In Vitro SUMOylation Assay te studeren SUMO E3 Ligase activiteit
29 januari 2018
In tegenstelling tot ubiquitin ligases, zijn paar E3 SUMO ligases geïdentificeerd. Deze gewijzigde in vitro SUMOylation protocol vermag roman SUMO E3 ligases identificeren door een reconstructie in vitro assay.
Het algemene doel van dit experiment is om een eiwit van belang te verifiëren dat SUMOylering kan ondergaan of een SUMO E3 lygase is. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken in het SUMOyleringsveld, zoals de identificatie van SUMO E3 lygases. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze kan worden gebruikt voor het onderzoek naar de specificiteit van SUMO E3 lygases ten opzichte van verschillende SUMO isovormen.
De procedure zal worden gedemonstreerd door Wan-Shan Young, een promovendus uit mijn laboratorium. Om het K-bZIP-label te zuiveren, incubeer eerst 10 milliliter cellulair lysaat met 50 microliter antilichaam-gelabelde magnetische kralen in een 14-milliliter polypropyleenbuis. Draai vervolgens de buis gedurende drie uur op 50 omwentelingen per minuut bij vier graden Celsius in een suspensiemixer.
Zodra het eiwit is gevangen, centrifugeer het monster gedurende 30 seconden bij 800 keer g bij vier graden Celsius om de kralen te bezinken. Gooi alle oplosmiddel op een milliliter na weg om de kralen opnieuw op te schorsen. Breng de opgeloste kralen vervolgens over in een 1,5-milliliter buis.
Om de gevangen eiwitten te wassen, plaats de buis met de kralen op een magnetische standaard. Wacht ongeveer drie seconden totdat de kralen aan de wanden van de buis hechten en verwijder vervolgens het supernatant. Om de kralen te wassen, voeg je een milliliter lysisbuffer toe aan de 1,5-milliliter buis.
Keer vervolgens de buis tien keer om. Plaats vervolgens de 1,5-milliliter buis op de magnetische standaard en verwijder het supernatant zodra de kralen aan de wanden hechten. Om de kralen opnieuw te wassen, voeg je een milliliter fosfaatgebufferd zoutoplossing toe aan de 1,5 milliliter buis en keer je het tien keer om.
Breng vervolgens de buis over op de magnetische standaard en verwijder het supernatant zodra de kralen aan de wanden hechten. Om de K-bZIP-gelabelde eiwitten van de antilichaam-gelabelde magnetische kralen te elueren, voeg je 100 microliter toe met 150 microgram per milliliter octapeptide gediluteerd in fosfaatgebufferde zoutoplossing in de 1,5-milliliter buis. Draai vervolgens de buis gedurende tien minuten op een suspensiemixer met 50 omwentelingen per minuut op kamertemperatuur.
Breng de buis over op de magnetische standaard. Verzamel vervolgens het K-bZIP-bevattende supernatant. Om de gezuiverde K-bZIP-label te analyseren, onderwerp je een tot vijf microliter van het gezuiverde eiwit aan SDS-pagina, gevolgd door Coomassie blauwkleuring.
Laad 0,5, 1 en 2 microgram bovien serumalbumine als standaard op de gel voor het bepalen van de K-bZIP-concentratie. Terwijl de afbeelding wordt verwerkt in Image J. Verdun vervolgens het gezuiverde K-bZIP in fosfaatgebufferde zoutoplossing. Om een eindconcentratie van 100 nanogram per microliter te bereiken.
En bewaar het op minus 80 graden Celsius in kleine aliquoten. Voeg drie microliter van 100 nanogram per microliter van gezuiverd gelabeld K-bZIP toe aan de in vitro SUMOylering mastermix reactie. Meng vervolgens de inhoud van de mastermix voorzichtig en incubeer bij 30 graden Celsius gedurende drie uur.
Voeg vervolgens 20 microliter van 2X SDS-pagina met laadbuffer toe om de reactie te stoppen. Verhit vervolgens de monsters gedurende vijf minuten op 95 graden Celsius om het eiwit te denatureren. Laad vervolgens 20 microliter van het monster op een 10%SDS-pagina gel.
En laat de gel draaien op 80 volt gedurende ongeveer 120 minuten totdat de kleurstof de bodem van de gel bereikt. Zodra de elektroforese voorbij is, ontkoppel de gelapparatuur. En breng de gel over in semi-droog overdrachtspuffer gedurende vijf minuten.
