Name: Een nieuwe Live-imaging van In Vitro Assay voor Astrocyt-gemedieerde fagocytose met behulp van pH-Indicator-geconjugeerde Synaptosomes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-05T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: Leer een live-imaging fagocytose-assay voor astrocyten en microglia met pH-indicator-geconjugeerde synaptosomen. Deze methode meet real-time opname- en afbraakkinetiek in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs bedanken Yeon-Joo Jung voor haar experimental support tijdens synaptosome zuivering en Jungjoo Park voor beelden van synaptosomes met PS blootstelling. Bovendien, danken wij alle leden in Chung's laboratorium voor nuttige discussie. Dit werk werd gesteund door de National Research Foundation van Korea (NRF) subsidie gefinancierd door de Koreaanse overheid (MSIP) (NRF-2016M3C7A1905391 en NRF-2016R1C1B3006969) (W.-S. C).

<ol><li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+Assemble+Thalamocortical+Synapses+by+Bridging+NRX1alpha+and+NL1+via+Hevin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Astrocytes Assemble Thalamocortical Synapses by Bridging NRX1alpha and NL1 via Hevin.</a> Cell. 164 (1-2), 183-196 (2016).</li>
<li>Allen, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+glypicans+4+and+6+promote+formation+of+excitatory+synapses+via+GluA1+AMPA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Astrocyte glypicans 4 and 6 promote formation of excitatory synapses via GluA1 AMPA receptors.</a> Nature. 486 (7403), 410-414 (2012).</li>
<li>Xu, J., Xiao, N., Xia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombospondin+1+accelerates+synaptogenesis+in+hippocampal+neurons+through+neuroligin+1%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Thrombospondin 1 accelerates synaptogenesis in hippocampal neurons through neuroligin 1.</a> Nat Neurosci. 13 (1), 22-24 (2010).</li>
<li>Chung, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+mediate+synapse+elimination+through+MEGF10+and+MERTK+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Astrocytes mediate synapse elimination through MEGF10 and MERTK pathways.</a> Nature. 504 (7480), 394-400 (2013).</li>
<li>Schafer, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+sculpt+postnatal+neural+circuits+in+an+activity+and+complement-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner.</a> Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).</li>
<li>Ma, Z., Stork, T., Bergles, D. E., Freeman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromodulators+signal+through+astrocytes+to+alter+neural+circuit+activity+and+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neuromodulators signal through astrocytes to alter neural circuit activity and behaviour.</a> Nature. 539 (7629), 428-432 (2016).</li>
<li>Parkhurst, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+promote+learning-dependent+synapse+formation+through+brain-derived+neurotrophic+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Microglia promote learning-dependent synapse formation through brain-derived neurotrophic factor.</a> Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).</li>
<li>Iram, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megf10+Is+a+Receptor+for+C1Q+That+Mediates+Clearance+of+Apoptotic+Cells+by+Astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Megf10 Is a Receptor for C1Q That Mediates Clearance of Apoptotic Cells by Astrocytes.</a> J Neurosci. 36 (19), 5185-5192 (2016).</li>
<li>Tasdemir-Yilmaz, O. E., Freeman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+engage+unique+molecular+programs+to+engulf+pruned+neuronal+debris+from+distinct+subsets+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Astrocytes engage unique molecular programs to engulf pruned neuronal debris from distinct subsets of neurons.</a> Genes Dev. 28 (1), 20-33 (2014).</li>
<li>Jones, R. S., Minogue, A. M., Connor, T. J., Lynch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-beta-induced+astrocytic+phagocytosis+is+mediated+by+CD36%2C+CD47+and+RAGE%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmune+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Amyloid-beta-induced astrocytic phagocytosis is mediated by CD36, CD47 and RAGE.</a> J Neuroimmune Pharmacol. 8 (1), 301-311 (2013).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TREM2+lipid+sensing+sustains+the+microglial+response+in+an+Alzheimer%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TREM2 lipid sensing sustains the microglial response in an Alzheimer's disease model.</a> Cell. 160 (6), 1061-1071 (2015).</li>
<li>Sekar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schizophrenia+risk+from+complex+variation+of+complement+component+4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Schizophrenia risk from complex variation of complement component 4.</a> Nature. 530 (7589), 177-183 (2016).</li>
<li>Hong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+and+microglia+mediate+early+synapse+loss+in+Alzheimer+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models.</a> Science. 352 (6286), 712-716 (2016).</li>
<li>Chung, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+allele-dependent+role+for+APOE+in+controlling+the+rate+of+synapse+pruning+by+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Novel allele-dependent role for APOE in controlling the rate of synapse pruning by astrocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (36), 10186-10191 (2016).</li>
<li>Purice, M. D., Speese, S. D., Logan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+glial+clearance+of+degenerating+axons+in+aged+Drosophila+is+due+to+reduced+PI3K%2FDraper+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Delayed glial clearance of degenerating axons in aged Drosophila is due to reduced PI3K/Draper activity.</a> Nat Commun. 7, 12871(2016).</li>
<li>Loov, C., Mitchell, C. H., Simonsson, M., Erlandsson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+degradation+in+phagocytic+astrocytes+can+be+enhanced+by+lysosomal+acidification%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Slow degradation in phagocytic astrocytes can be enhanced by lysosomal acidification.</a> Glia. , (2015).</li>
<li>Xiao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+astrocytic+lysosome+biogenesis+facilitates+Abeta+clearance+and+attenuates+amyloid+plaque+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Enhancing astrocytic lysosome biogenesis facilitates Abeta clearance and attenuates amyloid plaque pathogenesis.</a> J Neurosci. 34 (29), 9607-9620 (2014).</li>
<li>Lu, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+degeneration+induces+glial+responses+through+Draper-TRAF4-JNK+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Axon degeneration induces glial responses through Draper-TRAF4-JNK signalling.</a> Nat Commun. 8, 14355(2017).</li>
<li>Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+Percoll+gradient+procedure+for+preparation+of+synaptosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes.</a> Nat Protoc. 3 (11), 1718-1728 (2008).</li>
<li>Stigliani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glia+re-sealed+particles+freshly+prepared+from+adult+rat+brain+are+competent+for+exocytotic+release+of+glutamate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Glia re-sealed particles freshly prepared from adult rat brain are competent for exocytotic release of glutamate.</a> J Neurochem. 96 (3), 656-668 (2006).</li>
<li>Foo, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+method+for+the+purification+and+culture+of+rodent+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes.</a> Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li>
<li>Cahoy, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcriptome+database+for+astrocytes%2C+neurons%2C+and+oligodendrocytes%3A+a+new+resource+for+understanding+brain+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function.</a> J Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In dit artikel presenteren we methoden voor een langdurig wonen-imaging in vitro fagocytose assay met gezuiverde gliale cellen en pH-indicator-geconjugeerd synaptosomes. We tonen aan dat in vergelijking met microglia, astrocyten bezitten verschillende engulfment en afbraak capaciteit tijdens de fagocytose van synaptosomes. Bovendien, blijkt onze gegevens dat Astrocyt-uitgescheiden factoren, die een "passerelle" moleculen zoals MEGE8, GAS6 en eiwitten bevatten, essentieel voor de efficiënte PS-afhankelijke fagocy...

