Bestuderen van Diabetes door de ogen van een vis: Microdissection, visualisatie en analyse van de volwassen tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal therapieën
26 december 2017
Hier bespreken we een methode-protocol waarmee een gemakkelijke analyse van de volwassen tg(fli:EGFP) zebrafish retinale therapieën als een snel uitlezing in instellingen van lange termijn vasculaire pathologieën gekoppeld aan neoangiogenesis en structurele veranderingen.
Het algemene doel van dit dissectieprotocol voor de retinale vaatwand van volwassen zebravissen is om een snelle uitlezing te bieden in omgevingen met langdurige vasculaire pathologieën die verband houden met neoangiogenesis en structurele veranderingen via fluorescenctie of laser scanning confocale microscopie. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van microvasculaire complicaties te beantwoorden, zoals de ontwikkeling van diabetische retinopathie. Het grote voordeel van deze techniek is dat de hele retinovasculatuur kan worden gepresenteerd en geanalyseerd in fysiologische en ziekteprocessen zonder enige toepassing van intervasculaire fluorescentie op een relatief snelle en gestandaardiseerde manier.
Om te beginnen, breng zes milliliter vers bereide vier procent PFA PBS-oplossing per monster over in de putjes van zes putjesplaten. Nadat de volwassen zebravissen volgens het tekstprotocol zijn geëuthanaseerd, plaatst u ze op schone papieren handdoeken en laat ze drogen. Gebruik een scalpel en snijd de koppen achter het operculum.
Breng vervolgens de koppen direct over in de putjes van vers bereid fixeermiddel. Bewaar de platen met de viskoppen bij vier graden Celsius gedurende ten minste 24 uur om ervoor te zorgen dat het fixeermiddel de diepere retinale lagen doordringt. Vul een petrischaaltje met verwarmde twee procent agarose tot een derde en wacht tot het agar hard is.
Bedek de agarplaat met een X PBS om een werkruimte te creëren om de ogen te dissecteren. Breng het gefixeerde monster over in het petrischaaltje. En door de kop bij het snijvlak met een pincet vast te houden, steekt u een ander, samengepind pincet onder het oog in de orbitale holte.
Open het pincet onder het oog langzaam en grijpt het optisch zenuw. Scheur vervolgens voorzichtig en los het oog. Om een van de vier rectus- en twee oblique extraoculaire spieren die aan het oog zijn bevestigd, evenals resterend extraoculaire weefsel dat het oog met de orbitale holte verbindt, te verwijderen, houdt u het oog terug door een half gesloten pincet en grijpt u de structuur met het andere pincet. Gebruik een diametrische beweging om het zachtjes los te scheuren.
Gebruik vervolgens een 27 gauge wegwerpnaald om de cornea aan de buitenrand te doorboren. Gebruik door deze opening beide pincetten om de cornea vast te houden en scheer het lichtjes open. Werk vervolgens voorzichtig om een gecentreerde scheur van ongeveer de grootte van de respectieve pupil te maken.
Oefen druk uit op de zijde van de cornea van de oogbol bij de buitenrand van de cornea boven de iris. Dit zal een kleine deuk creëren en de lens naar de hoogte van de corneascheur duwen. Breng vervolgens de pincetten onder de lens en verwijder deze.
Keer vervolgens het oog ondersteboven, waarbij de optische zenuw naar boven wijst. Merk op dat de sclera en cornea verbonden zijn en de vezelachtige tunica van de oogbol vormen om de komvormige retina te beschermen. Deze schil, ook wel de corneosclera genoemd, spaart het gebied rond de optische zenuw uit.
Voeg op deze onderbreking een naald toe om een opening tussen de sclera en de retina te creëren. Gebruik vervolgens deze toegang met beide pincetten om voorzichtig de sclera axiaal in stroken te scheuren om de opening rond de optische zenuw te vergroten. Wees voorzichtig om de corneosclera intact te houden bij de overgang naar de omtrek van de corneale zijde.
Voordat u de corneosclera van het resterende intraoculaire weefsel verwijdert, probeert u alle verbindingen te verbreken, omdat bevestiging aan andere structuren een kritisch punt zal zijn. Houd de sclera met een pincet vast en grijpt u de optische zenuw met het andere en trekt u weg, verwijdert u de corneosclera volledig uit het oog en gooit u deze weg. Deze stap zal een komvormige structuur bieden die bestaat uit de uvea en retina die de retinale vaatwand bevat.
Maak vervolgens een scheuring in de choroïdale en RPE-laag door een 27 gauge naald zijwaarts naar de resterende kom te houden terwijl u de buitenste oppervlakte schraapt met de rand van de naaldtip. Gebruik de scheuring als toegangspunt om grip te krijgen op de choroïdale en RPE-laag en gebruik beide pincetten om deze in strepen te scheuren, waarbij de verbinding met de iris intact blijft. Breng vervolgens een pincet onder de iris en beweeg het in een circuit vanaf de buitenkant terwijl u spanning creëert door aan de ononderbroken choroïdale en RPE-laag te trekken en de gecombineerde structuur los te maken.
Als delen van de iris niet kunnen worden verwijderd en verbonden blijven met de komvormige retina na verwijdering van de choroïdale en RPE-laag, maakt u gebruik van een ander natuurlijk breekpunt dat het oog van de volwassen zebravis vertoont binnen de fotoreceptorlaag. Op een vergelijkbare manier wordt net gedemonstreerd om de iris te verwijderen. Schrob over de resterende komvormige retina om discontinueringen in de fotoreceptorlaag te induceren.
