Een neuraal netwerk-gebaseerde identificatie van ontwikkelingsachterstand bevoegde of incompetente muis volgroeide eicellen
March 3rd, 2018
Hier presenteren we een protocol voor niet-invasieve beoordeling van ontwikkelingsstoornissen bekwaamheid oöcyt uitgevoerd tijdens hun rijping in vitro van het vesikel germinal aan de metafase-II. Deze methode combineert time-lapse imaging met particle image velocimetry (PIV) en neurale netwerk analyses.
Het algemene doel van deze procedure is de identificatie van occyten met een ontwikkelingscapaciteit aan de achterzijde met behulp van een niet-invasieve tool. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat door simpelweg de bewegingen van de oocyten te observeren die optreden tijdens in vitro rijping, het ontwikkelingspotentieel van de vrouwelijke gameet kan worden geëvalueerd. Deze techniek is gebaseerd op time-lapse beeldvorming gekoppeld aan particle image velocimetry, een op neurele netwerken gebaseerde analyse.
Hier beschrijven we de stappen die zijn genomen om aan te tonen dat muis-occyten tijdens de overgang van de germinale vesiculaire naar metafase twee-fase een ander profiel van genoemde plasmische bewegingen vertonen, dat significant gecorreleerd is met hun ontwikkelingscompetentie of -incompetentie. Volgens de Wereldgezondheidsorganisatie is onvruchtbaarheid een pathologie die ongeveer 20 procent van de paren treft en daarnaast loopt een derde van de vrouwen die een kankerbehandeling ondergaan risico op een voortijdige ovariële falen. Dit komt overeen met ongeveer 300.000 of 30.000 vrouwen in landen zoals de VS of Italië respectievelijk.
Het ontwerp van niet-invasieve procedures voor de identificatie van de ontwikkelingscompetentie van de oocyten zou helpen om het algehele succes van zwangerschapsuitkomsten te verbeteren. Hier geven we details van de meest kritische stappen van de procedure zoals ontwikkeld voor de muis, om het klaar te maken voor testen en gebruik voor andere zoogdiersoorten zoals runderen of mensen. Eierstocken worden overgebracht in een petrischaal met M2-medium dat voorverwarmd en geëquilibreerd is op 37 graden Celsius en vijf procent CO2.
Als de eileider en wat vet nog steeds rond de eierstok aanwezig zijn, moeten ze worden verwijderd. Vervolgens wordt de eierstok met een tang vastgehouden en het oppervlak ervan geprikt met een steriele 1G-naald. De geprikte eierstokken worden verwijderd uit het M2-medium en met behulp van een met de hand getrokken micropipet wordt onze eerste zet naar een nieuw schoon M2-medium gemaakt, en vervolgens enkele seconden in en uit gepipetteerd totdat de cumuluscellen rond de oocyte volledig zijn verwijderd.
Vervolgens worden oocyten overgebracht in druppels van 20 microliter M2-medium en als er nog enkele cumuluscellen aanwezig zijn, worden deze grondig verwijderd door meerdere passages van druppel naar druppel totdat de cumuluscellen volledig zijn verwijderd. Om Hoechst 33342 voor te bereiden tot een uiteindelijke concentratie van 0,05 microgram per ml, beginnen we met een milde oplossing van Hoechst met een concentratie van vijf milligram per ml, bereid in eenmalig pbs en dit wordt verder verdund tot de vereiste concentratie is verkregen. Microdruppels van 3,5 microliter Hoechst-oplossing worden op de bodem van een petrischaaldeksel geplaatst en elke enkele verdunde oocyte wordt vervolgens in een enkele Hoechst-druppel overgebracht, waarbij erop wordt gelet dat de lichtexpositie tijdens het Hoechst-kleuringsproces wordt verminderd door de schaal met een donker deksel te bedekken.
