Een neuraal netwerk-gebaseerde identificatie van ontwikkelingsachterstand bevoegde of incompetente muis volgroeide eicellen
3 maart 2018
Hier presenteren we een protocol voor niet-invasieve beoordeling van ontwikkelingsstoornissen bekwaamheid oöcyt uitgevoerd tijdens hun rijping in vitro van het vesikel germinal aan de metafase-II. Deze methode combineert time-lapse imaging met particle image velocimetry (PIV) en neurale netwerk analyses.
Het algemene doel van deze procedure is de identificatie van occyten met een ontwikkelingscapaciteit aan de achterzijde met behulp van een niet-invasieve tool. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat door simpelweg de bewegingen van de oocyten te observeren die optreden tijdens in vitro rijping, het ontwikkelingspotentieel van de vrouwelijke gameet kan worden geëvalueerd. Deze techniek is gebaseerd op time-lapse beeldvorming gekoppeld aan particle image velocimetry, een op neurele netwerken gebaseerde analyse.
Hier beschrijven we de stappen die zijn genomen om aan te tonen dat muis-occyten tijdens de overgang van de germinale vesiculaire naar metafase twee-fase een ander profiel van genoemde plasmische bewegingen vertonen, dat significant gecorreleerd is met hun ontwikkelingscompetentie of -incompetentie. Volgens de Wereldgezondheidsorganisatie is onvruchtbaarheid een pathologie die ongeveer 20 procent van de paren treft en daarnaast loopt een derde van de vrouwen die een kankerbehandeling ondergaan risico op een voortijdige ovariële falen. Dit komt overeen met ongeveer 300.000 of 30.000 vrouwen in landen zoals de VS of Italië respectievelijk.
Het ontwerp van niet-invasieve procedures voor de identificatie van de ontwikkelingscompetentie van de oocyten zou helpen om het algehele succes van zwangerschapsuitkomsten te verbeteren. Hier geven we details van de meest kritische stappen van de procedure zoals ontwikkeld voor de muis, om het klaar te maken voor testen en gebruik voor andere zoogdiersoorten zoals runderen of mensen. Eierstocken worden overgebracht in een petrischaal met M2-medium dat voorverwarmd en geëquilibreerd is op 37 graden Celsius en vijf procent CO2.
Als de eileider en wat vet nog steeds rond de eierstok aanwezig zijn, moeten ze worden verwijderd. Vervolgens wordt de eierstok met een tang vastgehouden en het oppervlak ervan geprikt met een steriele 1G-naald. De geprikte eierstokken worden verwijderd uit het M2-medium en met behulp van een met de hand getrokken micropipet wordt onze eerste zet naar een nieuw schoon M2-medium gemaakt, en vervolgens enkele seconden in en uit gepipetteerd totdat de cumuluscellen rond de oocyte volledig zijn verwijderd.
Vervolgens worden oocyten overgebracht in druppels van 20 microliter M2-medium en als er nog enkele cumuluscellen aanwezig zijn, worden deze grondig verwijderd door meerdere passages van druppel naar druppel totdat de cumuluscellen volledig zijn verwijderd. Om Hoechst 33342 voor te bereiden tot een uiteindelijke concentratie van 0,05 microgram per ml, beginnen we met een milde oplossing van Hoechst met een concentratie van vijf milligram per ml, bereid in eenmalig pbs en dit wordt verder verdund tot de vereiste concentratie is verkregen. Microdruppels van 3,5 microliter Hoechst-oplossing worden op de bodem van een petrischaaldeksel geplaatst en elke enkele verdunde oocyte wordt vervolgens in een enkele Hoechst-druppel overgebracht, waarbij erop wordt gelet dat de lichtexpositie tijdens het Hoechst-kleuringsproces wordt verminderd door de schaal met een donker deksel te bedekken.
Na tien minuten kleuring worden oocyten onder een fluorescentiemicroscoop met UV-licht waargenomen. Op basis van de chromatine-conformatie worden ze geclassificeerd als omringde Nucleolus, SN, als ze een ring van x-positieve chromatine rond de nucleolus vertonen of als Niet-omringde Nucleolus, NSN, als de nucleolus geen ring van x-positieve chromatine heeft en het algehele chromatine verspreid lijkt in de nucleolus. Vier druppels van twee microliter alpha mem-medium worden op een glazen bodem petrischaal gelegd, waarbij erop wordt gelet dat de druppels binnen een specifieke afstand worden gehouden, de druppels worden overdekt met voorverwarmd en geëquilibreerd mineraaloliën en een totaal van drie tot vier oocyten worden overgebracht naar elke druppel.