Gliale cellen, die naar niet-prikkelbaar cellen in de hersenen verwijzen, zijn de grote celtype in het centrale zenuwstelsel (CNS). Eerder, gliale cellen werden beschouwd als louter ondersteunende cellen die voornamelijk spelen een passieve rol bij het handhaven van de basale synaptic eigenschappen en neuronale overleven. Echter, opkomende bewijs heeft geopenbaard dat gliacellen spelen een actiever rol in verschillende aspecten van neurobiologie, zoals behoud van hersenen homeostase, synaps formatie,1,,2,3 en synapse bemiddelen eliminatie4,5, en modulerende synaptische plasticiteit6,7. Gliale cellen in het VNV zijn astrocyten, microglia en oligodendrocyten. Onder deze cellen, astrocyten en microglia gebleken fagocytische rol spelen door Djaja synapsen4,5, apoptotic cellen8, neurale puin9en pathogene eiwitten, zoals bèta amyloid plaques10,11. In de ontwikkelende hersenen elimineren astrocyten synapsen in de dorsale laterale geniculate kern (dLGN) t/m4fagocytose MERTK - en MEGF10-afhankelijk. Evenzo, microglia ook elimineren C1q beklede synapsen tijdens ontwikkelingsstadia tot en met de klassieke complement cascade5. Interessant, is er gesuggereerd dat gebreken in de synaps snoeien kunnen bestaan uit een van de initiatiefnemers van verschillende neurologische stoornissen. Het heeft bijvoorbeeld aangetoond dat mutaties in aanvulling onderdeel 4 (C4), waardoor aanvulling-bemiddelde synapse snoeien door microglia, sterk geassocieerd met de prevalentie van schizofrenie in mens12 zijn. Een recent document heeft ook aangetoond dat de klassieke complement pathway hyperactivated in de stadia van de initiatie van AD is en vroege synapse verlies in deze ziekte13induceert.
Vergeleken met microglia-gemedieerde fagocytose, is of Astrocyt-gemedieerde fagocytose bijdraagt tot de inleiding en de progressie van verschillende neurologische aandoeningen minder duidelijk. Echter, een recente papier suggereert dat factoren die veranderen van het tempo van de normale synapse snoeien door astrocyten kunnen hersenen homeostase te verstoren en aan AD gevoeligheid en pathologie14 bijdragen. Het tempo van de synaps snoeien door astrocyten wordt krachtig gecontroleerd door ApoE isomeren, met een beschermende allel voor AD (ApoE2) sterk verbeteren van het tarief en de allel van een risico voor AD (ApoE4) aanzienlijk verlagen het tarief. Bovendien, transgene muizen uitdrukken ApoE4 verzameld veel meer synaptic C1q dan controle of ApoE2 muizen14. Deze gegevens duiden erop dat verminderde Astrocyt-gemedieerde fagocytose in de vroege AD hersenen veroorzaken de accumulatie van verouderend C1q beklede synapsen/synaptic puin dat aanvulling-bemiddelde microglial fagocytose activeert, rijden van de degeneratie van synaptic . De verminderde fagocytische capaciteit van astrocyten bij ApoE4 vervoerders kan ook bijdragen aan de ongecontroleerde accumulatie van bèta amyloid plaques in de hersenen die getroffen zijn door AD.
Daarnaast is gebleken dat gliale cellen in de hersenen Drosophila leeftijd hun fagocytische vermogen als gevolg van verminderde vertaling van Draper, een homolog van Megf10 die astrocyten gebruiken verliezen voor het phagocytosing van de synapsen. Herstel van Draper niveaus redde de fagocytische capaciteit van gliale cellen, die efficiënt beschadigde axonale puin in de leeftijd hersenen in vergelijkbare mate als die in de jonge hersenen gewist, die aangeeft dat veroudering-geïnduceerde veranderingen in de fagocytische capaciteit van astrocyten kunnen bijdragen aan een verstoring van de hersenen homeostase15.
Op basis van deze nieuwe bevindingen, moduleren van de fagocytische capaciteit van astrocyten mogelijk een aantrekkelijke therapeutische strategie ter preventie en behandeling van diverse neurologische aandoeningen. In dit verband zijn er verschillende pogingen ondernomen om het verbeteren van de fagocytische capaciteit van astrocyten, bijvoorbeeld door verzuring van lysosomen met zure nanodeeltjes16 inducerende en overexpressing van de transcriptiefactor EB (TFEB), die kan verbeteren lysosoom biogenese17. Ondanks deze pogingen is het nog onduidelijk hoe de astrocyten en microglial cellen in hun fagocytische kinetiek verschillen en of we moeten vergroten of hun fagocytische capaciteiten in de verschillende ziekten verkleinen.
In deze paper presenteren we een nieuwe in vitro assay voor het opsporen van de fagocytische capaciteit van astrocyten in real-time. De gegevens wijzen verschillende kinetiek van engulfment en aantasting van astrocyten en microglia. Astrocyt-geconditioneerd medium (ACM), dat secreted factoren van astrocyten bevat, is essentieel voor effectieve fagocytose van astrocyten zowel microglia. Bovendien, Megf10, een fagocytische receptor in astrocyten en een homolog van Ced-1 en Draper, speelt belangrijke rol in Astrocyt-gemedieerde fagocytose8,18.

