Name: In Vitro SUMOylation Assay te studeren SUMO E3 Ligase activiteit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Leer een gemodificeerde in vitro SUMOylatie-methode om nieuwe SUMO E3 ligases te identificeren en hun specificiteit voor verschillende SUMO isoformen te onderzoeken. Dit protocol is waardevol voor biochemisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door subsidies van het ministerie van wetenschap en technologie (meeste, 105-2320-B-010-007-MY3 naar PCC), van de National Health Research Institute (NHRI-EX105-10215BC naar PCC), van het ministerie van wetenschap en technologie (meest 105-2314-B-400-019 naar HJK) en van de National Health Research Institute (NHRI MG-105-SP-10, NHRI MG-106-SP-10 tot HJK). Dit werk werd ook ondersteund deels met de nationale universiteit van de Yang-Ming op PCC publicatie manuscript. De financiers had geen rol in de studie ontwerp, gegevensverzameling en analyse, besloten tot bekendmaking van of reparatie van het manuscript.

1. bereiding van Baculovirus expressie constructies
<ol><li>
SUMO E3 ligase K-bZIP zuiveren door de cDNA van K-bZIP19 klonen in een dual expressie baculovirus vector (zie tabel van materialen) met een N-terminal epitoop-tag. We hebben succes met behulp van een octapeptide-tag (aangegeven in het gehele protocol als vector-label-K-bZIP). Opmerking: De DNA-sjabloon voor het klonen van K-bZIP polymerase kettingreactie (PCR) is cDNA omgekeerde transcriptie van RNA geïsoleerd uit TREx F3H3-K-Rta BCBL-1 cellen na doxycycline behandeling20.<ol>
<li>Breng de full-length K-bZIP cDNA19 in de dubbele expressie vector met Cpoik klonen van sites. CPO Ik verteren het PCR product en 1 µg van de vector dual expressie bij 37 ° C gedurende 3 h21.</li>
		<li>Scheiden en haal het verteerd DNA elektroforese aanleiding een 0,8% agarose gel22. Afbinden van de insert (K-bZIP) en vector door T4 DNA ligase bij 16 ° C gedurende 30 minuten volgens de instructies van de fabrikant (Zie Tabel van materialen).</li>
		<li>Voeg 5 µL van afbinding van DNA tot 50 µL bevoegde E. coli cellen "A" (Zie Tabel van materialen) in een 1,5 mL-buis. Zet op het ijs gedurende 30 minuten. Vervolgens, Incubeer de 1,5 mL-buis in een waterbad van 42 ° C voor 45 s en onmiddellijk de buis op ijs gedurende 3 minuten.</li>
		<li>600 µL S.O.C. medium (0,5% (w/v) gistextract, 2% (g/v) trypton 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 20 mM MgSO4en 4% (m/v) glucose) toevoegen in de buis en Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur. Centrifugeer vervolgens de buis bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten op 600 x g.</li>
		<li>Verwijder de bovendrijvende substantie, resuspendeer de pellet met 60 µL Luria Bertani medium (LB; 1% (m/v) trypton, 0,5% (w/v) gist extract, en 85 mM NaCl) en verspreid op LB agar platen met 100 µg/mL ampicilline. Incubeer de agarplaat bij 37 ° C gedurende 16 h23,24.</li>
		<li>Selecteer 1 kolonie om te enten in 5 mL LB opslagmedium met 100 µg/mL ampicilline en cultuur bij 37 ° C gedurende 16 h met 250 t/min schudden. Dan, het uitpakken van de plasmide, vector-label-K-bZIP, door een plasmide extractie kit volgens de instructies van de fabrikant (Zie Tabel van materialen).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Genereren van de recombinante bacmid herbergen van de tag-K-bZIP door omzetting van de vector-label-K-bZIP in bevoegde E. coli cellen "B" (zie tabel van materialen).
	<ol>
<li>Meng 0,2 µg vector-label-K-bZIP plasmide en 100 µL bevoegde E. coli cellen "B" in een tube 1,5 mL en put op ijs voor 30 min. Incubeer de buis in 42 ° C waterbad voor 45 s en onmiddellijk de buis op ijs gedurende 3 minuten.</li>
		<li>Voeg 900 µL van S.O.C. medium in de buis en Incubeer bij 37 ° C gedurende 4 uur met rotatie op 50 rpm. Vervolgens nemen 10 µL van het medium, voeg een extra 50 µL van S.O.C medium verspreid over LB agar platen met 50 µg Mo/mL kanamycine, 7 µg/mL gentamicine, 10 µg/mL tetracycline, 100 µg/mL galactosidase substraat en 40 µg/mL isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG ), en Incubeer de platen gedurende 48 uur bij 37 ° C.</li>
		<li>Inoculeer één witte kolonie in 5 mL LB opslagmedium met 50 µg Mo/mL kanamycine, 7 µg/mL gentamicine en 10 µg Fe/mL tetracycline. Incubeer bij 37 ° C met 250 t/min schudden voor 16 h.</li>
		<li>Isoleren van de recombinante bacmid DNA herbergen van de tag-K-bZIP, kwantificeren en resuspendeer bij een concentratie van 1 µg/µL25.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Genereren van recombinante baculoviruses tag-K-bZIP uitdrukken door transfecting 1 µg van recombinante bacmid DNA met label-K-bZIP in Sf9 cellen in één putje van de plaat van een 6-well.
	<ol>
<li>Zaad 2 x 106 Sf9 cellen (Zie Tabel van materialen) in 2 mL Grace Insect Medium geleverd met 10% foetale runderserum (FBS) en 1% gentamicine in elk Nou van een 6 goed plaat, dan Incubeer bij 27 ° C gedurende 1 uur.</li>
		<li>Onderhouden van een logboek fase cultuur van Sf9 cellen in Grace Insect Medium geleverd met 10% FBS, gentamicine van 1% en 1% wasmiddel C (Zie Tabel van materialen) bij 27 ° C in orbitale schorsing bij 140 omwentelingen per minuut. Cellen met een hemocytometer en een trypan blauw kleuring; tellen levensvatbaarheid van de cellen groter is dan 95%. Handhaven van cellen met behulp van een subcultivation-verhouding van 1:3 elke 2-3 dagen (minimale dichtheid ~0.5 x 106 cellen/mL).</li>
		<li>Voeg 2 µL bacmid DNA (1 µg/µL) en 98 µL verminderd serum media (Zie Tabel van materialen) in een tube van 2 mL. Voeg vervolgens 4 µL transfectiereagens (Zie Tabel van materialen) om de buis en meng goed. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.</li>
		<li>Voeg dit mengsel van transfectie (104 µL) in elk putje en Incubeer bij 27 ° C voor 12-16 h.</li>