Demp vervolgens de PVDF-membraan in een andere container gevuld met methanol gedurende een minuut. Verwijder de PVDF-membraan uit de methanol en dompel het in semi-droog overdrachtspuffer. Roer vervolgens gedurende vijf minuten voorzichtig met de membraan.
Verwijder de veiligheidskap van het semi-droge elektroforesetoestel. Bevochtig een filterpapier. En bereid een gelsandwich voor op de bodem van de platina-anode.
Nadat de kathodeplaat in de veiligheidskap is vastgezet, draai de blot gedurende 90 minuten op een constante stroom van 15 volt. Schakel vervolgens de voeding uit en verwijder de PVDF-membraan na het ontkoppelen van het semi-droge apparaat. Blokkeer nu de PVDF-membraan gedurende een uur op kamertemperatuur met blokkeringspuffer op een orbitale shaker met 30 omwentelingen per minuut.
Hybridiseer vervolgens de PVDF-membraan met anti-p53-antilichaam en blokkeringspuffer gedurende 12 tot 16 uur bij vier graden Celsius op een suspensiemixer met 30 omwentelingen per minuut. Verwijder vervolgens de PVDF-membraan en breng het over in een container gevuld met Tris-gebufferde zout-Tween 20. Dompel vervolgens de PVDF-membraan gedurende 30 minuten in Tris-gebufferde zout-Tween 20 op de orbitale shaker met 45 omwentelingen per minuut.
Hybridiseer vervolgens de PVDF-membraan met anti-konijnantilichaam geconjugeerd met paardenradenzym gediluteerd in blokkeringspuffer gedurende een uur op kamertemperatuur op de suspensiemixer met 30 omwentelingen per minuut. Was vervolgens de PVDF-membraan driemaal met Tris-gebufferde zout-Tween 20. Na het wassen, dompel de PVDF-membraan gedurende 30 minuten in Tris-gebufferde zout-Tween 20 op de suspensiemixer met 45 omwentelingen per minuut.
Vervang vervolgens de Tris-gebufferde zout-Tween 20 met fosfaatgebufferde zoutoplossing. Om de PVDF-membraan bij vier graden Celsius gedurende maximaal 12 uur te bewaren. Meng vervolgens de verbeterde chemiluminescente substraatreagentia één en twee in een verhouding van één op één.
Verwijder vervolgens de PVDF-membraan uit de fosfaatgebufferde zoutoplossing en demp kort met de punchpockets om de overtollige vocht
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een aangepast in vitro SUMOylatieprotocol dat is ontworpen om nieuwe SUMO E3-ligasen te identificeren. De methode maakt het mogelijk om de specificiteit van SUMO E3-ligasen ten opzichte van verschillende SUMO-isovormen te onderzoeken.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Biochemie
- Eiwitmodificatie
Achtergrond
- SUMOylering is een posttranslationeel modificatieproces.
- Er zijn weinig E3 SUMO-ligasen geïdentificeerd in vergelijking met ubiquitine-ligasen.
- De identificatie van SUMO E3-ligasen is cruciaal voor het begrijpen van hun biologische rollen.
- Deze studie heeft tot doel de identificatiemethoden voor deze ligasen te verbeteren.
Doel van de studie
- Om eiwitten te verifiëren die gesumoyleerd kunnen worden of fungeren als SUMO E3-ligasen.
- Om kernvragen binnen het vakgebied van sumoylering te beantwoorden.
- Om een methode te ontwikkelen voor het identificeren van SUMO E3-ligasen.
Gebruikte methoden
- In vitro reconstitutie-assay voor SUMOylering.
- Zuivering van het tag K-bZIP met behulp van antilichaam-gekoppelde magnetische beads.
- Incubatie van cellulair lysaat met magnetische beads.
- Rotatie van de buis in een suspensiemenger bij een lage temperatuur.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle identificatie van nieuwe SUMO E3 ligases.
- Demonstratie van de effectiviteit van het protocol in een laboratoriumsetting.
- Inzichten in de specificiteit van SUMO E3 ligases voor SUMO-isoformen.
- Potentiële toepassingen in verder SUMOylatie-onderzoek.
Conclusies
- Het aangepaste protocol is een waardevol instrument voor de identificatie van SUMO E3-ligasen.
- Het opent nieuwe wegen voor toekomstig onderzoek naar SUMOylatiemechanismen.
