Name: Plaats-geleide immobilisatie van bot morfogenetische proteïne 2 op vaste oppervlakken door klik chemie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Leer de productie van osteogene schaffolds via plaats-geleide immobilisatie van BMP2 met klik chemie. Deze methode vermindert bijwerkingen door lagere doses te gebruiken voor botgenezing.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedanken Dr. M. Rubini (Konstanz, Duitsland) voor het verstrekken van de plasmide codering pyrrolysyl-tRNA en voor het verstrekken van pRSFduet-pyrtRNAsynth de overeenkomstige aminoacyl-tRNA synthetase-codering.

1. de productie van de BMP2 Variant BMP2-K3Plk
<ol><li>Klonen van BMP2-K3Plk door plaats-geleide mutagenese met behulp van PCR 12<ol>
<li>Versterken van menselijke volwassen BMP2 (hmBMP2) van een p25N-hmBMP2-vector (Zie Tabel van materialen) met een voorwaartse primer (5' GACCAGGACATATGGCTCAAGCCTAGCACAAACAGC 3') en een omgekeerde primer (5' CCAGGAGGATCCTTAGCGACACCCACAACCCT 3') invoering van een amber stop codon ( Label) op de positie van de eerste lysine van volwassen deel van de BMP2´s. Uitvoeren van de PCR-reactie met 33.5 µL van H2O, 10 µL van het PCR reactie mix, 1.5 µL van 10 µM dNTP stockoplossing, 1.5 µL voorste primer (10 pmol/µL), 1.5 µL van omgekeerde primer (10 pmol/µL), 1 µL van p25N-hmBMP2 (10 ng/µL) , en 1 µL van polymerase van DNA (Zie Tabel van materialen) in een thermische cycler (denaturatie bij 95 ° C gedurende 5 min, 30 cycli van denaturatie bij 95 ° C gedurende 1 min., gloeien bij 60 ° C gedurende 1 min, rek bij 72 ° C gedurende 1 minuut en een definitieve verlenging bij 72 ° C gedurende 10 minuten).</li>
		<li>Zuiveren van het PCR-product met behulp van een commercieel beschikbare kit de aanbevelingen van de fabrikant (Zie Tabel van materialen).</li>
		<li>Het PCR-product met de restrictie-enzym NdeI bij 37 ° C gedurende 45 minuten met behulp van 16 µL van H2O, 3 µL van spijsvertering buffer, 10 µL van DNA verteren (20 ng/µL), en 1 µL van het restrictie-enzym. Warmte-inactivering van het enzym bij 65 ° C voor 5 min. verteren het PCR-product met de restrictie-enzym BamHI bij 37 ° C gedurende 1 h met gebruikmaking van 16 µL van H2O, 3 µL van spijsvertering buffer, 10 µL van DNA (20 ng/µL), en 1 µL van het restrictie-enzym. Inactivering van warmte enzym bij 80 ° C gedurende 5 min.</li>
		<li>De vector van de pET11a-pyrtRNA met NdeI bij 37 ° C gedurende 2 uur en 45 min met behulp van 16 µL van H2O, 3 µL van spijsvertering buffer, 10 µL van DNA verteren (20 ng / µL), en 1 µL van het restrictie-enzym. Warmte-inactivering van 65 ° c voor 5 min. verteren de vector van de pET11a-pyrtRNA met BamHI bij 37 ° C gedurende 1 h met gebruikmaking van 16 µL van H2O, 3 µL van spijsvertering buffer, 10 µL van DNA (20 ng/µL), en 1 µL van het restrictie-enzym. Warmte-inactivering bij 80 ° C gedurende 5 min.</li>
		<li>Scheiden van de verteerd vector van onverteerd vector en resten van de spijsvertering door agarose gel elektroforese (0,8% agarose, 60 min bij 100 V). Het verteerd BMP2-K3TAG insert met verteerd pET11a-pyrtRNA backbone bij kamertemperatuur (RT) voor 2 h met gebruikmaking van 100 afbinden ng van pET11a-pyrtRNA-backbone en 34,5 ng van BMP2-K3TAG insert (1:3 molaire ratio). Het reactiemengsel bevat de ruggengraat van DNA en invoegen, 2 µL van ligase buffer, 1 µL van DNA ligase en H2O tot een totaal volume van 20 µL.</li>
		<li>Voer een co transformatie van pET11a-pyrtRNA-BMP2-K3Plk en pSRF-duet-pyrtRNAsynth in BL21(DE3) bacteriën:<ol>
<li>Voeg 50 ng van elke plasmide aan de bacteriën, plaats het mengsel op het ijs gedurende 30 minuten, heat shock bij 42 ° C gedurende 50 s, plaats op het ijs gedurende 5 minuten, voeg 500 µL van lysogenie Bouillon (LB) medium in het mengsel, en schud op 300 rpm voor 60 min.</li>
			<li>Verspreiden van 100 µL van het bacteriële mengsel op voorverwarmde kanamycine (50 µg/mL) / ampicilline (100 µg/mL) platen, en na een nacht bebroeden bij 37 ° C.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Meningsuiting en zuivering van BMP2-K3Plk 13 , 14<ol>
<li>Propageren een één kolonie overnachting in 50 mL LB voedingsbodem met 50 µg/mL kanamycine en 100 µg/mL ampicilline bij 37 ° C.</li>
		<li>Verdun overnachting culturen 1:20 in 800 mL van geweldige Bouillon (TB) medium aangevuld met 50 µg/mL kanamycine en 100 µg/mL ampicilline en groeien bij 37 ° C, totdat een OD600 van 0,7 is bereikt. Propargyl-L-lysine toevoegen om een eindconcentratie van 10 mM. Een 100 µL monster verzameld uit de cultuur voordat isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) inductie.</li>
		<li>Induceren genexpressie door de toevoeging van IPTG aan een eindconcentratie van 1 mM. Het groeien van de cultuur bij 37 ° C gedurende 16 uur in een roteerschudapparaat bij 180 t/min. Verzamelen eenmonstervan 100 µL van de cultuur.</li>
		<li>Centrifugeer de hele cultuur bij 9000 x g gedurende 30 min. negeren het supernatant en resuspendeer de bacteriële pellet in 30 mL TBSE buffer (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA)) met 1:1000 (v/v) 2-mercaptoethanol (vers toegevoegd). Let op: Ingang 2-mercaptoethanol onder de zuurkast. Vermijd contact met huid en ogen. Vermijd inademen van damp of nevel. Alle resuspensie stappen uitvoeren met buffers met 2-mercaptoethanol onder de zuurkast.</li>
		<li>Weeg een lege centrifuge bekerglas en overdracht van de geresuspendeerde pellet in het lege bekerglas. Centrifugeer bij 6,360 x g gedurende 20 min. negeren het supernatant en wegen van het bekerglas af met de pellet. Het gewicht van het lege bekerglas voor het berekenen van het gewicht van de pellet aftrekken. Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. Het bevriezen van de pellet bij-20 ° C op de korte termijn of bij-80 ° C op de lange termijn. Na het hervatten van het protocol, ontdooien de pellet op RT.</li>
		<li>Resuspendeer de pellet in STE buffer (1 mM EDTA, 375 mM sacharose, 10 mM Tris pH 8,0; 150 mM NaCl; 1:1000 (v/v) 2-mercaptoethanol (vers toegevoegd)). 200 mL STE buffer gebruiken voor elke 10 g pellet.</li>
		<li>Bewerk ultrasone trillingen ten de opschorting op ijs (10 min met 40 s puls, 20 s rem en 30% amplitude). Centrifugeer bij 6,360 x g gedurende 20 min. negeren het supernatant en weegt de pellet. Herhaal de stappen ultrasoonapparaat en centrifugeren 4 keer.</li>
		<li>Resuspendeer de pellet in 100 mL TBS buffer (10 mM Tris, 150 mM NaCl). Centrifugeer bij 6,360 x g gedurende 20 min. negeren het supernatant en weeg pellet.</li>
		<li>Resuspendeer de pellet in nuclease buffer (100 mM Tris, 1 mM EDTA, 3 mM MgCl2) met vers toegevoegd 80 U/mL nuclease (bijvoorbeeldBenzonase) met 10 mL/g pellet. Incubeer de schorsing 's nachts op RT op een opzwepende plaat (30 rpm).</li>
		<li>Toevoegen van Triton buffer (60 mM EDTA, 1.5 M NaCl, 6% (v/v) 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl) fenyl-polyethyleenglycol) tot de schorsing. Het volume van Triton buffer toe komt overeen met een 0.5 volume deel van de schorsing. Incubeer gedurende 10 min op RT (niet roeren). Centrifugeer bij 6,360 x g gedurende 20 min. negeren het supernatant en weegt de pellet.</li>
		<li>Resuspendeer de pellet in TE buffer (100 mM Tris, 20 mM EDTA) gebruik 8 mL/g pellet. Centrifugeer bij 6,360 x g gedurende 20 min. negeren het supernatant en weegt de pellet.</li>
		<li>Resuspendeer de pellet door toevoeging van 4 mL/g 25 mM NaAc pH 5.0 en 5 mL/g van 6 M GuCl met 1 mM dithiothreitol (DTT) (vers toegevoegd). Incubeer de schorsing 's nachts bij 4 ° C op een opzwepende plaat (30 rpm).</li>
		<li>Centrifugeer bij 75.500 x g gedurende 20 min. De bovendrijvende vloeistof bevat nu het ongevouwen monomere BMP2 eiwit. De bovendrijvende vloeistof en concentraat dit extract tot 20 OD/mL met behulp van een membraan 3 kDa molecuulgewicht cut-off (MWCO) in een concentratie van de cel (Zie Tabel van materialen) verzamelen.</li>
		<li>De geconcentreerde monomeren in enkele druppels toevoegen aan de renaturatie buffer (2 M LiCl, 50 mM Tris, 25 mM CHAPS, 5 mM EDTA, 1 mM glutathion-disulfide (GSSG), 2 mM glutathion (GSH)) tijdens het roeren (30 rpm). Incubeer bij RT gedurende 120 h in het donker. Opmerking: In deze incubatieperiode, uiteinde ontstaat. De oplossing van deze stap vanaf bevat de gevouwen dimeric BMP2-K3Plk.</li>
		<li>Breng de pH van de oplossing naar 3.0 met behulp van geconcentreerd HCl. Dialyze de oplossing tegen 1 mM HCl. concentraat de dialyzed oplossing met behulp van een membraan van 10 kDa molecuulgewicht cut-off (MWCO) in een gecentraliseerd cel.</li>
		<li>Equilibreer de oplossing door het toevoegen van de buffer een (20 mM NaAc, 30% isopropanol). Het toevoegen van een volume van buffer A overeenkomt met een volume van 30% van de oplossing. Centrifugeer de oplossing bij 4700 x g gedurende 15 minuten.</li>