		<li>Uitgeput media met behoedzame aspiratie verwijderen en vervangen door 2 mL verse Grace Insect voedingsbodem geleverd met 10% FBS en 1% gentamicine. De Sf9 cellen houden losjes aan het oppervlak van de plaat en zullen niet worden gestoord met behoedzame aspiratie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Verzamelen van recombinante baculovirus na transfectie en versterken baculovirus om te verkrijgen van hoge-titer voorraden (P1) voor verdere experimenten.
	<ol>
<li>72 uur na het wijzigen van medium, schraap de Sf9 cellen met behulp van een steriele cel lifter, verzamelen het supernatant van elk individuele putje in een tube 1,5 mL en vortex voor 10 s.</li>
		<li>Centrifugeer bij 4 ° C gedurende 3 minuten op 150 x g. verzamelen bovendrijvende substantie als P0 baculovirus en aliquot in 1,5 mL buisjes (1 mL baculovirus in elke buis). Winkel bij-80 ° C.</li>
		<li>Zaad 1 x 107 Sf9 cellen in 10 mL Grace Insect Medium geleverd met 10% FBS en 1% gentamicine in een 10 cm petrischaal en Incubeer bij 27 ° C gedurende 1 uur.</li>
		<li>Voor versterking van recombinante baculoviruses waarin tag-K-bZIP, Voeg 0,5 mL P0 baculovirus aan de geplaatste Sf9 cellen en Incubeer bij 27 ° C gedurende 48 uur.</li>
		<li>Verzamelen bovendrijvende substantie als P1 baculovirus in een tube van 15 mL en de winkel bij 4 ° C voor maximaal 1 maand.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. de zuivering van K-bZIP
<ol><li>Onderhouden van een logboek fase cultuur van Sf9 cellen in Grace Insect Medium geleverd met 10% FBS, gentamicine van 1% en 1% wasmiddel C bij 27 ° C in orbitale schorsing bij 140 omwentelingen per minuut, zoals beschreven in stap 1.3.2.</li>
	<li>Op de dag van signaaltransductie, voeg 1 mL baculovirus-bevattende supernatant (P1) in 250 mL van Sf9 cellen met een bevolkingsdichtheid van 2 x 106 cellen/mL.</li>
	<li>Incubeer Sf9 cellen gedurende 72 uur bij 27 ° C op een roteerschudapparaat met 140 t/min schudden, dan verzamelen door centrifugeren bij 2,740 x g gedurende 15 min bij 4 ° C.</li>
	<li>Verwijder de bovendrijvende vloeistof en lyse cel pellets in 10 mL lysis-buffermengsel (20 mM HEPES pH 7,9, 0.5 M NaCl, 1% wasmiddel proteaseinhibitor cocktail van een (Zie Tabel van materialen), 2% glycerol) en bij 50 rpm met behulp van een schorsing mixer bij 4 ° C gedurende 30 minuten draaien.</li>
	<li>Centrifuge cel lysate bij 15.000 x g gedurende 15 min voor het verzamelen van de bovendrijvende substantie.</li>
	<li>Om te zuiveren tag-K-bZIP, Incubeer de cel lysates (10 mL) met 50 µL van antilichaam-gelabeld magnetische kralen in polypropyleen tubes van 14 mL en draaien op 50 rpm gedurende 3 uur bij 4 ° C met behulp van een schorsing mixer. De kralen bij 800 x g centrifugeren voor 30 na eiwit opname, pellet s bij 4 ° C. Allermeest naar de bovendrijvende vloeistof verwijderen en resuspendeer de kralen in het restvolume voor ongeveer 1 mL overbrengen in een tube 1,5 mL voor wassen.</li>
	<li>Wassen van het geslagen eiwit door het plaatsen van de buis met de kralen op een magnetische standaard en verwijder het supernatant zodra de magnetische kralen hebben volledig gekleefd aan de kant van de buis.</li>
	<li>
Wassen van de kralen met lysis-buffermengsel viermaal.
	<ol>
<li>Voeg 1 mL lysis-buffermengsel in 1,5 mL buizen en omkeren van de buizen 10 keer. Plaats de buis 1,5 mL op een magnetische standaard en verwijder de bovendrijvende substantie zoals beschreven in punt 2.7.</li>
		<li>Herhaal de vorige stap 3 een andere keer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
De kralen met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) keer wassen.
	<ol>
<li>Voeg 1 mL PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.5 mM KH2PO4) in 1,5 mL buizen, en de buizen 10 keer omkeren.</li>
		<li>Zet de tube 1,5 mL op een magnetische standaard en verwijder de bovendrijvende substantie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Elueer tag-K-bZIP eiwit uit de antilichaam-gelabeld magnetische kralen door toevoeging van 100 µL van 150 µg/mL octapeptide in PBS is verdund in een 1,5 mL-buis. De buis gedurende 10 minuten bij 50 t/min draaien door schorsing mixer bij kamertemperatuur. Vervolgens plaatst u de buis terug op de magnetische stand en verzamelen van het K-bZIP-bevattende supernatant in een schone 1,5 mL-buis.</li>
	<li>1-5 µL gezuiverd tag-K-bZIP proteïne door SDS-PAGE gevolgd door Coomassie blue kleuring26analyseren. Laden 2 µg, 1 µg en 0,5 µg monsters van bovien serumalbumine (BSA) op het zelfde gel en gebruiken voor kwantificering met een beeld processing programma, zoals ImageJ. Schatten van de K-bZIP concentratie door vergelijking aan de normen van de BSA.</li>
	<li>De gezuiverde K-bZIP is nu klaar om te worden gebruikt in de assay van elke SUMOylation. Verdun de K-bZIP in PBS tot een eindconcentratie van 100 ng/µL en winkel in kleine porties bij-80 ° C.</li>
</ol>3. SUMOylation test
<ol><li>Voeg 3 µL van 100 ng/µL van gezuiverde tag-K-bZIP in de master mix van elke in vitro SUMOylation reactie. Componenten in master mix bevatten 1 µL eiwit buffer, 1 x SUMOylation buffer, 0,5 µL p53 proteÃ¯ne (0,5 mg/mL), 25 nM E1 activeren enzym (voorraad conc.: 1 µM), 50 nM van E2 conjugating enzym (voorraad conc.: 10 µM), en 250 nM, elk van de SUMO peptiden (SUMO-1 , SUMO-2 of SUMO-3; voorraad conc.: 5 µM) tot een eindvolume van 17 µL.</li>
	<li>Meng de inhoud zachtjes en Incubeer de reactie bij 30 ° C voor 3 h. Zet de reactie Stop door toevoegen van 20 µL van 2 x SDS-pagina laden buffer (100 mM Tris-HCL, pH 6.8, 4% natrium dodecyl sulfaat, 0,2% (m/v) bromophenol blauw, 20% (v/v) van glycerol en 200 mM β-mercaptoethanol) en Het denatureren van de monsters bij 95 ° C gedurende 5 min.</li>
	<li>
Afzonderlijke monsters op SDS-pagina de gescheiden eiwitten op Membraan PVDF overbrengen met behulp van een semi-droge elektroforetische overdracht apparaat en analyseren door westelijke vlek met behulp van anti-p53 antilichaam.
	<ol>
<li>Instellen van het apparaat van de gel zoals in stap 2.11, en laadt 20 µL van monster in gel wells.</li>
		<li>De 10% gel worden uitgevoerd in een constante stroom bij 80 V voor ongeveer 120 minuten (totdat de kleurstof band de onderkant van de gel bereikt). Na voltooiing van elektroforese, uitschakelen naar de voeding.</li>