- Verdere studies kunnen uitbreiden op de specificiteit van SUMO E3-ligasen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Het identificeren van SUMO E3-ligasen en hun isoform-specificiteit is cruciaal voor het verminderen van risico's bij de validatie van targets in de vroege ontdekkingsfase. Deze in vitro reconstitutie-assay maakt mechanistische analyse van SUMO-afhankelijke signaleringspaden mogelijk, wat bijdraagt aan de voorspellende betrouwbaarheid bij het testen van therapeutische hypothesen. De methode biedt een schaalbare, gestandaardiseerde aanpak voor het evalueren van E3-ligase-activiteit, wat direct input levert voor de identificatie van lead-verbindingen en beslissingen over portfoliotriage.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar de functie en substraatspecificiteit van SUMO E3-ligasen mogelijk om ziekterelevante signaleringsmechanismen te verduidelijken.
- Operationele waarde: Biedt een gereconstitueerd systeem om vermeende E3-ligasen te valideren met behulp van gezuiverde componenten, waardoor fout-positieven door cellulaire complexiteit worden verminderd.
- Predictieve waarde: Ondersteunt het minimaliseren van risico's bij target-selectie door directe enzymatische activiteit aan te tonen op bekende substraten zoals p53 onder gedefinieerde omstandigheden.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve resultaten van SUMO-conjugatie over SUMO-paralogen (SUMO1/2/3) om de voorkeur voor ligase-isovormen te profileren.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van gestandaardiseerde reactiecondities en controles (E1, Ubc9-titratie) om reproduceerbaarheid tussen laboratoria en screeningscampagnes te waarborgen.
- Schaalbaarheidswaarde: Compatibel met 96-wells formaten voor evaluatie van ligase-bibliotheken of mutante varianten met een gemiddelde doorvoersnelheid.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Koppel SUMO E3-ligaseactiviteit aan functionele uitkomsten in ziektemodellen door de modificatie van pathofysiologische substraten te valideren.
- Operationele waarde: Maakt structuur-functieanalyse van ligasedomeinen mogelijk via structuurgestuurde mutagenese gekoppeld aan activiteitsmetingen.
- Translationele waarde: Ondersteunt de ontwikkeling van biomarkers door de SUMOyleringstatus van targets in preklinische systemen te bevestigen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De assay past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot leadoptimalisatie en biedt een orthogonale biochemische bevestiging van het mechanisme voorafgaand aan cellulaire of fenotypische screening.
- Ontdekkingsbiologie: Test therapeutische hypothesen door directe modulatie van SUMOylering op oncogene of neurodegeneratieve doelen te bevestigen.
- Screening: Levert kwantitatieve, enzymafhankelijke readouts die geschikt zijn voor hit-bevestiging in screens voor E3-ligase-modulatoren.
- Analytica: Meet de vorming van SUMO-conjugaten via immunoblot, waardoor vergelijking van ligase-potentie en isoform-selectiviteit mogelijk wordt.
- Translationeel Onderzoek: Valideert target-engagement in ziekterelateerde contexten door SUMOylering van klinisch relevante substraten aan te tonen.
- Hergebruik binnen de organisatie: Vestigt een herbruikbaar platform voor het karakteriseren van SUMO E3-ligases over meerdere projecten en doelwitklassen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit bij de modulatie van de SUMO-route, waardoor het vertrouwen in de selectie van targets toeneemt.
- Operationele waarde: Standardiseert de beoordeling van de E3-ligase-activiteit, wat de reproduceerbaarheid tussen laboratoria en de vergelijkbaarheid van gegevens verbetert.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen door direct bewijs te leveren van de compatibiliteit tussen ligase en substraat, waardoor uitval in een laat stadium wordt verminderd.
- Impact op de portfolio: Maakt risicogecorrigeerde prioritering van SUMO-gerichte programma's mogelijk op basis van gevalideerde mechanistische gegevens.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in eiwitzuivering, enzymkinetiek en immunoblot-detectie.
- Afhankelijk van de toegang tot gezuiverde SUMO-isoformen, E1/E2-enzymen en substraateiwitten.
- Vereist gestandaardiseerde reactiebuffers en temperatuurcontroles voor consistente activiteitsmetingen.
- Omvat optimalisatie van enzym- en substraatconcentraties om aspecifieke signalen te voorkomen.
- Beperkt tot in vitro activiteit; cellulaire context en regulatiemechanismen vereisen complementaire validatie.