		<li>De kolom voor ionenwisseling op een snelle proteïne vloeistofchromatografie (FPLC) systeem15 met 150 mL buffer A. Load de eiwit-oplossing op de equilibrated kolom equilibreer. Elueer fracties met behulp van een lineair verloop van buffer B (20 mM NaAc, 30% isopropanol, 2 M NaCl) met behulp van 100 mL buffer B. verzamelen 2 mL breuken. Opmerking: Concentreren het eiwit vóór het laden naar de kolom volgens het totaalkolom volume. Het volume van de definitieve eiwit moet < 5% van het totale kolom volume.</li>
		<li>Analyseren 20 µL van elke breuk met SDS-Polyacrylamide gel (12%) elektroforese (SDS-PAGE) 16 en Coomassie briljant blauw kleuring17 (Zie Tabel van materialen). Opmerking: De Coomassie briljant blauw gekleurd SDS-pagina gel toont breuken met Dimeren (26 kDa) en breuken met monomeren (13 kDa).</li>
		<li>Zwembad dimeer-bevattende breuken. Dialyze het zwembad van dimeer met breuken 's nachts bij 4 ° C tegen 1 mM HCl (5 liter volume). Het concentreren van het eindproduct met behulp van een 10 kDa concentreren centrifugaal filter eenheid (Zie Tabel van materialen). Analyseren van het eindproduct door SDS-Polyacrylamide (12%) Elektroforese van het gel (SDS-PAGE) en Coomassie briljant blauw kleuring. Opmerking: De band op de Coomassie briljant blauw gekleurd SDS-pagina gel slechts één band op 26 kDa moet tonen. Dit is het eindproduct van de BMP2-K3Plk.</li>
	</ol></li>
</ol>2. optimalisatie van koper (I)-gekatalyseerde alkyn-Azide cycloadditie (CuAAC) voorwaarden
<ol><li>Effect van natrium ascorbaat (NaAsc) en koper (II) sulfaat (CuSO 4 ) op wild type BMP2 (BMP2-WT)<ol>
<li>Incubeer 20 µM BMP2-WT met verschillende verhoudingen van NaAsc naar CuSO4. 0,5 mM NaAsc en 0,5 mM CuSO4 (vanaf concentratie) in een 50 µL volume gebruiken. Ga door met de volgende verhoudingen van NaAsc naar CuSO4: (1:1), (1.7:1), (10:1), (20: 1), de concentratie van de4 CuSO constant te houden op 0.5 mM en de concentratie van NaAsc dienovereenkomstig aan te passen. Uitvoeren van de reactie in H2O op een roterende mixer (20 rpm) 's nachts op RT.</li>
		<li>Bereiden van gereduceerde monsters door toevoeging van laden buffer met 5% 2-mercaptoethanol en incubeer monster bij 95 ° C voor 6 min. analyseren verminderd en monsters niet verlaagd door SDS-Polyacrylamide gel elektroforese (SDS-PAGE) van het (12%) en Coomassie briljant blauw kleuring. De SDS-pagina gelen gekleurd Coomasie Toon bands in de range van 13 kDa (beperkte voorwaarden) 26 kDa en hoger molecuulgewicht (niet verlaagd voorwaarden).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Effect van Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl) amine (THPTA) op de reactie van CuAAC
	<ol>
<li>Incubeer 20 µM BMP2-K3Plk met verschillende verhoudingen van THPTA naar CuSO4. Gebruik 5 mM NaAsc en 200 µM 3-Azido-7-hydroxycoumarin (Houd NaAsc en 3-Azido-7-hydroxycoumarin constant). Gebruik 50 µM THPTA en 0,5 mM voor CuSO4 als startende concentraties. Gebruik van verschillende verhoudingen van THPTA naar CuSO4: (7:1); (10:1); (12:1); (15:1); (20:1). Voer reactie in H2O (50 µL totaalvolume) voor 24 h op RT op een roterende mixer (20 rpm).</li>
		<li>Bij koppeling wordt 3-Azido-7-hydroxycoumarin een fluorescente kleurstof. Monsters in verminderde en niet verlaagd omstandigheden voor te bereiden en analyseren door SDS-PAGE. Visualiseren van de gels onder de excitatie-kanaal met de specifieke golflengte voor de 3-Azido-7-hydroxycoumarin (λabs = 404 nm; λem = 477 nm).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. covalente koppeling techniek van BMP2-K3Plk naar Azide matiemaatschappij Agarose kralen
<ol><li>Incubeer 20 µM van BMP2-K3Plk of BMP2-WT (gebruikt als negatieve controle) met 20 µL van azide-geactiveerde agarose parels in een totaal volume van 500 µL in reactie buffer (0,1 M HEPES pH 7.0, 3.9 M ureum, 50 µM CuSO4, 250 µM THPTA, 5 mM natrium ascorbaat) voor 2 h op RT op een rotati ng mixer (20 rpm). Zet de reactie stop door toevoeging van 5 mM EDTA (eindconcentratie).</li>
	<li>Incubeer bij RT gedurende 15 minuten op een roterende mixer (20 rpm). Centrifugeer steekproeven bij 20.000 x g gedurende 1 minuut op RT. Collect het supernatant.</li>
	<li>Spoel de pellet bevattende de bolletjes driemaal met 1.000 µL van HBS500 buffer (50 mM HEPES, 500 mM NaCl), driemaal met 1.000 µL van 4 M MgCl2, en twee keer met 1.000 µL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Bij elke stap van wassen, centrifugeren bij 20.000 x g gedurende 1 minuut op RT en verzamelen supernatant. Winkel gekoppeld kralen in 1000 µL van PBS bij 4 ° C. Let op: Niet storen de kraal pellet tijdens het verwijderen van de bovendrijvende substantie.</li>
</ol>4. het valideren van de aanwezigheid en de biologische activiteit van geïmmobiliseerdet BMP2-K3Plk met behulp van Texas Red Label BMP Receptor ik een Ectodomain (BMPR-IA EG )
<ol><li>Incubeer 50 µL van de BMP2-K3Plk matiemaatschappij parels met 1 µM van Texas Red Label BMPR-IAEG met 150 µL van HBS500 buffer (50 mM HEPES, 500 mM NaCl) op RT gedurende 1 uur op een roterende mixer (20 rpm).</li>
	<li>Centrifugeer de kralen bij 20.000 x g gedurende 1 minuut op RT. Discard het supernatant. Wassen van de kralen met 1000 µL van HBS500 buffer. Herhaalstap het wassen een extra 3 keer. Centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 1 minuut op RT na elk wassen stap.</li>
	<li>Resuspendeer de kralen in 500 µL van PBS en Pipetteer 50 µL op een glasplaatje dekking. De Microscoop filter tussen 561 of 594 nm instellen. Detecteren van Texas Red-BMPR-IAEG-BMP2-K3Plk matiemaatschappij kralen met behulp van fluorescentie microscopie en nemen foto's.</li>
</ol>5. meting van de alkalische fosfatase (ALP) expressie om aan te tonen van de In Vitro topicale van de BMP2-K3Plk geproduceerd vóór en na de Coupling reactie.
<ol><li>
Alkalische fosfatase (ALP) assay
	<ol>
<li>Cultuur promyoblastic C2C12 cellen (ATCC CRL-172) in Dulbecco van bewerkt Eagle's Medium (DMEM) met 10% foetale kalf Serum (FCS), 100 U/mL penicilline G en 100 µg/mL streptomycine bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer op 5% CO2.</li>
		<li>Zaad C2C12 cellen bij een dichtheid van 3 × 104 cellen per putje in een 96-Wells-microplate. Laat cellen koppelen overnachting. Verwijderen van middellange en incubeer C2C12 cellen in aanwezigheid van 0,5-200 nM BMP2-K3Plk of BMP2-WT in 100 µL per putje van DMEM (2% FCS, 100 U/mL penicilline G en 100 µg/mL streptomycine) bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer op 5% CO2 voor 72 uur.</li>
		<li>Verwijderen van middellange en wassen van cellen met PBS 100 µL per putje. Lyse cellen op RT voor 1 h met 100 µL per putje van lysis buffer (1% NP-40, 0,1 M glycine, pH 9,6, 1 mM MgCl2, 1 mM ZnCl2) op een schudden plaat (220 rpm).</li>
		<li>Voeg 100 µL per putje van ALP buffer (0,1 M glycine, pH 9,6, 1 mM MgCl2, 1 mM ZnCl2) met 1 mg/mL p-nitrophenylphosphate (vers toegevoegd) naar de cel lysate.</li>
		<li>Meten van de absorptie bij 405 nm in een multiplate lezer na het toevoegen van de ALP-buffer, en elke 5 minuten tot de ontwikkeling van de kleur voltooid is. Genereren van de dosis-respons-curven en EC50-waarden met behulp van een logistieke model, y = A2 + (A1-A2) / (1 + (x/x0)p).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Alkalische fosfatase (ALP) kleuring
	<ol>
<li>Cultuur promyoblastic C2C12 cellen (ATCC CRL-172) in Dulbecco van bewerkt Eagle Medium (DMEM) met 10% foetale kalf Serum (FCS), 100 U/mL penicilline G en 100 µg/mL streptomycine bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer op 5% CO2.</li>
		<li>Zaad C2C12 cellen bij een dichtheid van 3 × 104 cellen per putje in een 96-Wells-microplate. Laat cellen koppelen overnachting. Verwijder van middellange en Voeg 20 µL per putje van BMP2-K3Plk combinatie parels. BMP2-K3Plk combinatie kralen zijn in 1000 µL van een PBS-ophanging.</li>
		<li>Bereid een oplossing van 0,4% laag-smeltpunt agarose in DMEM. Smelten in de magnetron (600 W voor 3 min) en laat het afkoelen in een waterbad bij 37 ° C tot gebruik.</li>
		<li>Voeg 20 µL van 0,4% laag-smeltpunt agarose in elk putje (bekleding kralen en cellen). Centrifugeer bij 2000 x g gedurende 5 minuten bij 20 ° C. Voeg 80 µL DMEM (2% FCS, 100 U/mL penicilline G en 100 µg/mL streptomycine) en Incubeer bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer op 5% CO2 voor 72 uur.</li>
		<li>Medium, dat evenwel niet tot het loskoppelen van de gestolde 0,4% agarose verwijderen. Voeg 100 µL per putje van 1-stap NBT/BVIE (Nitro-blauw tetrazolium chloride, 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate p-toluïdine zout) substraat oplossing.</li>