		<li>Koppel de gel toestellen en gel cassettes te nemen uit de gel en de gel in semi-droge overdracht buffer (48 mM Tris-HCl, 39 mM glycine, 20% methanol) voor 5 min zweven.</li>
		<li>Neem een andere container en geniet van het membraan PVDF in methanol voor 1 min. Vervolgens neemt van PVDF uit methanol en zet in semi-droge overdracht buffer. Zachtjes doorroeren het membraan gedurende 5 minuten.</li>
		<li>Verwijder het klepje van de veiligheid van het semi-droge elektroforetische apparaat.</li>
		<li>Vooraf NAT filtreerpapier, en bereiden een sandwich van de gel op de bodem platina anode als volgt: filtreerpapier, PVDF membraan, gel en filtreerpapier.</li>
		<li>Veilige kathode plaat en veiligheid cover, voer vlek op 15 V constante huidige voor 90 min. beurt uit de voeding, semi-droge apparaat en nemen het membraan PVDF.</li>
		<li>Blok PVDF membraan met een blokkeerbuffer (5% non-fat melk in buffer TBST (137 mM NaCl2, 20 mM Tris-HCl, 0,1% wasmiddel B (Zie Tabel of Materials), pH 7,6)) bij kamertemperatuur gedurende 1 uur met 30 rpm schudden door rondschudapparaat.</li>
		<li>Kruisen het membraan PVDF met anti-p53 antilichaam verdund (1:1, 000) in blokkeerbuffer gedurende 12-16 uur bij 4 ° C met 30 rpm schudden met behulp van een schorsing mixer.</li>
		<li>Neem het membraan PVDF in een container en zet in TBST. Spoel PVDF membraan met TBST tweemaal meer.</li>
		<li>Geniet van het membraan PVDF in TBST voor 30 min met 45 rpm schudden door rondschudapparaat.</li>
		<li>Kruisen het membraan PVDF met anti-konijn antilichaam geconjugeerd met mierikswortelperoxidase (HRP) verdund (1:4, 000) in blokkeerbuffer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met 30 rpm schudden met behulp van een schorsing mixer.</li>
		<li>Het wassen van het membraan PVDF met TBST 3 keer zoals beschreven in stap 3.4.10.</li>
		<li>Geniet van het membraan PVDF in TBST voor 30 min met 45 rpm schudden met behulp van een schorsing mixer. Verwijder van TBST en voeg PBS voor het behoud van het membraan PVDF bij 4 ° C voor maximaal 12 h.</li>
		<li>Meng het reagens Verbeterde Chemiluminescentie substraat (ECL substraat) 1 en 2 (1:1) (Zie Tabel van materialen). Verwijder het membraan PVDF uit de PBS, blot kort met een papieren handdoek of lichte wisser overtollig vocht te absorberen, en onmiddellijk toevoegen 400 µL van ECL reagens op het oppervlak van elke membraan voor 3-5 min. verwijderen overtollige ECL reagens door kort bevlekken, maar laat niet de m embrane tot volledig droog.</li>
		<li>De vlek met een luminescentie imaging systeem of autoradiografie film27bloot.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Bies, J., Markus, J., Wolff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+attachment+of+the+SUMO-1+protein+to+the+negative+regulatory+domain+of+the+c-Myb+transcription+factor+modifies+its+stability+and+transactivation+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Covalent attachment of the SUMO-1 protein to the negative regulatory domain of the c-Myb transcription factor modifies its stability and transactivation capacity.</a> J Biol Chem. 277 (11), 8999-9009 (2002).</li>
<li>Lin, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+SUMO-interacting+motif+in+Daxx+SUMO+modification%2C+subnuclear+localization%2C+and+repression+of+sumoylated+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Role of SUMO-interacting motif in Daxx SUMO modification, subnuclear localization, and repression of sumoylated transcription factors.</a> Mol Cell. 24 (3), 341-354 (2006).</li>
<li>Welsh, M., Jamalpour, M., Zang, G., Akerblom, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+Src+Homology-2+domain+containing+protein+B+%28SHB%29+in+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The role of the Src Homology-2 domain containing protein B (SHB) in beta cells.</a> J Mol Endocrinol. 56 (1), 21-31 (2016).</li>
<li>Huang, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+function%2C+and+pathogenesis+of+SHP2+in+developmental+disorders+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Cancer+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Structure, function, and pathogenesis of SHP2 in developmental disorders and tumorigenesis.</a> Curr Cancer Drug Targets. 14 (6), 567-588 (2014).</li>
<li>Perry, J. J., Tainer, J. A., Boddy, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+SIM-ultaneous+role+for+SUMO+and+ubiquitin%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">A SIM-ultaneous role for SUMO and ubiquitin.</a> Trends Biochem Sci. 33 (5), 201-208 (2008).</li>
<li>Sun, H., Leverson, J. D., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+function+of+RNF4+family+proteins+in+eukaryotes%3A+targeting+a+ubiquitin+ligase+to+SUMOylated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Conserved function of RNF4 family proteins in eukaryotes: targeting a ubiquitin ligase to SUMOylated proteins.</a> EMBO J. 26 (18), 4102-4112 (2007).</li>
<li>Ouyang, J., Shi, Y., Valin, A., Xuan, Y., Gill, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+binding+of+CoREST1+to+SUMO-2%2F3+contributes+to+gene-specific+repression+by+the+LSD1%2FCoREST1%2FHDAC+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct binding of CoREST1 to SUMO-2/3 contributes to gene-specific repression by the LSD1/CoREST1/HDAC complex.</a> Mol Cell. 34 (2), 145-154 (2009).</li>
<li>Lyst, M. J., Stancheva, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+SUMO+modification+in+transcriptional+repression+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">A role for SUMO modification in transcriptional repression and activation.</a> Biochem Soc Trans. 35, Pt 6 1389-1392 (2007).</li>
<li>Liu, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modification+by+SUMO-1+stimulates+the+promoters+of+translation+machinery+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Chromatin modification by SUMO-1 stimulates the promoters of translation machinery genes.</a> Nucleic Acids Res. 40 (20), 10172-10186 (2012).</li>