De petrischaal wordt overgebracht naar de incubatiekamer van een time-lapse-microscoop, die langdurige cyclature-onderhoud van de temperatuur op 37 graden Celsius en vijf procent CO2 en verlichting met rood LED-licht mogelijk maakt. Voorafgaand aan de time-lapse-analyse worden, met behulp van de BioStation-software, de coördinaten van elke druppel ingesteld om de overgang van de ene druppel naar de andere tijdens de time-lapse-routine te automatiseren. Time-lapse-frames worden met tussenpozen van acht minuten gedurende een totaal van 15 uur genomen.
De opgenomen films worden vervolgens geanalyseerd met behulp van de CellPave-software, die de detectie van cytoplasmatische bewegingen mogelijk maakt, uitgedrukt in termen van snelheidsvectoren. Eerst wordt met behulp van de CellPave-tool de omtrek van elke oocyte handmatig afgebakend. Vervolgens berekent de software de snelheid van het cytoplasmatische beweging dat optreedt in de vergelijking tussen twee opeenvolgende time-lapse-frames en drukt dit uit door een gekleurde pijl te plaatsen waarvan de kleurintensiteit en lengte de snelheid en richting van de bewegingen definiëren.
De onderstaande histogram toont de algehele snelheid van de cytoplasmatische bewegingen gedurende de 15 uur durende opnameperiode van een SN-oocyte. Dezelfde type analyse wordt uitgevoerd op een NSN-oocyte. Merk de vertraagde polare lichaamsextrusie piek op die wordt getoond door de NSN-oocyte vergeleken met de SN-oocyte.
Onderaan het scherm wordt het tijdelijke patroon van de cytoplasmatische bewegingssnelheid van de oocyte weergegeven. De snelheid wordt berekend door twee opeenvolgende frames te vergelijken. De ruwe gegevens van de cytoplasmatische bewegingssnelheid worden vervolgens geëxporteerd naar een Excel-blad dat, op de rijen, de Frens-sequentie rapporteert en op de kolommen de enkele geanalyseerde oocyte.
Aan de linkerkant de gegevens van een SN-oocyte, terwijl aan de rechterkant die van NSN-occyten. De gegevens van zowel SN- als NSN-occyten worden vervolgens verdeeld in 10 subgroepen. Negen worden gebruikt voor training, groene kleur.
En een voor de blinde test, rode kleur. Deze procedure wordt in totaal 10 keer herhaald. Elke keer wordt het blinde testmonster gewijzigd.
De gegevens worden vervolgens
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een niet-invasief protocol voor het beoordelen van de ontwikkelingscompetentie van oocyten tijdens in vitro rijping. De methode maakt gebruik van time-lapse imaging en particle image velocimetry (PIV) in combinatie met neurale netwerkanalyses.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Reproductieve biologie
- Oocytenontwikkeling
- In vitro fertilisatie
Achtergrond
- Onvruchtbaarheid treft ongeveer 20% van de koppels.
- Een derde van de vrouwen die een kankerbehandeling ondergaan, loopt het risico op premature ovariële insufficiëntie.
- Het identificeren van oocyten met ontwikkelingscapaciteit is cruciaal voor het verbeteren van vruchtbaarheidsbehandelingen.
- Deze studie richt zich op muis-oocyten die overgaan van het kiemblaasje naar metafase II.
Doel van de studie
- Om oocyten met ontwikkelingscompetentie te identificeren met behulp van een niet-invasieve methode.
- Om het potentieel van vrouwelijke gameten te evalueren door observatie van oocytbewegingen.
- Om plasmatische bewegingsprofielen te correleren met ontwikkelingscompetentie.
Gebruikte methoden
- Time-lapse imaging om de bewegingen van oocyten te monitoren.
- Particle image velocimetry (PIV) voor het analyseren van bewegingspatronen.
- Neuraal netwerkanalyse om gegevens te interpreteren.
- Vergelijking van bewegingsprofielen tussen competente en incompetente oocyten.