		<li>Analyseren alkalische fosfatase kleuring met behulp van de lichte microscopie, onmiddellijk nadat de paarse kleuring blijkt. Gebruik heldere veld microscopie en fotograferen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Tsiridis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+substitutes%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Injury%22%5BJournal%5D)">Bone substitutes: An update.</a> Injury. 36, Suppl 3. S20-S27 (2005).</li>
<li>Oryan, A., Alidadi, S., Moshiri, A., Bigham-Sadegh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+proteins%3A+A+powerful+osteoinductive+compound+with+non-negligible+side+effects+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Biofactors%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic proteins: A powerful osteoinductive compound with non-negligible side effects and limitations.</a> Biofactors. 40 (5), 459-481 (2014).</li>
<li>Luginbuehl, V., Meinel, L., Merkle, H. P., Gander, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+delivery+of+growth+factors+for+bone+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharm+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Localized delivery of growth factors for bone repair.</a> Eur J Pharm Biopharm. 58 (2), 197-208 (2004).</li>
<li>Haidar, Z. S., Hamdy, R. C., Tabrizian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+recombinant+bone+morphogenetic+proteins+for+bone+regeneration+and+repair.+Part+A%3A+Current+challenges+in+BMP+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Lett%22%5BJournal%5D)">Delivery of recombinant bone morphogenetic proteins for bone regeneration and repair. Part A: Current challenges in BMP delivery.</a> Biotechnol Lett. 31 (12), 1817-1824 (2009).</li>
<li>Hollinger, J. O., Uludag, H., Winn, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+release+emphasizing+recombinant+human+bone+morphogenetic+protein-2%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Sustained release emphasizing recombinant human bone morphogenetic protein-2.</a> Adv Drug Deliv Rev. 31 (3), 303-318 (1998).</li>
<li>Uludag, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantation+of+recombinant+human+bone+morphogenetic+proteins+with+biomaterial+carriers%3A+A+correlation+between+protein+pharmacokinetics+and+osteoinduction+in+the+rat+ectopic+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res%22%5BJournal%5D)">Implantation of recombinant human bone morphogenetic proteins with biomaterial carriers: A correlation between protein pharmacokinetics and osteoinduction in the rat ectopic model.</a> J Biomed Mater Res. 50 (2), 227-238 (2000).</li>
<li>Uludag, H., Golden, J., Palmer, R., Wozney, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinated+bone+morphogenetic+protein-2%3A+In+vivo+and+in+vitro+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Biotinated bone morphogenetic protein-2: In vivo and in vitro activity.</a> Biotechnol Bioeng. 65 (6), 668-672 (1999).</li>
<li>Aono, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+ectopic+bone-inducing+activity+of+bone+morphogenetic+protein-4%2F7+heterodimer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Potent ectopic bone-inducing activity of bone morphogenetic protein-4/7 heterodimer.</a> Biochem Biophys Res Commun. 210 (3), 670-677 (1995).</li>
<li>Suzuki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+hydrogel+linked+with+synthetic+oligopeptide+derived+from+BMP-2+allows+ectopic+osteoinduction+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res%22%5BJournal%5D)">Alginate hydrogel linked with synthetic oligopeptide derived from BMP-2 allows ectopic osteoinduction in vivo.</a> J Biomed Mater Res. 50 (3), 405-409 (2000).</li>
<li>Knaus, P., Sebald, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperativity+of+binding+epitopes+and+receptor+chains+in+the+BMP%2FTGFbeta+superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cooperativity of binding epitopes and receptor chains in the BMP/TGFbeta superfamily.</a> Biol Chem. 382 (8), 1189-1195 (2001).</li>
<li>Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+genetic+code%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys+Biomol+Struct%22%5BJournal%5D)">Expanding the genetic code.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 225-249 (2006).</li>
<li>Costa, G. L., Weiner, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+PCR+site-directed+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Rapid PCR site-directed mutagenesis.</a> CSH Protoc. 2006 (1), (2006).</li>
<li>Kirsch, T., Nickel, J., Sebald, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+recombinant+BMP+receptor+IA+ectodomain+and+its+2%3A1+complex+with+BMP-2%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Isolation of recombinant BMP receptor IA ectodomain and its 2:1 complex with BMP-2.</a> FEBS Lett. 468 (2-3), 215-219 (2000).</li>
<li>Tabisz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-directed+immobilization+of+BMP-2%3A+Two+approaches+for+the+production+of+innovative+osteoinductive+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Site-directed immobilization of BMP-2: Two approaches for the production of innovative osteoinductive scaffolds.</a> Biomacromolecules. 18 (3), 695-708 (2017).</li>
<li>Duong-Ly, K. C., Gabelli, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+ion+exchange+chromatography+to+purify+a+recombinantly+expressed+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Using ion exchange chromatography to purify a recombinantly expressed protein.</a> Methods Enzymol. 541, 95-103 (2014).</li>
<li>Brunelle, J. L., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-dimensional+SDS-polyacrylamide+gel+electrophoresis+%281D+SDS-PAGE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">One-dimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (1D SDS-PAGE).</a> Methods Enzymol. 541, 151-159 (2014).</li>
<li>Brunelle, J. L., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coomassie+blue+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Coomassie blue staining.</a> Methods Enzymol. 541, 161-167 (2014).</li>
<li>Kirsch, T., Nickel, J., Sebald, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP-2+antagonists+emerge+from+alterations+in+the+low-affinity+binding+epitope+for+receptor+BMPR-II%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">BMP-2 antagonists emerge from alterations in the low-affinity binding epitope for receptor BMPR-II.</a> EMBO J. 19 (13), 3314-3324 (2000).</li>
<li>Hein, J. E., Fokin, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper-catalyzed+azide-alkyne+cycloaddition+%28CuAAC%29+and+beyond%3A+new+reactivity+of+copper%28I%29+acetylides%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">Copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) and beyond: new reactivity of copper(I) acetylides.</a> Chem Soc Rev. 39 (4), 1302-1315 (2010).</li>
<li>Alborzinia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+kinetics+analysis+of+BMP2+uptake+into+cells+and+its+modulation+by+BMP+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Quantitative kinetics analysis of BMP2 uptake into cells and its modulation by BMP antagonists.</a> J Cell Sci. 126 (Pt 1), 117-127 (2013).</li>
<li>Paarmann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin-dependent+endocytosis+of+Bone+Morphogenetic+Protein2+%28BMP2%29+and+its+receptors+is+dispensable+for+the+initiation+of+Smad+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamin-dependent endocytosis of Bone Morphogenetic Protein2 (BMP2) and its receptors is dispensable for the initiation of Smad signaling.</a> Int J Biochem Cell Biol. 76, 51-63 (2016).</li>
<li>Pohl, T. L., Boergermann, J. H., Schwaerzer, G. K., Knaus, P., Cavalcanti-Adam, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+immobilization+of+bone+morphogenetic+protein+2+via+a+self-assembled+monolayer+formation+induces+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Surface immobilization of bone morphogenetic protein 2 via a self-assembled monolayer formation induces cell differentiation.</a> Acta Biomater. 8 (2), 772-780 (2012).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Genereren van gecodeerde eiwit varianten door genetische codon expansie kan de invoering van verschillende niet-natuurlijke aminozuur-analogen voornamelijk op elke positie van de primaire eiwit sequentie. In het geval van BMP's zoals BMP2, gemeenschappelijke tags, zoals een 6-Histidine (zijn)-tag kan alleen worden aangebracht N-terminaal, sedert het einde van de protein´s C-terminal is begraven in de tertiaire eiwitstructuur, en dus niet toegankelijk vanaf de buitenkant is. Op andere posities, kan de grootte van de geïnt...