<li>Rosonina, E., Duncan, S. M., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO+functions+in+constitutive+transcription+and+during+activation+of+inducible+genes+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">SUMO functions in constitutive transcription and during activation of inducible genes in yeast.</a> Genes Dev. 24 (12), 1242-1252 (2010).</li>
<li>Chang, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chromatin+modification+by+SUMO-2%2F3+but+not+SUMO-1+prevents+the+epigenetic+activation+of+key+immune-related+genes+during+Kaposi%27s+sarcoma+associated+herpesvirus+reactivation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">The chromatin modification by SUMO-2/3 but not SUMO-1 prevents the epigenetic activation of key immune-related genes during Kaposi's sarcoma associated herpesvirus reactivation.</a> BMC Genomics. 14, 824(2013).</li>
<li>Neyret-Kahn, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sumoylation+at+chromatin+governs+coordinated+repression+of+a+transcriptional+program+essential+for+cell+growth+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Sumoylation at chromatin governs coordinated repression of a transcriptional program essential for cell growth and proliferation.</a> Genome Res. 23 (10), 1563-1579 (2013).</li>
<li>Tatham, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+chains+of+SUMO-2+and+SUMO-3+are+conjugated+to+protein+substrates+by+SAE1%2FSAE2+and+Ubc9%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Polymeric chains of SUMO-2 and SUMO-3 are conjugated to protein substrates by SAE1/SAE2 and Ubc9.</a> J Biol Chem. 276 (38), 35368-35374 (2001).</li>
<li>Mattoscio, D., Segre, C. V., Chiocca, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+manipulation+of+cellular+protein+conjugation+pathways%3A+The+SUMO+lesson%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Virol%22%5BJournal%5D)">Viral manipulation of cellular protein conjugation pathways: The SUMO lesson.</a> World J Virol. 2 (2), 79-90 (2013).</li>
<li>Gareau, J. R., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SUMO+pathway%3A+emerging+mechanisms+that+shape+specificity%2C+conjugation+and+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The SUMO pathway: emerging mechanisms that shape specificity, conjugation and recognition.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 861-871 (2010).</li>
<li>Bernier-Villamor, V., Sampson, D. A., Matunis, M. J., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+E2-mediated+SUMO+conjugation+revealed+by+a+complex+between+ubiquitin-conjugating+enzyme+Ubc9+and+RanGAP1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAP1.</a> Cell. 108 (3), 345-356 (2002).</li>
<li>Knipscheer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubc9+sumoylation+regulates+SUMO+target+discrimination%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Ubc9 sumoylation regulates SUMO target discrimination.</a> Mol Cell. 31 (3), 371-382 (2008).</li>
<li>Vethantham, V., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+sumoylation+of+recombinant+proteins+and+subsequent+purification+for+use+in+enzymatic+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro sumoylation of recombinant proteins and subsequent purification for use in enzymatic assays.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2009 (1), 5121(2009).</li>
<li>Lin, S. F., Robinson, D. R., Miller, G., Kung, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus+encodes+a+bZIP+protein+with+homology+to+BZLF1+of+Epstein-Barr+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus encodes a bZIP protein with homology to BZLF1 of Epstein-Barr virus.</a> J Virol. 73 (3), 1909-1917 (1999).</li>
<li>Yang, W. S., Hsu, H. W., Campbell, M., Cheng, C. Y., Chang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((K-bZIP+Mediated+SUMO-2%2F3+Specific+Modification+on+the+KSHV+Genome+Negatively+Regulates+Lytic+Gene+Expression+and+Viral+Reactivation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">K-bZIP Mediated SUMO-2/3 Specific Modification on the KSHV Genome Negatively Regulates Lytic Gene Expression and Viral Reactivation.</a> PLoS Pathog. 11 (7), 1005051(2015).</li>
<li>Connor, C. D., Metcalf, E., Wrighton, C. J., Harris, T. J., Saunders, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RsrII--a+novel+restriction+endonuclease+with+a+heptanucleotide+recognition+site%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">RsrII--a novel restriction endonuclease with a heptanucleotide recognition site.</a> Nucleic Acids Res. 12 (17), 6701-6708 (1984).</li>
<li>Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+endonuclease+R-EcoRI+fragments+of+DNA+from+lambdoid+bacteriophages+and+other+viruses+by+agarose-gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Analysis of endonuclease R-EcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis.</a> J Virol. 14 (5), 1235-1244 (1974).</li>
<li>Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+physiology+in+Luria-Bertani+broth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth.</a> J Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).</li>
<li>Gingold, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Bacterial transformation.</a> Methods Mol Biol. 2, 237-240 (1985).</li>
<li>Brulois, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+manipulation+of+a+new+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus+bacterial+artificial+chromosome+clone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Construction and manipulation of a new Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone.</a> J Virol. 86 (18), 9708-9720 (2012).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Ahmed, S., Holt, M., Riedel, D., Jahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-scale+isolation+of+synaptic+vesicles+from+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Small-scale isolation of synaptic vesicles from mammalian brain.</a> Nat Protoc. 8 (5), 998-1009 (2013).</li>
</ol>