<table><tbody><tr><td>Synaptosome zuivering</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE healthcare life sciences</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Quick Start Bradford Protein Assay Kit 2</td><td>BIO-RAD</td><td>5000202</td><td></td></tr><tr><td>pH indicator conjugatie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfaat (DMSO)</td><td>LPS-oplossing</td><td>DMSO100</td><td></td></tr><tr><td>pHrodo rood, succinimidyl ester</td><td>Molecula probes</td><td>P36600</td><td></td></tr><tr><td>Immunopanning</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X Earle&rsquo;s balanced zout oplossing (EBSS)</td><td>Sigma</td><td>E7510</td><td></td></tr><tr><td>Rund serum albumine</td><td>Bovogen</td><td>BSA025</td><td></td></tr><tr><td>Deoxyrebonuclease 1 (DNase)</td><td>Worthington</td><td>Is002007</td><td></td></tr><tr><td>(DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>(dPBS)</td><td>Welgene</td><td>LB001-02</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal rund serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Griffonia Simplicifolia Lectine(BSL-1)</td><td>Vector Labs</td><td>L-1100</td><td></td></tr><tr><td>Geiten anti-muis IgG+IgM(H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-005-044</td><td></td></tr><tr><td>Geiten anti-muis IgM (&mu;-keten)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-005-020</td><td></td></tr><tr><td>Heparinevrije epidermale groeifactor</td><td>Sigma</td><td>E4643</td><td></td></tr><tr><td>Humaan HepaCAM antilichaam</td><td>R&amp;D systems</td><td>MAB4108</td><td></td></tr><tr><td>Integrine beta 5 monoklonaal antilichaam (KN52)</td><td>eBioscience</td><td>14-0497-82</td><td></td></tr><tr><td>L-cysteïne</td><td>Sigma</td><td>C7880</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamaat</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>N-acetly-L-cysteïne (NAC)</td><td>Sigma</td><td>A8199</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal media</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>O4 hybridoma supernatant(muis IgM)</td><td>Bansal et al.23</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papaïne</td><td>Worthington</td><td>Is003126</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline/streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Pluristrainer 20 &mu;m</td><td>PluriSelect</td><td>43-50020-03</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Putrescine dihydrochloride</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Gezuiverd rat anti-muis CD45</td><td>BD Pharmingen</td><td>550539</td><td></td></tr><tr><td>Gezuiverd muis anti-rat CD45</td><td>BD Pharmingen</td><td>554875</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvaat</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Natriumseleniet</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>Transferrine</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Sigma</td><td>T9935</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine remmer</td><td>Worthington</td><td>LS003086</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-heldere buis (buis, dunne wand, ultra-helder)</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Verzamel IP-ACM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Macrosep Advance Centrifugal Devices met Omega Membraan (10k)</td><td>PALL</td><td>MAP010C37</td><td></td></tr><tr><td>Macrosep Advance Centrifugal Devices met Omega Membraan (30k)</td><td>PALL</td><td>MAP030C37</td><td></td></tr><tr><td>Fagocytose live beeldvormingstest</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Juli stage</td><td>NanoEntek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Time Series Analyzer V3 plugins</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