Na tien minuten kleuring worden oocyten onder een fluorescentiemicroscoop met UV-licht waargenomen. Op basis van de chromatine-conformatie worden ze geclassificeerd als omringde Nucleolus, SN, als ze een ring van x-positieve chromatine rond de nucleolus vertonen of als Niet-omringde Nucleolus, NSN, als de nucleolus geen ring van x-positieve chromatine heeft en het algehele chromatine verspreid lijkt in de nucleolus. Vier druppels van twee microliter alpha mem-medium worden op een glazen bodem petrischaal gelegd, waarbij erop wordt gelet dat de druppels binnen een specifieke afstand worden gehouden, de druppels worden overdekt met voorverwarmd en geëquilibreerd mineraaloliën en een totaal van drie tot vier oocyten worden overgebracht naar elke druppel.
De petrischaal wordt overgebracht naar de incubatiekamer van een time-lapse-microscoop, die langdurige cyclature-onderhoud van de temperatuur op 37 graden Celsius en vijf procent CO2 en verlichting met rood LED-licht mogelijk maakt. Voorafgaand aan de time-lapse-analyse worden, met behulp van de BioStation-software, de coördinaten van elke druppel ingesteld om de overgang van de ene druppel naar de andere tijdens de time-lapse-routine te automatiseren. Time-lapse-frames worden met tussenpozen van acht minuten gedurende een totaal van 15 uur genomen.
De opgenomen films worden vervolgens geanalyseerd met behulp van de CellPave-software, die de detectie van cytoplasmatische bewegingen mogelijk maakt, uitgedrukt in termen van snelheidsvectoren. Eerst wordt met behulp van de CellPave-tool de omtrek van elke oocyte handmatig afgebakend. Vervolgens berekent de software de snelheid van het cytoplasmatische beweging dat optreedt in de vergelijking tussen twee opeenvolgende time-lapse-frames en drukt dit uit door een gekleurde pijl te plaatsen waarvan de kleurintensiteit en lengte de snelheid en richting van de bewegingen definiëren.
De onderstaande histogram toont de algehele snelheid van de cytoplasmatische bewegingen gedurende de 15 uur durende opnameperiode van een SN-oocyte. Dezelfde type analyse wordt uitgevoerd op een NSN-oocyte. Merk de vertraagde polare lichaamsextrusie piek op die wordt getoond door de NSN-oocyte vergeleken met de SN-oocyte.
Onderaan het scherm wordt het tijdelijke patroon van de cytoplasmatische bewegingssnelheid van de oocyte weergegeven. De snelheid wordt berekend door twee opeenvolgende frames te vergelijken. De ruwe gegevens van de cytoplasmatische bewegingssnelheid worden vervolgens geëxporteerd naar een Excel-blad dat, op de rijen, de Frens-sequentie rapporteert en op de kolommen de enkele geanalyseerde oocyte.
Aan de linkerkant de gegevens van een SN-oocyte, terwijl aan de rechterkant die van NSN-occyten. De gegevens van zowel SN- als NSN-occyten worden vervolgens verdeeld in 10 subgroepen. Negen worden gebruikt voor training, groene kleur.
En een voor de blinde test, rode kleur. Deze procedure wordt in totaal 10 keer herhaald. Elke keer wordt het blinde testmonster gewijzigd.
De gegevens worden vervolgens
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert een niet-invasieve protocol voor het beoordelen van de ontwikkelingscompetentie van oocyten tijdens in vitro rijping. De methode maakt gebruik van time-lapse beeldvorming en deeltjesbeeldsnelheidsmeting (PIV) in combinatie met neurale netwerkanalyses.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Reproductieve biologie
- Oocytontwikkeling
- In vitro bevruchting
Achtergrond
- Onvruchtbaarheid treft ongeveer 20% van de paren.
- Een derde van de vrouwen die een kankerbehandeling ondergaan, riskeren voortijdige ovariële insufficiëntie.
- Het identificeren van oocyten met ontwikkelingscapaciteit is cruciaal voor het verbeteren van vruchtbaarheidsbehandelingen.