De auteurs vermelden geen potentiële belangenconflicten.

De in vitro SUMOylation protocol hier beschreven is routinematig gebruikt om de status van de SUMOylation van geïdentificeerde Ubc9 substraten. De belangrijkste beperking met behulp van het standaardprotocol te bestuderen van de SUMOylation functie van SUMO E3 ligase is de overvloed van het activeren van de SUMO E1 en E2 conjugating enzymen Ubc9 die maximaliseren van de SUMO vervoeging in in vitro -systemen. Gezien deze uitdaging, wij zijn van mening dat titratie van het bedrag van SUMO E1 en E2 enzymen...

SUMO wijziging werd aanvankelijk geïdentificeerd als een omkeerbare posttranslationele modificatie (PTM) die proteïne stabiliteit1regelt. Naast directe conjugatie, kan SUMO ook worden verbonden aan een proteïne door niet-covalente interactie SUMO interactie motieven (SIMs)2. Vergelijkbaar met de binding van tyrosyl-fosforylering door moleculen herbergen Src homologie 2 (SH2) of phosphotyrosine binding (PTB) domeinen3,4, SUMO wijziging biedt een extra interactie platform voor selectieve aanwerving van SIM-bevattende effector eiwitten5,6. Naast regelgeving van signaaltransductie, SUMOylation van transcriptionele factoren en chromatine remodeling moleculen dienen te moduleren van gen expressie7,8. Studies van genoom-brede SUMOylation patronen is gebleken dat SUMO wijziging geassocieerd met positieve9,10 of negatieve10,11,12 transcriptie wordt verordening, deels wegens de specificiteit van de paralogue van SUMOylation.
Er zijn drie belangrijke SUMO isoforms voor proteïne conjugating van dit moment in de cellen van zoogdieren; het gaat hierbij om SUMO-1, en de zeer homologe SUMO-2 en SUMO-3 (hierna: SUMO-2/3)13. SUMO is meestal geconjugeerd aan het residu lysine (K) binnen het motief van de ψKxD/E consensus in het doel-eiwit. De SIM-kaart in SUMO E3 ligases is verantwoordelijk voor de paralogue specificiteit14. In tegenstelling tot ubiquitination trajecten met honderden E3 ligases, er alleen geweest een paar SUMO E3 ligases geïdentificeerd15. SUMO E3 ligases worden gedefinieerd door eigenschappen met inbegrip van hun vermogen om (i) Ubc9 binden, (ii) binden SUMO deel daarvan via een SIM-domein, en (iii) het verbeteren van SUMO overdracht van Ubc9 op substraat. Ligase E3 is niet absoluut vereist voor SUMO vervoeging16, maar biedt substraat en SUMO-paralogue specificiteit. Sinds meestal slechts een klein deel van de totale substraat proteïne SUMO-bewerkt is, is detectie van SUMOylated eiwitten in vivo altijd een uitdaging. Daarom, nauwkeurige en reproduceerbare testen nodig zijn om te verhelderen van de precieze functie van SUMO modificatie.
De in vitro SUMOylation assay, die resulteert in het vermogen van gezuiverde Ubc9 om SUMOylation van substraat eiwitten katalyseren, is een goed aanvaard assay voor het studeren SUMO wijziging17. Echter, SUMO E3 ligase activiteit in de meeste gevallen kan niet worden gedetecteerd of kan alleen worden gedetecteerd met gemuteerde SUMO ligase met SUMO E3 ligase hoogactieve en lage substraat specificiteit door het standaardprotocol vanwege de aanwezigheid van een overvloedige hoeveelheid Ubc918 . Het algehele succes van deze bepaling is grotendeels afhankelijk van de zorgvuldige titratie van gezuiverde Ubc9. De in vitro SUMOylation assay hier beschreven is aangepast ten opzichte van een standaard SUMOylation protocol (Zie Tabel van materialen). De waarneming van de toegenomen wereldwijde SUMO wijziging tijdens Kaposisarcoom-geassocieerde herpesvirus (KSHV) reactivering gevraagd ons te identificeren van de virale SUMO E3-ligase dat verantwoordelijk voor de up-regulatie van SUMOylation zijn kan. Naar aanleiding van een kleinschalige screening van de interacterende eiwitten van virale SUMO E3 ligase K-bZIP, p53 werd geïdentificeerd als een roman substraat. In dit protocol tonen we in detail in insect cellen de stappen bij de expressie en de zuivering van wild-type K-bZIP, een virale SUMO E3 ligase met SUMO-2/3 specificiteit betrokken. Het vermogen van de gezuiverde K-bZIP ter verbetering van de SUMOylation van p53, een bekende SUMO substraat, wordt in aanwezigheid van verlaagde bedragen van E1 en E2 enzymen geëvalueerd. Deze gewijzigde SUMOylation assay kunnen, onderzoekers betrouwbaar definieert de capaciteiten van SUMO E3 ligase SUMOylate roman of bekende substraten, dat is een eerste stap in de studie van eiwit SUMOylation. Bovendien, deze methode helpt identificeren roman SUMO E3 ligases met lage ligase activiteit maar hoge substraat specificiteit.