een nieuwe live-imaging van in vitro assay voor astrocyt-gemedieerde fagocytose met behulp van ph-indicator-geconjugeerde synaptosomes

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

Astrocyten zijn de grote celtype in de hersenen en direct contact opnemen met synapsen en bloedvaten. Hoewel microglial cellen zijn aangemerkt de belangrijke immune cellen en alleen fagocyten in de hersenen, de recente studies hebben aangetoond dat astrocyten ook deelnemen aan diverse fagocytische processen, zoals ontwikkelingsstoornissen synapse opheffing en de ontmijning van bèta amyloid plaques in de ziekte van Alzheimer (AD). Ondanks deze bevindingen is de efficiëntie van Astrocyt engulfment en aantasting van hun doelstellingen onduidelijk vergeleken met die van microglia. Dit gebrek aan informatie is vooral te wijten aan het ontbreken van een systeem van de bepaling waarin de kinetiek van Astrocyt - en microglia-gemedieerde fagocytose gemakkelijk vergelijkbaar zijn. Om dit te bereiken, hebben we een lange termijn live-imaging in vitro fagocytose assay om te evalueren van de fagocytische capaciteit van gezuiverde astrocyten en microglia ontwikkeld. In deze test is real-time detectie van engulfment en aantasting mogelijk met behulp van de pH-indicator-geconjugeerde synaptosomes, die uitstoten van heldere rode fluorescentie in zure organellen, zoals lysosomen. Onze nieuwe assay biedt eenvoudige en doeltreffende opsporing van fagocytose via live-imaging. Daarnaast kan deze fagocytose in vitro assay worden gebruikt als een screening platform om chemische stoffen en verbindingen die kunnen verbeteren of remmen de fagocytische capaciteit van astrocyten te identificeren. Zoals synaptic snoeien storing en pathogene eiwit accumulatie is gebleken psychische stoornissen of neurodegeneratieve ziekten veroorzaken, moet chemicaliën en verbindingen die de fagocytische capaciteit van gliale cellen moduleren nuttig zijn bij de behandeling van verschillende neurologische stoornissen.