Het uiteindelijke doel van bot weefselregeneratie engineering en bot is het overwinnen van de nadelen en beperkingen die zich voordoen tijdens voorkomende behandelingen van non-adhesie fracturen. Auto - of allo-transplantaties worden voornamelijk gebruikt als huidige therapie strategieën, ook al ze beide verschillende nadelen hebben. De ideale bottransplantatie moet induceren osteogenesis door zowel osteoinduction als osteoconduction, wat leidt tot de osteointegration van de prothese in het bot. Alleen auto-transplantatie wordt tegenwoordig beschouwd als de "gouden standaard" omdat het voorziet alle karakteristieken van een ideale bottransplantatie. Helaas presenteert het ook belangrijke negatieve aspecten, zoals lange chirurgie times, en een tweede trauma site dien meestal meer complicaties (bijvoorbeeldchronische pijn, hematoom formaties, infecties, cosmetische defecten, enz.). Allogene transplantaten, hebben aan de andere kant suboptimaal kenmerken voor alle algemene aspecten1. Alternatieve bone graft technologieën zijn verbeterd in de afgelopen jaren, met als doel het produceren van steigers die osteo-inductief, osteoconductive, biocompatibel, en bioresorbable. Aangezien veel biomaterialen niet al deze osteogenic kenmerken vertonen, zijn verschillende groeifactoren, voornamelijk BMP2 en BMP7, ter verbetering van het osteogenic potentieel van de bijzondere steiger2opgenomen.
Als een essentieel criterium dienen dergelijke groeifactor levering systemen een release van de gecontroleerde dosis na verloop van tijd ter vergemakkelijking van de essentiële gebeurtenissen zoals cel aanwerving en bijlage, cel ingroei en angiogenese. Echter BMP's evenals andere osteogenic groeifactoren zijn vaak geïmmobiliseerd non-covalent3. Entrapment en adsorptie technieken vereisen het gebruik van supra-fysiologische hoeveelheden eiwit door de vrijval van een eerste uitbarsting, die tot ernstige nadelen in vivo meestal invloed op de omliggende weefsels leidt door het inducerende bot begroeiing, Osteolyse, zwelling en ontsteking4. Dus, het behoud van groeifactoren op de site van de levering voor langere perioden kan worden bereikt door covalente immobilisatie methoden. Chemisch gewijzigd BMP2 (succinylated5, geacetyleerd6 of biotinyleerd7) heterodimers8ontworpen, of BMP2 afgeleide oligopeptides9 zijn ontworpen en gebruikt voor het overwinnen van de beperkingen met betrekking tot absorptie. De bio-activiteit van deze constructies is echter niet voorspelbaar omdat de regeling mogelijk de binding van de geïmmobiliseerdet ligand aan de cellulaire receptoren remt. Als eerder is laten zien is het essentieel dat alle vier receptor ketens die betrokken zijn bij de vorming van complexen van de geactiveerde ligand-receptor interactie met de geïmmobiliseerdet BMP2 om alle downstream signalering cascades10volledig te activeren.
Om de problemen van een inhomogene product resultaat met beperkingen in termen van topicale, stabiliteit en biologische beschikbaarheid van de geïmmobiliseerdet factor, ontwierpen we een BMP variant kan covalent verbindend steigers in een plaats-geleide manier. Deze variant, aangeduid als BMP2-K3Plk, bestaat uit een kunstmatige aminozuur werd geïntroduceerd door genetische codon uitbreiding11. Deze variant is met succes gekoppeld aan steigers met behulp van een covalente koppeling strategie met behoud van de biologische activiteit.