<table><tbody><tr><td>pFastBac</td><td>Invitrogen</td><td>10359-016</td><td>dual expression baculovirus vector</td></tr><tr><td>pCR2.1-TOPO vector</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>PCR product vector</td></tr><tr><td>competent cell&nbsp; E. coli DH5&alpha;</td><td>Yeastern Biotech</td><td>FYE678-80VL</td><td>competent E. coli cells A</td></tr><tr><td>E. coli DH10Bac</td><td>Invitrogen</td><td>10359-016</td><td>competent E. coli cells B</td></tr><tr><td>FugeneHD</td><td>Roche</td><td>04709705001</td><td>transfection reagent</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985062</td><td>reduced serum media</td></tr><tr><td>T4 Ligase</td><td>NEW England BioLabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>CpoI (RsrII)</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER0741</td><td></td></tr><tr><td>Bluo-gal</td><td>Thermo Scientific</td><td>B1690</td><td>galactosidase substrate</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758-1G</td><td></td></tr><tr><td>Grace&rsquo;s Insect Medium</td><td>Gibco</td><td>11605094</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Thermo Fisher</td><td>15750060</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9393-25G</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K0254-20ML</td><td></td></tr><tr><td>gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>tetracyclin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>87128-25G</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth</td><td>Merk</td><td>1.10285.0500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-5KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merk</td><td>1.04936.1000</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136-500G</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>J.T.Baker</td><td>3246-01</td><td></td></tr><tr><td>sodium dodecyl sulfate</td><td>Merk</td><td>1.13760.1000</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0710</td><td></td></tr><tr><td>TRIS (Base)</td><td>J.T.Baker</td><td>4109-06</td><td></td></tr><tr><td>Non-fat milk</td><td>Fonterra</td><td></td><td></td></tr><tr><td>glycerol</td><td>J.T.Baker</td><td>2136-01</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Amresco</td><td>0694-1L</td><td>detergent A</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Amresco</td><td>0777-500ML</td><td>detergent B</td></tr><tr><td>Poloxamer 188 solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5556-100ML</td><td>detergent C</td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail Tablet</td><td>Roche</td><td>04 693 132 001</td><td></td></tr><tr><td>3x Flag peptide</td><td>Sigma</td><td>F4799</td><td></td></tr><tr><td>anti-FLAG m2 Magnetic beads</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8823</td><td>antibody-tagged magnetic beads</td></tr><tr><td>SUMOlink SUMO-1 Kit</td><td>Active Motif</td><td>40120</td><td>standard SUMOylation protocol&nbsp;</td></tr><tr><td>SUMOlink SUMO-2/3 Kit</td><td>Active Motif</td><td>40220</td><td>standard SUMOylation protocol&nbsp;</td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN Plasmid Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12123</td><td>plasmid extraction kit</td></tr><tr><td>Polypropylene tubes</td><td>Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Cell lifter</td><td>Corning</td><td>CNG3008</td><td></td></tr><tr><td>Loading tip</td><td>Sorenson BioScience</td><td>28480</td><td></td></tr><tr><td>PVDF</td><td>PerkinElmer</td><td>NEF1002</td><td></td></tr><tr><td>Blotting filter paper</td><td>Bio-Rad</td><td>1703932</td><td></td></tr><tr><td>Mini slab gel apparatus (Bio-Rad Mini Protean II Cell)</td><td>Bio-Rad</td><td>1658001 EDU</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>1703940</td><td></td></tr><tr><td>Pierce ECL Western Blotting</td><td>Thermo</td><td>32106</td><td>ECL reagent</td></tr><tr><td>suspension mixer</td><td>Digisystem laboratory instruments&nbsp; Inc.</td><td>SM-3000</td><td></td></tr><tr><td>orbital shaker</td><td>Kansin instruments Co.</td><td>OS701</td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant LAS 4000 biomolecular imager</td><td>GE Healthcare</td><td>28955810</td><td></td></tr><tr><td>Sf9</td><td>Thermo Scientific</td><td>B82501</td><td></td></tr><tr><td>anti-p53 antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>#9282</td><td></td></tr><tr><td>anti-rabbit antibody</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934-1ML</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro sumoylation assay te studeren sumo e3 ligase activiteit

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

Kleine ubiquitin-achtige modifier (SUMO) wijziging is een belangrijke posttranslationele wijziging (PTM) die bemiddelt signaaltransductie voornamelijk via het moduleren van eiwit-eiwitinteractie. Gelijkaardig aan wijziging van de ubiquitin, SUMOylation is geregisseerd door een cascade van de sequentiële enzym waaronder E1-activeren enzym (SAE1/SAE2), E2-conjugatie enzym (Ubc9) en E3-ligase (d.w.z., Pia's familie, RanBP2 en Pc2). Anders dan ubiquitination, een ligase E3 is echter niet-essentiële voor de reactie maar doet precisie en werkzaamheid voorzien in SUMO Woordherkomst en-opbouw. Aangepast door SUMOylation eiwitten kunnen worden geïdentificeerd door in vivo test via immunoprecipitation met substraat-specifieke antilichamen en immunoblotting met SUMO-specifieke antilichamen. De demonstratie van eiwit SUMO E3 ligase activiteit vereist echter in vitro reconstitutie van SUMOylation tests met behulp van gezuiverde enzymen, substraat en SUMO eiwitten. Omdat in de reacties in vitro , meestal SAE1/SAE2 en Ubc9, alleen volstaan voor SUMO conjugatie, is verbetering van SUMOylation door een vermeende ligase E3 niet altijd gemakkelijk te ontdekken. Hier beschrijven we een gemodificeerde in vitro SUMOylation protocol waarmee consequent SUMO wijziging met behulp van een in vitro gereconstitueerd systeem. Een stapsgewijze protocol voor het zuiveren van catalytically actieve K-bZIP, een virale SUMO-2/3 E3 ligase, wordt ook gepresenteerd. De activiteiten van de SUMOylation van de gezuiverde K-bZIP staan op p53, een bekende doelstelling van SUMO. Dit protocol kan niet alleen worden gebruikt voor het ophelderen van de roman SUMO E3 ligases, maar ook voor het openbaren van de specificiteit van hun SUMO paralog.

Volgens de informatie van de fabrikant, het forfaitaire bedrag van E1 en E2 enzym in de bepaling van de SUMOylation is 50 nM en 500 nM, respectievelijk. De minimale hoeveelheid E2 conjugating enzym Ubc9 welk vermag SUMOylate p53 werd eerst bepaald door een SUMOylation in vitro assay. Zo laag als een vijfde van het bedrag van de Ubc9 gebruikt in de standaard in vitro assay protocol van SUMOylation was in staat om efficiënt SUMOylate p53(Figuur...

