoals burst-release en off-target effecten, door een gecontroleerde presentatie van het eiwit aan cellulaire receptoren te waarborgen. De methode ondersteunt de preklinische ontwikkeling van biomaterialen voor de reparatie van kritieke botdefecten door de consistentie tussen batches en de mechanistische voorspelbaarheid te verbeteren.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt functionele validatie van BMP2-receptorinteracties mogelijk door middel van georiënteerde, covalente presentatie op vaste oppervlakken.
- Operationele waarde: Vermindert variabiliteit in bioassay-uitlezingen door het elimineren van stochastische adsorptie- en desorptiedynamiek.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Biedt een gestandaardiseerd platform voor de dose-responsbeoordeling van osteogene activiteit met ALP-inductie als kwantitatief eindpunt.
- Operationele waarde: Ondersteunt een hoge reproduceerbaarheid in celgebaseerde assays door middel van gelokaliseerde, aan kralen gebonden BMP2-presentatie.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Demonstreert translationele continuïteit door in vitro ALP-expressie te koppelen aan de commitment tot de osteogene lijn in mesenchymale modellen.
- Operationele waarde: Maakt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling mogelijk door scaffold-gebonden BMP2-activiteit te correleren aan verminderde effectieve doseringsvereisten.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van targetvalidatie tot optimalisatie van preklinische modellen, ter ondersteuning van het iteratieve ontwerp van osteoinductieve biomaterialen.
- Discovery Biology: Ondersteunt het testen van hypothesen over BMP2-signaleringsmechanismen via gecontroleerde, site-specifieke ligandpresentatie.
- Screening: Maakt assay-standaardisatie mogelijk door covalente immobilisatie, waardoor de variabiliteit tussen wells in de read-outs van stromale celdifferentiatie wordt verminderd.
- Analytics: Genereert kwantitatieve, ruimtelijk opgeloste outputs (bijv. ALP-kleuringsintensiteit) die correleren met lokale osteogene inductie.
- Translational Research: Slaat een brug tussen de ontdekkingsfase en preklinische stadia door de activiteit van bead-gebonden BMP2 te valideren in C2C12-cellen, een surrogaat voor mesenchymale commitment.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar click-chemistry-platform voor site-gerichte immobilisatie van andere osteoinductieve groeifactoren naast BMP2.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt de betrouwbaarheid van het doelwit door de conformatie van BMP2 en de receptorbindende oriëntatie na koppeling te behouden.
- Operationele waarde: Verbetert de consistentie van de productie door covariante, site-specifieke koppeling, waardoor het risico op batchmislukkingen wordt verminderd.
- Strategische waarde: Vermindert de risico's bij de preklinische voortgang door de effectieve BMP2-dosis te verlagen en dosisafhankelijke bijwerkingen te minimaliseren.
- Impact op portfolio: Maakt risicostratificatie en prioritering van scaffold-kandidaten mogelijk op basis van reproduceerbare, laag-dosering osteogene prestaties.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in recombinant eiwitengineering met inbouw van onnatuurlijke aminozuren.
- Is afhankelijk van toegang tot clickchemie-reagentia (bijv. CuAAC-katalysatoren) en inerte reactiecondities om eiwitoxidatie te voorkomen.
- Necessiteert gestandaardiseerde was- en opslagprotocollen om de stabiliteit en bioactiviteit van de gekoppelde beads te behouden.
- Vereist aanpassing van de validatie van de koppelingsefficiëntie voor verschillende scaffold-chemieën (bijv. hydrogels, polymeren).
- Wordt beperkt door de noodzaak om de toegankelijkheid van de receptor na immobilisatie te bevestigen, wat kan variëren afhankelijk van de porositeit van de scaffold en de liganddichtheid.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:04
Title
0:46
Expression and Purification of BMP2-K3Plk
5:46
Covalent Coupling Technique of BMP2-K3Plk to Azide Functionalized Agarose Beads
7:04
Measuring Alkaline Phosphatase (ALP) Expression to Prove the In Vitro Bioactivity of the Produced BMP2-K3Plk Before and After the Coupling Reaction
8:34
Results: Evaluation of the Bioactivity of BMP2-K3Plk after Site-Directed Immobilization
9:54
Conclusion