<table><tbody><tr><td>Materiaal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-Step NBT/BCIP</td><td>Thermo Fisher</td><td>34042</td><td>Los oplossing toevoegen aan cellen</td></tr><tr><td>3-Azido-7-hydroxycoumarine</td><td>BaseClick</td><td>BCFA-047-1</td><td>Chemisch product dat gebruikt wordt voor click reactie</td></tr><tr><td>Agarose met laag smeltpunt</td><td>Biozym</td><td>840101</td><td>Agarose voor ALP assay</td></tr><tr><td>Azide agarose kralen</td><td>Jena Bioscience</td><td>CLK-1038-2</td><td>Kralen die gebruikt worden voor reactie</td></tr><tr><td>BamHI (Fast Digest enzym)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FD0054</td><td>Restrictie-enzym</td></tr><tr><td>BMP receptor IA (BMPR-IAEC)</td><td>--</td><td>--</td><td>Geproduceerd in ons lab</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue G-250 kleurstof</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20279</td><td>Chemisch product dat gebruikt wordt voor Coomassie Brilliant blue kleuring van SDS PAGE</td></tr><tr><td>Koper (II) sulfaat watervrij (CuSO4)</td><td>Alfa Aesar</td><td>A13986</td><td>Chemisch product dat gebruikt wordt voor click reactie</td></tr><tr><td>DNA Polymerase en reactiebuffer</td><td>Kapabiosystems</td><td>KK2102</td><td>KAPA HiFi PCR Kit</td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s gemodificeerd Eagle&rsquo;s medium (DMEM) GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>61965-026</td><td>Celcultuurmedium</td></tr><tr><td>ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>E5134-1kg</td><td>Chemisch product dat gebruikt wordt om click reactie te stoppen</td></tr><tr><td>Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>2316.5</td><td>Bacteriëninductie (1mM eindconcentratie)</td></tr><tr><td>NdeI (Fast Digest enzym)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ER0581</td><td>Restrictie-enzym</td></tr><tr><td>NHS-geactiveerde Texas Red</td><td>Life technologies</td><td>T6134</td><td>Gekoppeld aan receptor</td></tr><tr><td>P- Nitrofenylfosfaat</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>N4645-1G</td><td>Alkaline Fosfatase</td></tr><tr><td>p25N-hmBMP2</td><td>--</td><td>--</td><td>Plasmid dat beleefd ter beschikking is gesteld door Walter Sebald aan J. Nickel</td></tr><tr><td>pET11a-pyrtRNA</td><td>--</td><td>--</td><td>Beschikbaar gesteld door de leerstoel Farmacie en Biofarmacie, Universiteit Wuerzburg</td></tr><tr><td>propargyl-L-lysine (Plk)</td><td>--</td><td>--</td><td>Beschikbaar gesteld door de leerstoel Farmacie en Biofarmacie, Universiteit Wuerzburg</td></tr><tr><td>pSRFduet-pyrtRNAsynth</td><td>--</td><td>--</td><td>Beschikbaar gesteld door de leerstoel Farmacie en Biofarmacie, Universiteit Wuerzburg</td></tr><tr><td>Qiagen Gel Extractie Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Gel zuivering</td></tr><tr><td>Qiagen PCR zuiveringskit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>PCR Zuivering</td></tr><tr><td>Natrium L-ascorbinezuur</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>A7631-100G</td><td>Chemisch product dat gebruikt wordt voor click reactie</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>ThermoScientific</td><td>EL0011</td><td>Ligatie</td></tr><tr><td>tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA)</td><td>BaseClick</td><td>BCMI-006-100</td><td>Chemisch product dat gebruikt wordt voor click reactie</td></tr><tr><td>4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)fenyl-polyethyleenglycol</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>X100-1L</td><td>Triton X 100</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amicon concentrerende cel 400 ml</td><td>Merck KGaA</td><td>UFSC40001</td><td>Concentrerende unit</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 Centrifugale Filter Units</td><td>Merck KGaA</td><td>UFC901024</td><td>Concentrerende centrifugale unit</td></tr><tr><td>ÄKTA avant FPLC</td><td>ÄKTA</td><td>--</td><td>FPLC machine</td></tr><tr><td>Avanti J-26XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>393124</td><td>Centrifuge voor bacteriële cultuur</td></tr><tr><td>Bacterieel schuddende incubator</td><td>Infors HT</td><td></td><td>Schuddende incubator voor bacteriële cultuur</td></tr><tr><td>FluorChem Q systeem</td><td>proteinsimple</td><td>--</td><td>Beeldvormings- en analysesysteem voor SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Fluorescente microscoop</td><td>Keyence</td><td>BZ-9000 (BIOREVO)</td><td></td></tr><tr><td>Fractogel® EMD SO3- (M)</td><td>Merck KGaA</td><td>116882</td><td>Ionenuitwisselingschromatografie kolom materiaal</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR® 96 wel platen</td><td>Sigma</td><td>M5811-40EA</td><td>96 wel platen voor celcultuur (ALP Assay)</td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge X1R</td><td>ThermoScientific</td><td>--</td><td>Centrifuge</td></tr><tr><td>M-20 Microplate draaiende emmer rotor</td><td>ThermoScientific</td><td>75003624</td><td>Rotor voor Microcentrifuge voor platen tijdens ALP kleuring</td></tr><tr><td>Microcentrifuge - 5417R</td><td>Eppendorf</td><td>--</td><td>Centrifuge</td></tr><tr><td>OriginPro 9.1 G</td><td>OriginLab</td><td>--</td><td>software voor statistische analyse van ALP assay data</td></tr><tr><td>Polysine Slides</td><td>ThermoScientific</td><td>10143265</td><td>microscope slides</td></tr><tr><td>Rotor JA-10</td><td>Beckman Coulter</td><td>--</td><td>rotor voor Avanti J-26XP centrifuge</td></tr><tr><td>Rotor JLA 8.1</td><td>Beckman Coulter</td><td>--</td><td>rotor voor Avanti J-26XP centrifuge</td></tr><tr><td>Rotor JA 25.50</td><td>Beckman Coulter</td><td>--</td><td>rotor voor Avanti J-26XP centrifuge</td></tr><tr><td>Tecan infinite M200 multiplate reader</td><td>Tecan Deutschland GmbH</td><td>--</td><td>Multiplate reader voor ALP assay</td></tr><tr><td>Thermocycler - Labcycler Gradient</td><td>SensoQuest GmbH</td><td>--</td><td>PCR</td></tr><tr><td>TxRed - microscoopfilter</td><td>Keyence</td><td></td><td>Filter voor fluorescente microscoop</td></tr><tr><td>Ultrafiltratie geregenereerde cellulose discs 3 kDa</td><td>Merck KGaA</td><td>PLBC04310</td><td>gebruikt met amicon concentrerende cel 400ml</td></tr><tr><td>Ultrafiltratie geregenereerde cellulose discs 10 kDa</td><td>Merck KGaA</td><td>PLGC04310</td><td>gebruikt met amicon concentrerende cel 400ml</td></tr></tbody></table>