In tegenstelling tot ubiquitin ligases, zijn paar E3 SUMO ligases geïdentificeerd. Deze gewijzigde in vitro SUMOylation protocol vermag roman SUMO E3 ligases identificeren door een reconstructie in vitro assay.

In Vitro SUMOylation Assay te studeren SUMO E3 Ligase activiteit

Small ubiquitin-like modifier (SUMO) modification is an important post-translational modification (PTM) that mediates signal transduction primarily ...

Het algemene doel van dit experiment is om een eiwit van belang te verifiëren dat SUMOylering kan ondergaan of een SUMO E3 lygase is. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken in het SUMOyleringsveld, zoals de identificatie van SUMO E3 lygases. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze kan worden gebruikt voor het onderzoek naar de specificiteit van SUMO E3 lygases ten opzichte van verschillende SUMO isovormen.De procedure zal worden gedemonstreerd door Wan-Shan Young, een promovendus uit mijn laboratorium. Om het K-bZIP-label te zuiveren, incubeer eerst 10 milliliter cellulair lysaat met 50 microliter antilichaam-gelabelde magnetische kralen in een 14-milliliter polypropyleenbuis. Draai vervolgens de buis gedurende drie uur op 50 omwentelingen per minuut bij vier graden Celsius in een suspensiemixer.Zodra het eiwit is gevangen, centrifugeer het monster gedurende 30 seconden bij 800 keer g bij vier graden Celsius om de kralen te bezinken. Gooi alle oplosmiddel op een milliliter na weg om de kralen opnieuw op te schorsen. Breng de opgeloste kralen vervolgens over in een 1,5-milliliter buis.Om de gevangen eiwitten te wassen, plaats de buis met de kralen op een magnetische standaard. Wacht ongeveer drie seconden totdat de kralen aan de wanden van de buis hechten en verwijder vervolgens het supernatant. Om de kralen te wassen, voeg je een milliliter lysisbuffer toe aan de 1,5-milliliter buis.Keer vervolgens de buis tien keer om. Plaats vervolgens de 1,5-milliliter buis op de magnetische standaard en verwijder het supernatant zodra de kralen aan de wanden hechten. Om de kralen opnieuw te wassen, voeg je een milliliter fosfaatgebufferd zoutoplossing toe aan de 1,5 milliliter buis en keer je het tien keer om.Breng vervolgens de buis over op de magnetische standaard en verwijder het supernatant zodra de kralen aan de wanden hechten. Om de K-bZIP-gelabelde eiwitten van de antilichaam-gelabelde magnetische kralen te elueren, voeg je 100 microliter toe met 150 microgram per milliliter octapeptide gediluteerd in fosfaatgebufferde zoutoplossing in de 1,5-milliliter buis. Draai vervolgens de buis gedurende tien minuten op een suspensiemixer met 50 omwentelingen per minuut op kamertemperatuur.Breng de buis over op de magnetische standaard. Verzamel vervolgens het K-bZIP-bevattende supernatant. Om de gezuiverde K-bZIP-label te analyseren, onderwerp je een tot vijf microliter van het gezuiverde eiwit aan SDS-pagina, gevolgd door Coomassie blauwkleuring.Laad 0,5, 1 en 2 microgram bovien serumalbumine als standaard op de gel voor het bepalen van de K-bZIP-concentratie. Terwijl de afbeelding wordt verwerkt in Image J. Verdun vervolgens het gezuiverde K-bZIP in fosfaatgebufferde zoutoplossing. Om een eindconcentratie van 100 nanogram per microliter te bereiken.En bewaar het op minus 80 graden Celsius in kleine aliquoten. Voeg drie microliter van 100 nanogram per microliter van gezuiverd gelabeld K-bZIP toe aan de in vitro SUMOylering mastermix reactie. Meng vervolgens de inhoud van de mastermix voorzichtig en incubeer bij 30 graden Celsius gedurende drie uur.Voeg vervolgens 20 microliter van 2X SDS-pagina met laadbuffer toe om de reactie te stoppen. Verhit vervolgens de monsters gedurende vijf minuten op 95 graden Celsius om het eiwit te denatureren. Laad vervolgens 20 microliter van het monster op een 10%SDS-pagina gel.En laat de gel draaien op 80 volt gedurende ongeveer 120 minuten totdat de kleurstof de bodem van de gel bereikt. Zodra de elektroforese voorbij is, ontkoppel de gelapparatuur. En breng de gel over in semi-droog overdrachtspuffer gedurende vijf minuten.Demp vervolgens de PVDF-membraan in een andere container gevuld met methanol gedurende een minuut. Verwijder de PVDF-membraan uit de methanol en dompel het in semi-droog overdrachtspuffer. Roer vervolgens gedurende vijf minuten voorzichtig met de membraan.Verwijder de veiligheidskap van het semi-droge elektroforesetoestel. Bevochtig een filterpapier. En bereid een gelsandwich voor op de bodem van de platina-anode.Nadat de kathodeplaat in de veiligheidskap is vastgezet, draai de blot gedurende 90 minuten op een constante stroom van 15 volt. Schakel vervolgens de voeding uit en verwijder de PVDF-membraan na het ontkoppelen van het semi-droge apparaat. Blokkeer nu de PVDF-membraan gedurende een uur op kamertemperatuur met blokkeringspuffer op een orbitale shaker met 30 omwentelingen per minuut.Hybridiseer vervolgens de PVDF-membraan met anti-p53-antilichaam en blokkeringspuffer gedurende 12 tot 16 uur bij vier graden Celsius op een suspensiemixer met 30 omwentelingen per minuut. Verwijder vervolgens de PVDF-membraan en breng het over in een container gevuld met Tris-gebufferde zout-Tween 20. Dompel vervolgens de PVDF-membraan gedurende 30 minuten in Tris-gebufferde zout-Tween 20 op de orbitale shaker met 45 omwentelingen per minuut.Hybridiseer vervolgens de PVDF-membraan met anti-konijnantilichaam geconjugeerd met paardenradenzym gediluteerd in blokkeringspuffer gedurende een uur op kamertemperatuur op de suspensiemixer met 30 omwentelingen per minuut. Was vervolgens de PVDF-membraan driemaal met Tris-gebufferde zout-Tween 20. Na het wassen, dompel de PVDF-membraan gedurende 30 minuten in Tris-gebufferde zout-Tween 20 op de suspensiemixer met 45 omwentelingen per minuut.Vervang vervolgens de Tris-gebufferde zout-Tween 20 met fosfaatgebufferde zoutoplossing. Om de PVDF-membraan bij vier graden Celsius gedurende maximaal 12 uur te bewaren. Meng vervolgens de verbeterde chemiluminescente substraatreagentia één en twee in een verhouding van één op één.Verwijder vervolgens de PVDF-membraan uit de fosfaatgebufferde zoutoplossing en demp kort met de punchpockets om de overtollige vocht