In deze in vitro fagocytose assay met langdurige live-imaging gebruikten we synaptosomes van volwassen muis hersenen homogenates, die in de kleurovergang oplossing tussen 23% kleurovergang oplossing en kleurovergang 10%-oplossingligttussen werden gescheiden door ultracentrifugatie) Figuur 3). Na de voorbereiding blootgesteld synaptosomes PS in hun buitenste membraan (Figuur 4), wat suggereert dat ze hun functie verloren ...

Dit protocol biedt een in vitro live-imaging fagocytose assay voor het meten van de fagocytische capaciteit van astrocyten. Gezuiverde rat astrocyten en microglia worden gebruikt samen met pH-indicator-geconjugeerd synaptosomes. Deze methode kan detecteren real-time engulfment en afbraak kinetiek en biedt een platform geschikt screening om te identificeren factoren moduleren Astrocyt fagocytose.

Een nieuwe Live-imaging van In Vitro Assay voor Astrocyt-gemedieerde fagocytose met behulp van pH-Indicator-geconjugeerde Synaptosomes

Astrocytes are the major cell type in the brain and directly contact synapses and blood vessels. Although microglial cells have been considered the major ...

Het algemene doel van dit experiment is om de real-time inslikking en afbraakkinetiek van gliacellen, zoals astrocyten en microglië, te detecteren door middel van in vitro live-beeldvorming van de fagocytose van pH-indicator-geconjugeerde synaptosomen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken in het neurowetenschappelijk veld, zoals hoe de fagocytose van gliacellen wordt gereguleerd in gezonde en zieke hersenen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we de real-time fagocytische kinetiek van gliacellen effectief kunnen monitoren en analyseren door middel van live beeldvorming van in vitro gekweekte cellen.Deze methode kan ook worden gebruikt om factoren en verbindingen te screenen die de inslikking en afbraakcapaciteit van gliacellen reguleren. Begin door de ontdooide synaptosoommonsters drie tot vier minuten te centrifugeren bij 21.092 G en vier graden Celsius. Na het afzuiging van de supernatanten, re-suspendeer de pellets in 200 microliter 0,1 molaire natriumcarbonaat per buisje, waarbij je twee microliter pH-indicator toevoegt aan elk monster nadat ze grondig gemengd zijn.Na een lichte vortex, bescherm de oplossingen tegen licht met alum

a-novel-vitro-live-imaging-assay-astrocyte-mediated-phagocytosis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Dit protocol beschrijft hoe u synaps nummer zowel in gedissocieerde neuronale cultuur en in de hersenen secties met behulp van immunocytochemie kwantificeren. Met behulp van vak-specifieke antilichamen, we label presynaptische terminals alsmede ten aanzien sites van postsynaptische specialisatie. We definiëren synapsen als punten van colocalization tussen de signalen die door deze markers.

Het kwantificeren van Synapsen: een immunocytochemie-gebaseerde test te Synapse Number Kwantificeer

In this video, we perform the microglial phagocytosis assay for neuroblastoma using induced pluripotent stem cells. The assay helps assess the impairment of microglial function in neurodegenerative diseases.

Microglial Phagocytosis Assay: An In Vitro Assay to Establish Microglial Phagocytosis Model for Neuroblastoma Cells Using iPSC Macrophages

In this video, we evaluate the phagocytic capacity of purified astrocytes in vitro by live imaging assay. The assay serves as an effective screening platform to identify chemical compounds that can enhance or inhibit the phagocytic capacity of astrocytes.