plaats-geleide immobilisatie van bot morfogenetische proteïne 2 op vaste oppervlakken door klik chemie

Site-Directed Immobilization of Bone Morphogenetic Protein 2 to Solid Surfaces by Click Chemistry

Verschillende therapeutische strategieën voor de behandeling van niet-genezende lang bot gebreken zijn intensief onderzocht. Momenteel gebruikt behandelingen aanwezig verschillende beperkingen die hebben geleid tot het gebruik van biomaterialen in combinatie met osteogenic groeifactoren, zoals bot morfogenetische eiwitten (BMP's). Veelgebruikte methoden voor absorptie of inkapseling vereisen supra-fysiologische hoeveelheden BMP2, typisch resulterend in een zogenaamde eerste uitbarsting release effect dat diverse ernstige nadelige bijwerkingen lokt. Covalent het eiwit te koppelen aan het schavot zou een mogelijke strategie om deze problemen te overwinnen. Koppeling, moet bovendien, teneinde een reproduceerbare product resultaat op een specifieke wijze te worden uitgevoerd. Dus we gemaakt een BMP2 variant, waarin een kunstmatige aminozuur (propargyl-L-lysine) werd geïntroduceerd in het volwassen deel van de BMP2 proteïne door codon gebruik expansie (BMP2-K3Plk). BMP2-K3Plk werd gekoppeld aan matiemaatschappij kralen door koper gekatalyseerde azide-alkyn cycloadditie (CuAAC). De biologische activiteit van de gekoppelde BMP2-K3Plk in vitro werd bewezen, en de osteogenic activiteit van de BMP2-K3Plk-matiemaatschappij parels werd bewezen in cellen gebaseerd. De functionalized kralen in contact met C2C12 cellen konden voor het opwekken van expressie van het alkalisch fosfatase (ALP) in de nabijheid van het lokaal beperkt van de parel. Dus, door deze techniek, matiemaatschappij steigers kunnen worden geproduceerd dat kan leiden tot celdifferentiatie naar een osteogenic afstamming. Bovendien, volstaan lagere BMP2 doses als gevolg van de gecontroleerde oriëntatie van plaats-geleide gekoppelde BMP2. Met deze methode worden de BMP's altijd blootgesteld aan hun receptoren op het celoppervlak in de juiste oriëntatie, die niet het geval is als de factoren zijn gekoppeld via niet-plaats-geleide koppeling technieken. Het resultaat van het product is zeer controleerbaar en dus resultaten in materialen met homogene eigenschappen, verbetering van hun toepasbaarheid voor de reparatie van kritische omvang bot gebreken.