in-vitro-sumoylation-assay-to-study-sumo-e3-ligase-activity

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video demonstrates the in vitro method for SUMOylation of substrate proteins using a sequential enzyme cascade. Further, the SUMOylated status of the protein is identified using the electrophoresis and immunoblotting technique.

SUMOylation Assay: An In Vitro Technique to Detect the SUMOylation Status of Substrate Proteins by Immunoblotting

Dit manuscript beschrijft de detectie van sumoylation en ubiquitinering van kinetochoor eiwitten, Ndc10 en Ndc80, in de gist Saccharomyces cerevisiae.

Eiwitzuivering Techniek dat Detectie van sumoylation en Ubiquitinering van Budding gist kinetochoor Eiwitten Ndc10 en Ndc80 Maakt

Kleine ubiquitin-gerelateerde modifier (SUMO) familie eiwitten zijn geconjugeerd lysine residuen van doel eiwitten voor het regelen van diverse cellulaire processen. Dit witboek beschrijft een protocol voor de detectie van Retinoblastoom (Rb) eiwit SUMOylation onder endogene en exogene voorwaarden in menselijke cellen.

In Vivo Detectie en analyse van Rb eiwit SUMOylation in menselijke cellen

SUMO is een essentiële en zeer behouden, kleine ubiquitin-achtige modifier proteïne. In dit protocol beschrijven we het gebruik van een stress-tolerante recombinant SUMO-trappen eiwit (kmUTAG) te visualiseren native, untagged SUMO geconjugeerde en hun lokalisatie in een verscheidenheid van soorten cellen.

Lokalisatie van SUMO-gemodificeerde eiwitten met behulp van fluorescerende Sumo-trapping eiwitten

Hier presenteren we een protocol om te verrijken, isoleren, identificeren en karakteriseren van eiwitten die zijn gewijzigd door SUMO in vivo zowel van menselijke hepatoma cellen en lever tumoren verkregen uit muizen modellen van hepatocellulaire carcinoom met behulp van SUMO-bindende entiteiten (SUBEs).

SUMO-bindende entiteiten (SUBEs) als hulpmiddelen voor de verrijking, isolatie, identificatie en karakterisering van de SUMO proteome in leverkanker

Het doel van dit manuscript is om een overzicht te presenteren voor de uitgebreide biochemische en functionele studies van de RING-type E3 ubiquitine ligases. Deze pijplijn met meerdere stappen, met gedetailleerde protocollen, valideert een enzymatische activiteit van de geteste eiwitten en laat zien hoe u de activiteit koppelt aan functie.

Functionele karakterisatie van RING-type E3 Ubiquitin ligases in vitro en in planta

De huidige studie biedt gedetailleerde in vitro ubiquitylatie assay protocollen voor de analyse van E3 ubiquitine ligase katalytische activiteit. Recombinante eiwitten werden tot expressie gebracht met behulp van prokaryote systemen zoals Escherichia coli-cultuur.

In vitro Analyse van E3 Ubiquitine Ligase Functie

We bieden een gedetailleerd protocol voor een alomtegenwoordyleringstest van een specifiek substraat en een E3-ubiquitine-ligase in zoogdiercellen. HEK293T-cellijnen werden gebruikt voor eiwitoverexpressie, het polyubiquityleerde substraat werd gezuiverd uit cellysaten door immunoprecipitatie en opgelost in SDS-PAGE. Immunoblotting werd gebruikt om deze posttranslationele modificatie te visualiseren.

Evaluatie van substraatubiquitylering door E3 Ubiquitine-ligase in zoogdiercellysaten

Het huidige protocol belicht een gemodificeerde methode voor het detecteren en kwantificeren van DNA-eiwit crosslinks (DPC's) en hun posttranslationele modificaties (PTM's), waaronder ubiquitylering, SUMOylation en ADP-ribosylatie geïnduceerd door topoisomeraseremmers en door formaldehyde, waardoor de vorming en reparatie van DPC's en hun PTM's kan worden bestudeerd.

Kwantitatieve detectie van DNA-eiwit crosslinks en hun posttranslationele modificaties

Ubiquitinatie is een cruciale regulator van de functies van intracellulaire eiwitten. Hier beschrijven we twee cellysemethoden om substraatproteïneniveaus te detecteren in zoogdiercellen en vergelijken we hun effectiviteit bij het analyseren van ubiquitinatieniveaus. Eiwitoverexpressie in HEK293T cellen werd geïnduceerd door tijdelijke transfectie, en ubiquitinatieve eiwitten werden gedetecteerd door western blot-analyse.

Vergelijkende strategieën voor ubiquitinatiedetectie in zoogdiercellysaten met SMAD2/SMURF2 als model

Dit protocol beschrijft een methode om Streptococcus pneumoniae te ubiquitineren met behulp van zoogdiercellysaat of puur ubiquitine-enzymcomplex, gevolgd door behandeling met gezuiverd VCP/p97-UFD1-NPLOC4 eiwitcomplex om de bacteriolytische activiteit te beoordelen, waardoor het bestuderen van ubiquitine-afhankelijke immuuneffectoren mogelijk wordt.

In-vitro Reconstitutie van bacteriële ubiquitinatie en VCP/p97-gemedieerde eliminatie

Leer een gemodificeerde in vitro SUMOylatie-methode om nieuwe SUMO E3 ligases te identificeren en hun specificiteit voor verschillende SUMO isoformen te onderzoeken. Dit protocol is waardevol voor biochemisch onderzoek.

In Vitro SUMOylation Assay te studeren SUMO E3 Ligase activiteit

Meer video's verkennen