Gebruik vervolgens de gecreëerde toegang om de laag te verwijderen terwijl de mogelijke verbinding met de iris intact blijft. Breng vervolgens de pincetten onder de iris en ga verder in een circuit zoals eerder in deze video is gedemonstreerd om de gecombineerde structuur los te maken. Het is cruciaal om de iris op een verstandige manier los te koppelen van het onderliggende weefsel, omdat deze het fluoresceren direct boven de binnenste optische cirkel zal blokkeren tijdens het visualiseren van de vaten.
Een te directe aanpak kan leiden tot vaatbreuk. Gebruik vervolgens microdissectieveertang met een rechte twee en een halve millimeter snijkant om de optische zenuw zo dicht mogelijk bij de retina te snijden. Dit zorgt voor een betere vlakke montage van het weefsel.
Gebruik voor montage en visualisatie van de retinale vaatwand een X PBS om de gedissekteerde retina twee keer vijf minuten te wassen. Plaats een druppel PBS op een glazen plaatje. Gebruik vervolgens een laboratoriumspatel met een microlepel einde om de retina over te brengen in de druppel.
Houd met een pincet het weefsel op zijn plaats terwijl u een scalpel gebruikt om de komvormige structuur te snijden om een vlakke vier- of vijfbladige vorm te creëren, afhankelijk van de grootte van de retina. Zuig met een fijn stuk
Overzicht
Dit artikel presenteert een dissectieprotocol voor het analyseren van de retinale vasculaire structuur van volwassen tg(fli:EGFP) zebravissen. De methode biedt een snelle beoordeling van vasculaire pathologieën gerelateerd aan neoangiogenesis en structurele veranderingen.
Belangrijkste Studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Vasculair Biologie
- Zebravismodellen
Achtergrond
- Begrip van de retinale vasculaire structuur is cruciaal voor het bestuderen van microvasculaire complicaties.
- Diabetische retinopathie is een belangrijk gebied van zorg gekoppeld aan vasculaire veranderingen.
- Fluorescentie en laserscanning microscopie zijn essentieel voor visualisatie.
- Het protocol heeft tot doel de dissectieprocedure te standaardiseren voor betere reproduceerbaarheid.
Doel van het Onderzoek
- Om een snelle en effectieve methode te bieden voor het analyseren van retinale vasculaire structuur.
- Om onderzoek naar lange-termijn vasculaire pathologieën te faciliteren.
- Om het begrip van neoangiogenesis in retinale ziekten te verbeteren.
Gebruikte Methoden
- Bereiding van fixeermiddel en het euthanaseren van zebravissen.
- Dissectie van het oog om retinale structuren te isoleren.
- Gebruik van pincetten en naalden voor zorgvuldige manipulatie van weefsels.
- Visualisatie van gedissekteerde retina met behulp van fluorescentie microscopie.
Belangrijkste Resultaten
- Het protocol maakt een uitgebreide analyse van de retinale vasculaire structuur mogelijk.
- Gestandaardiseerde methoden verhogen de reproduceerbaarheid in onderzoek.
- Faciliteert het onderzoek naar vasculaire veranderingen in verschillende ziektemodellen.
- Biedt inzichten in de mechanismen van diabetische retinopathie.
Conclusies
- Het dissectieprotocol is effectief voor het bestuderen van retinale vasculaire structuur.
- Het draagt bij aan het begrip van vasculaire pathologieën in zebravismodellen.
- Deze methode kan worden toegepast in verschillende onderzoeksomgevingen in vasculaire biologie.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
This protocol enables rapid, standardized assessment of retinal vascular pathology in a genetically tractable model, supporting early-stage target validation for diabetic retinopathy and related vasculopathies. By providing quantitative visualization of neoangiogenesis and structural vascular changes, it enhances predictive confidence in preclinical de-risking strategies. The approach aligns with discovery-stage needs for mechanistic insight and translational biomarker alignment in neurovascular disease research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to retinal vascular integrity and neoangiogenic pathways.
- Operational Value: Supports biological de-risking through standardized visualization of vasculopathy phenotypes in adult zebrafish.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by linking vascular readouts to disease-modifying target engagement.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated retinal tissue for high-content imaging assays that quantify vascular architecture changes.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility through standardized dissection and mounting procedures minimizing vessel breakage.
- Scalability: Enables rapid (<20 min) sample processing for screening campaigns in vascular biology.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Provides disease-relevant system for modeling long-term vascular pathologies linked to diabetic retinopathy.
- Mechanistic De-risking: Allows analysis of vascular layer-specific changes (inner vs. outer retina) to clarify pathophysiological mechanisms.
- Biomarker Alignment: Supports quantification of vascular parameters (e.g., vessel branching, inner optic circle integrity) as translational readouts.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through preclinical validation, particularly for neurovascular and metabolic disease programs.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and target validation via direct visualization of EGFP-labeled retinal vasculature.
- Screening: Delivers quantitative, fluorescence-based outputs suitable for automated image analysis and compound effect assessment.
- Analytics: Enables measurement of vascular parameters (e.g., main vessel count, arcade formation, IOC integrity) to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling human-relevant vascular pathologies in a genetic model.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable vascular phenotyping platform applicable across multiple vasculopathy indications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in retinal vasculopathy models.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization across labs through defined dissection and visualization steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early vascular phenotype data, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on vascular safety and efficacy signals.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish handling, microsurgery, and tissue dissection.
- Dependent on fluorescence or laser scanning confocal microscopy infrastructure.
- Necessitates standardization of fixation, dissection, and mounting techniques across users.
- Adaptation considerations include alternative transgenic lines or disease models affecting retinal integrity.
- Practical limitations include tissue fragility and risk of vascular damage during dissection if not performed with precision.