Belangrijkste resultaten
- Oocyten vertonen verschillende bewegingsprofielen die correleren met hun ontwikkelingscompetentie.
- De niet-invasieve methode maakt een real-time beoordeling van de oocytkwaliteit mogelijk.
- De bevindingen kunnen vruchtbehandelingsstrategieën verbeteren.
- Potentiële implicaties voor het verbeteren van de resultaten bij geassisteerde reproductieve technologieën.
Conclusies
- De studie demonstreert een betrouwbare, niet-invasieve benadering om de kwaliteit van oocyten te beoordelen.
- Time-lapse-imaging en PIV kunnen de ontwikkelingscompetentie effectief voorspellen.
- Deze methode kan bijdragen aan vorderingen binnen de reproductieve geneeskunde.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Managers
Het niet-invasief beoordelen van de ontwikkelingscompetentie van oocyten pakt een kritiek knelpunt in assistieve reproductieve technologieën aan door vroege selectie van levensvatbare gameten mogelijk te maken. Deze benadering ondersteunt het voorspellende vertrouwen in trajecten voor fertiliteitsbehandelingen door cytoplasmatische bewegingsprofielen te correleren met ontwikkelingsresultaten. De aanpasbaarheid van deze methode aan menselijke oocyten biedt translationele waarde voor het verbeteren van de IVF-slagingspercentages en het verminderen van uitval in klinische studies binnen de reproductieve geneeskunde.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar ontwikkelingscompetentie mogelijk als fenotypische readout voor de beoordeling van de oocytkwaliteit.
- Operationele waarde: Biedt een niet-invasieve, op beeldvorming gebaseerde proxy voor functionele validatie zonder dat fertilisatie of embryocultuur vereist is.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve snelheidsprofielen van cytoplasmatische beweging als meetbare output voor high-content screening.
- Operationele waarde: Standardiseert time-lapse imaging en PIV-analyse voor reproduceerbare, schaalbare oöcytevaluatie tussen laboratoria.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt ziekte-relevante systeemmodellering door de dynamiek van de beweging van oocyten te koppelen aan de ontwikkelingscompetentie in zoogdier-systemen.
- Operationele waarde: Faciliteert preklinische continuïteit van ontdekking naar validatie door middel van consistente, niet-invasieve readouts die toepasbaar zijn op menselijke oocyten.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in vroege discovery-workflows door een voorspellende assay te bieden voor de oocytenkwaliteit vóór de bevruchting, waardoor go/no-go-beslissingen in gametenselectie-pipelines mogelijk worden gemaakt.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetests van cytoplasmatische dynamiek als biomarkers voor ontwikkelingspotentieel.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve snelheidsmetrieken voor geautomatiseerde oocytenclassificatie.
- Analytics: Maakt gebruik van feed-forward neurale netwerken om time-lapse bewegingsgegevens om te zetten in scores voor de waarschijnlijkheid van competentie.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt bevindingen bij muis-oocyten met menselijke toepassingen via geconserveerde mechanismen van cytoplasmatische regulatie tijdens de rijping.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar imaging- en analyseplatform voor de beoordeling van de oocytenkwaliteit over verschillende soorten en klinische settings heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij de selectie van oocyten door bewegingspatronen te koppelen aan ontwikkelingsuitkomsten met een nauwkeurigheid van 91,03%.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde time-lapse-intervallen, PIV-verwerking en trainingsprotocollen voor neurale netwerken.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door de afhankelijkheid van invasieve assays en mislukte IVF-cycli te verminderen via preselectie van competente oocyten.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van oocyten in ART-workflows mogelijk, waardoor de kans op een succesvolle embryo-ontwikkeling toeneemt.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in time-lapse microscopie, particle image velocimetry en het trainen van neurale netwerken.
- Afhankelijk van gecontroleerde incubatiesystemen die 37°C en 5% CO₂ handhaven voor een consistente rijping van de oocyten.
- Vereist gestandaardiseerde beeldverwerving met intervallen van 8 minuten over een periode van 15 uur voor een betrouwbare profilering van de cytoplasmatische beweging.
- Omvat handmatige afbakening van de omtrek van de oocyt in CellPave-software, wat kan leiden tot variabiliteit tussen verschillende operators.
- Beperkt tot soorten met observeerbare cytoplasmatische bewegingen tijdens in vitro rijping; toepasbaarheid op mensen vereist validatie.