- Deze studie richt zich op muis-oocyten die overgaan van germinale blaasje naar metafase II.
Doel van het onderzoek
- Om oocyten met ontwikkelingscompetentie te identificeren met behulp van een niet-invasieve methode.
- Om het potentieel van vrouwelijke gameten te evalueren door observatie van oocytenbewegingen.
- Om plasmatische bewegingsprofielen te correleren met ontwikkelingscompetentie.
Gebruikte methoden
- Time-lapse beeldvorming om oocytenbewegingen te monitoren.
- Deeltjesbeeldsnelheidsmeting (PIV) voor het analyseren van bewegingspatronen.
- Neurale netwerkanalyse om gegevens te interpreteren.
- Vergelijking van bewegingsprofielen tussen competente en incompetente oocyten.
Belangrijkste resultaten
- Oocyten vertonen verschillende bewegingsprofielen die gecorreleerd zijn met hun ontwikkelingscompetentie.
- De niet-invasieve methode maakt real-time beoordeling van oocytenkwaliteit mogelijk.
- Bevindingen kunnen vruchtbaarheidsbehandelingsstrategieën verbeteren.
- Mogelijke implicaties voor het verbeteren van resultaten in geassisteerde reproductieve technologieën.
Conclusies
- De studie demonstreert een betrouwbare niet-invasieve aanpak om de kwaliteit van oocyten te beoordelen.
- Time-lapse beeldvorming en PIV kunnen effectief de ontwikkelingscompetentie voorspellen.
- Deze methode kan bijdragen aan vooruitgang in de reproductieve geneeskunde.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Assessing oocyte developmental competence non-invasively addresses a critical bottleneck in assisted reproductive technologies by enabling early selection of viable gametes. This approach supports predictive confidence in fertility treatment pipelines by correlating cytoplasmic movement profiles with developmental outcomes. The method’s adaptability to human oocytes offers translational value for improving IVF success rates and reducing clinical trial attrition in reproductive medicine.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of developmental competence as a phenotypic readout for oocyte quality assessment.
- Operational Value: Provides a non-invasive, imaging-based proxy for functional validation without requiring fertilization or embryo culture.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative cytoplasmic movement velocity profiles as measurable outputs for high-content screening.
- Operational Value: Standardizes time-lapse imaging and PIV analysis for reproducible, scalable oocyte evaluation across laboratories.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system modeling by linking oocyte movement dynamics to developmental competence in mammalian systems.
- Operational Value: Facilitates preclinical continuity from discovery to validation through consistent, non-invasive readouts applicable to human oocytes.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing a predictive assay for oocyte quality prior to fertilization, enabling go/no-go decisions in gamete selection pipelines.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of cytoplasmic dynamics as biomarkers of developmental potential.
- Screening: Delivers standardized, quantitative velocity metrics for automated oocyte classification.
- Analytics: Employs feed-forward neural networks to convert time-lapse movement data into competence probability scores.
- Translational Research: Connects mouse oocyte findings to human applications through conserved mechanisms of cytoplasmic regulation during maturation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis platform for oocyte quality assessment across species and clinical settings.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in oocyte selection by linking movement patterns to developmental outcomes with 91.03% accuracy.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized time-lapse intervals, PIV processing, and neural network training protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by reducing reliance on invasive assays and failed IVF cycles through pre-selection of competent oocytes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of oocytes in ART workflows, increasing the likelihood of successful embryo development.
Implementation Considerations
- Requires expertise in time-lapse microscopy, particle image velocimetry, and neural network training.
- Dependent on controlled incubation systems maintaining 37°C and 5% CO₂ for consistent oocyte maturation.
- Necessitates standardized image acquisition at 8-minute intervals over 15 hours for reliable cytoplasmic movement profiling.
- Involves manual oocyte perimeter delimitation in CellPave software, which may introduce inter-operator variability.
- Limited to species with observable cytoplasmic movements during in vitro maturation; applicability to humans requires validation.