In dit artikel beschrijven we een methode om te koppelen covalent een nieuwe variant van de BMP2, BMP2-K3Plk, aan verkrijgbare azide matiemaatschappij agarose kralen (Figuur 1). De topicale van de geproduceerde BMP2-K3Plk-variant werd gevalideerd door de inductie van alkalische fosfatase (ALP) genexpressie in cellen van de C2C12. De in vitro -test toont vergelijkbare ALP expressie niveaus geïnduceerd door wild type BMP2 (BMP2-WT) en BMP2-K3Plk (<stro...

Biomaterialen doped met bot morfogenetische eiwit 2 (BMP2) zijn gebruikt als een nieuwe therapeutische strategie om non-adhesie botbreuken genezen. Om te overwinnen bijwerkingen als gevolg van een oncontroleerbare release van de factor, stellen wij voor een nieuwe strategie aan site-direct immobiliseren de factor, waardoor materialen met verbeterde mogelijkheden voor osteogenic.

Plaats-geleide immobilisatie van bot morfogenetische proteïne 2 op vaste oppervlakken door klik chemie

Different therapeutic strategies for the treatment of non-healing long bone defects have been intensively investigated. Currently used treatments present ...

Het algemene doel van dit onderzoek is de robuuste en reproduceerbare productie van een osteogeen scaffold door middel van locatie-gericht en covalent koppelen van een nieuw ontworpen BMP2-variant door middel van click chemistry. Deze methode kan helpen om problemen op te lossen die verband houden met algemeen gebruikte technieken voor de behandeling van niet-genezende defecten van lange botten. Absorptie- of incapsulatiemethoden vereisen superfysiologische hoeveelheden van BMP2 die verschillende ernstige bijwerkingen veroorzaken.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het gebruik van lagere hoeveelheden van de nieuw ontworpen BMP2-variant die covalent aan scaffolds wordt gekoppeld op een locatie-gerichte manier. Laat een enkele kolonie een nacht groeien in 50 milliliter LB-medium met 50 microgram per milliliter kanamycine en 100 microgram per milliliter ampicilline bij 37 graden Celsius. Verdun de nachtcultuur een op 20 in 800 milliliter terrific bouillonmedium aangevuld met 50 microgram per milliliter kanamycine en 100 microgram per milliliter ampicilline.Laat de culturen groeien bij 37 graden Celsius totdat een optische dichtheid bij 600 nanometer van 0,7 is bereikt. Voeg vervolgens propofol L-Lycine toe tot een uiteindelijke concentratie van 10 millimolair. Induceer genexpressie door de toevoeging van IPTG tot een uiteindelijke concentratie van één millimolair.Laat de cultuur groeien bij 37 graden Celsius gedurende 16 uur in een orbitale schudder bij 180 RPM. Na incubatie centrifugeert u de hele cultuur bij 9.000 keer g gedurende 30 minuten. Gooi het supernatant weg en suspendeert u de bacteriële pellet opnieuw in 30 milliliter TBSE-buffer.Weeg een lege centrifugebeker en breng de opnieuw gesuspendeerde pellet over in de lege beker. Centrifugeer vervolgens de opnieuw gesuspendeerde pellet bij 6.360 keer g gedurende 20 minuten. Gooi het supernatant weg en weeg de beker met de pellet.Trek het gewicht van de lege beker af om het gewicht van de pellet te berekenen. Suspendeer vervolgens de pellet opnieuw in STE-buffer. Gebruik 200 milliliter STE-buffer voor elke 10 gram pellet.Soniceer de suspensie op ijs voordat u centrifugeert bij 6.360 keer g gedurende 20 minuten. Gooi het supernatant weg en weeg de pellet. Na het herhalen van de sonicatie- en centrifugatie stappen vier keer, suspendeer de pellet opnieuw in 100 milliliter TBS-buffer.Centrifugeer bij 6.360 keer g gedurende 20 minuten. Gooi vervolgens het supernatant weg en weeg de pellet. Suspendeer de pellet opnieuw in nucleasebuffer met vers toegevoegde nuclease met 10 milliliter per gram pellet.Incubeer de suspensie een nacht op kamertemperatuur op een roerplaat bij 30 RPM. De volgende dag voegt u Triton Buffer toe aan de suspensie. Het volume van Triton Buffer dat moet worden toegevoegd komt overeen met een 0,5 volumegedeelte van de suspensie.Na incubatie gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, centrifugeert u de suspensie bij 6.360 keer g gedurende 20 minuten. Gooi het supernatant weg en weeg de pellet. Suspendeer vervolgens de pellet opnieuw in TE-buffer met acht milliliter per gram pellet.Na centrifugatie zoals eerder, gooit u het supernatant weg en weeg de pellet. Suspendeer nu de pellet door vier milliliter per gram van 25 millimolair natriumacetaat, PH5, en vijf milliliter per gram van zes molair guanidiniumchloride met één millimolair DTT toe te voegen. Incubeer de suspensie een nacht op vier graden Celsius op een roerplaat.Na centrifugatie bij 75.500 keer g gedurende 20 minuten bevat het supernatant het ongevouwen, monomere BMP2-eiwit. Verzamel het supernatant en concentreer dit extract tot een optische dichtheid per milliliter van 20 met behulp van een moleculair gewicht doorsnijmembrane van drie kilodalton in een concentrerende cel. Voeg de geconcentreerde monomeren in enkele druppels toe aan de renaturatiefbuffer terwijl u roert.Incubeer vervolgens de oplossing gedurende 120 uur bij kamertemperatuur in het donker. Pas de pH van de oplossing aan tot 3,0 met behulp van geconcentreerd zoutzuur voordat u de oplossing dialyseert tegen een millimolair zoutzuur. Concentreer de gedialyseerde oplossing met behulp van een moleculair gewicht doorsnijmembrane van 10 kilodalton in een concentrerende cel.Laad vervolgens de eiwitoplossing op de geëquilibreerde kolom, verdun fracties met behulp van een lineair gradiënt van Buffer B en verzamel fracties van twee milliliter. Analyseer 20 microliter van elke fractie met behulp van SDS-polyacrylamidegelelektroforese gevolgd door Coomassie Brilliant Blue-kleuring om de fracties met monomeren en de fracties met dimeren te bepalen. Trek vervolgens de fracties met dimeren aan.Dialyseer de pool van fracties met dimeren een nacht bij vier graden Celsius tegen vijf liter van een millimolair zoutzuur. Concentreer het product met behulp van een concentrerende centrifugaalfiltereenheid van 10 kilodalton voordat u het eindproduct analyseert met behulp van SDS-PAGE en Coomassie Brilliant Blue-kleuring. Combineer 20 micromolair van BMP2-K3Plk of BMP2-while type dat wordt gebruikt als een negatieve controle met 20 microliter Azide-geactiveerde agarosekralen in Reactiebuffer bij een totaal volume van 500 microliter.Incubeer gedurende twee uur bij kamertemperatuur op een roterende mixer bij 20 RPM. Stop de reactie door een uiteindelijke concentratie van vijf millimolair EDTA toe te voegen. Incubeer de oplossing gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur op een roterende mixer bij 20 RPM.Centrifugeer vervolgens de monsters bij 20.000 keer g gedurende één minuut bij kamertemperatuur en verzamel de supernatanten. Was vervolgens het pellet met de kralen met 1.000 microliter HBS 500-buffer. Centrifugeer het monster bij 20.000 keer g gedurende één minuut bij kamertemperatuur en verzamel het supernatant.Herhaal deze wasprocedure nog twee keer met HBS 500-buffer, drie keer met vier molair magnesiumchloride en twee keer met PBS, en verzamel elke keer het supernatant. Bewaar de gekoppelde kralen in 1.000 microliter PBS bij vier graden Celsius. Voer de ALP-test uit zoals beschreven in het tekstprotocol.Om ALP-kleuring uit te voeren, kweek promyoblast