In Vitro Phagocytosis Assay: A Live Imaging Based Method to Study Real-time Astrocyte Mediated Synaptosome Phagocytosis

Source: Funes, S., et. al.,  Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes. J. Vis. Exp. (2022)This video demonstrates an assay to study the phagocytic capacity of microglia-like cells using pH-sensitive fluorescent dye-labeled synaptosomes.

Live-cell Phagocytosis Assay of Microglia-Like Cells Using Human Synaptosomes

Hier beschrijven we een aanpassing van de protocollen voor homeostatische plasticiteit induceren in neuronen voor de studie van plasticiteit van astrocytaire G-proteïne gekoppelde receptoren. Onlangs gebruikt om wijzigingen in astrocytaire I mGluRs bij jonge muizen te onderzoeken, kan de werkwijze worden toegepast voor de schaal van verschillende astrocytaire GPCRs meten in weefsel van volwassen muizen in situ en in vivo, en een betere waardering van de gevoeligheid van astrocytaire receptoren...

Inducerende Plasticiteit van astrocyten receptoren door Manipulatie van neuronale tarieven

Microglia vormen de bewoner immuuncellen van het centrale zenuwstelsel (CZS) met een hoge capaciteit te fagocyteren of overspoelen materiaal in hun extracellulaire omgeving. Hier wordt een breed toepasbare, betrouwbaar en zeer kwantitatieve assay voor het visualiseren en meten-gemedieerde microglia afblazen van synaptische componenten beschreven.

Een Engulfment Assay: Een protocol bij interacties tussen CNS Fagocyten en Neuronen Assess

Microgliale fagocytose is essentieel voor het behoud van weefselhomeostase en onvoldoende fagocytosefunctietesten is betrokken bij pathologie. Echter, het beoordelen van microglia functie in vivo is technisch uitdagend. We hebben een eenvoudige maar robuuste techniek ontwikkeld voor het nauwkeurig bewaken en kwantificeren van de fagocytische potentieel van microglia in een fysiologische omgeving.

Het beoordelen van het netvlies Microgliale fagocytosefunctietesten<em&gt; In Vivo</em&gt; Met behulp van een flowcytometrie-gebaseerde test

Hier beschrijven we een in vitro Live-imaging methode om intracellulair transport van organellen en de handel in plasma membraan eiwitten in muriene astrocyten te visualiseren. Dit protocol presenteert ook een analysemethode voor het vrachtvervoer en kinetiek.

Visualisering en analyse van intracellulair transport van organellen en andere Cargo's in astrocyten

Neurodegeneratieve ziekten worden geassocieerd met ontregelde microgliafuncties. Dit artikel schetst een in vitro test van fagocytose van neuroblastoomcellen door iPSC-macrofagen. Kwantitatieve microscopie-uitleingen worden beschreven voor zowel live-cell time-lapse imaging als fixed-cell high-content imaging.

In vitro kwantitatieve beeldvormingstest voor fagocytose van dode neuroblastoomcellen door iPSC-macrofagen

Dit protocol beschrijft het differentiatieproces van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) in microglia-achtige cellen voor in vitro experimenten. We nemen ook een gedetailleerde procedure op voor het genereren van menselijke synaptosomen uit iPSC-afgeleide lagere motorneuronen die kunnen worden gebruikt als substraat voor in vitro fagocytosetests met behulp van live-cell imaging-systemen.

Humane microglia-achtige cellen: differentiatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen en in vitro live-cel fagocytosetest met behulp van humane synaptosomen

Hier presenteren we twee protocollen om microgliale inslokking van vGLUT1-positieve synapsen en pHRodo Red-gelabelde ruwe synaptosomen te kwantificeren met behulp van flowcytometrie.

Kwantificering van microgliale inslokking van synaptisch materiaal met behulp van flowcytometrie

Leer een live-imaging fagocytose-assay voor astrocyten en microglia met pH-indicator-geconjugeerde synaptosomen. Deze methode meet real-time opname- en afbraakkinetiek in vitro.

Een nieuwe Live-imaging van In Vitro Assay voor Astrocyt-gemedieerde fagocytose met behulp van pH-Indicator-geconjugeerde Synaptosomes (Video) | JoVE Journal

Een nieuwe Live-imaging van In Vitro Assay voor Astrocyt-gemedieerde fagocytose met behulp van pH-Indicator-geconjugeerde Synaptosomes

Meer video's verkennen