site-directed-immobilization-bone-morphogenetic-protein-2-to-solid

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

In dit artikel beschrijven we hoe we krijgen FRET sporen van individuele DNA-moleculen geïmmobiliseerd op een oppervlak met behulp van een geautomatiseerde scanning confocale microscoop.

Geautomatiseerd systeem voor Single Molecule Fluorescentie metingen van Surface-geïmmobiliseerde biomoleculen

Een faag display bibliotheek werd gebruikt om de peptide-sequenties die zich richten op het bot te identificeren. Het doel was om het effect van deze peptiden op mesenchymale cel differentiatie te onderzoeken en om het effect op het bot regeneratie te bepalen.

Peptiden van faag display bibliotheek Modulate genexpressie in mesenchymale cellen en versterken Osteogenesis in Unicortical Bone Gebreken

We presenteren een methode voor een snelle, omkeerbare immobilisatie van kleine moleculen en gefunctionaliseerde nanodeeltjes assemblages voor Surface Plasmon Resonance (SPR) studies, met behulp van sequentiële on-chip bioorthogonal cycloadditiereactie chemie en antilichaam-antigen capture.

Microfluïdische On-chip Capture-cycloadditiereactie omkeerbaar Immobiliseer Small Molecules of Multi-component Structuren voor biosensortoepassingen

We beschrijven een werkwijze voor het bewerkstelligen van een efficiënte immobilisatie van BMP-2 op oppervlakken. Onze benadering is gebaseerd op de vorming van een zelf samengestelde monolaag op de covalente binding van BMP-2 via zijn vrije amine residuen bereiken. Deze methode is een nuttig hulpmiddel om signalering te studeren aan het celmembraan.

Covalente binding van BMP-2 op oppervlakken met een Zelf-geassembleerde monolaag Aanpak

Celcultuur substraten die gefunctionaliseerd zijn met microscopische patronen van biologische liganden hebben een immense bruikbaarheid op het gebied van weefselengineering. Hier demonstreren we de veelzijdige en geautomatiseerde productie van celcultuur substraten met meerdere, microgepatteerde poly(ethyleenglycol) borstels die orthogonale chemieën presenteren die ruimtelijk nauwkeurige en locatiespecifieke immobilisatie van biologische liganden mogelijk maken.

Fabriceren Complex Cultuur Substrates behulp Robotic Microcontact Printing (R-μCP) en Sequential Nucleofiele Substitutie

Een stapsgewijs generiek proces voor het creëren van een botachtig sjabloon met geconstrueerde microkanalen wordt gepresenteerd. Hoge absorptie- en retentiecapaciteiten van het sjabloon worden aangetoond door capillaire actie via microkanalen.

Onderscheidend capillaire actie van Micro-kanalen in Bone-achtige sjablonen kunnen verbeteren Aanwerving van Cellen voor Herstel van de Grote Bony Defect

Zelf-geassembleerde polyelektrolyetcomplexen (PEC) gemaakt van heparine en protamine werden afgezet op alginaatkralen om osteogene groeifactoren vast te houden en de afgifte ervan te reguleren. Deze afgiftestrategie maakt een 20-voudige vermindering van de BMP-2 dosis mogelijk bij toepassingen voor spinale fusie. Dit artikel illustreert de voordelen en fabricage van PEC's.

Polyelectrolyte Complex voor Heparine Binding Domain osteogeen Growth Factor Delivery

Bij deze methode, wij gebruiken photopolymerization en klik op chemie technieken proteïne of peptide om patronen te creëren op het oppervlak van polyethyleenglycol (PEG) hydrogels, verstrekken geïmmobiliseerd bioactieve signalen voor de studie van cellulaire reacties in vitro .

Patronen van bioactieve eiwitten of peptiden op Hydrogel Fotochemie voor biologische toepassingen gebruiken

Op een ondergrond, die kan worden gebruikt voor het uitvoeren van cel-vrije gen expressie experimenten op biochips beschrijven we een eenvoudige lithografische procedure voor de immobilisatie van gen-lengte DNA moleculen.

Functionele oppervlak-immobilisatie van genen met behulp van meerstaps Strand Displacement lithografie

Hier presenteren we protocollen voor het analyseren van botremodellering binnen een lab-on-a-chip platform. Een 3D-geprint mechanisch laadapparaat kan worden gekoppeld aan het platform om osteocyte mechanostransductie te induceren door de cellulaire matrix te vervormen. Het platform kan ook worden gebruikt om botremodellering functionele resultaten van osteoclasten en osteoblasten (resorptie / vorming) te kwantificeren.

Een Lab-On-A-Chip Platform voor het stimuleren van Osteocyte Mechanotransductie en het analyseren van functionele resultaten van bone remodeling

Dit protocol beschrijft een 3D-printtechniek om botachtige structuren te fabriceren door een calciumfosfaatinkt af te zetten in een op gelatine gebaseerde korrelige ondersteuning. Geprinte botanalogen worden in vrije vorm afgezet, met flexibiliteit voor het direct oogsten van de afdruk of crosslinking binnen een levende celmatrix voor multifasische constructies.

Keramische omnidirectionele bioprinting in celbeladen suspensies voor het genereren van botanalogen

Leer de productie van osteogene schaffolds via plaats-geleide immobilisatie van BMP2 met klik chemie. Deze methode vermindert bijwerkingen door lagere doses te gebruiken voor botgenezing.

Plaats-geleide immobilisatie van bot morfogenetische proteïne 2 op vaste oppervlakken door klik chemie

Meer video's verkennen