Met behulp van fylogenetische analyse te onderzoeken van eukaryotische Gene oorsprong
14 augustus 2018
Een methode van de bouw van een fylogenetische boom op basis van volgorde homologie van snoepjes van eukaryoten en SemiSWEETs van prokaryoten wordt beschreven. Fylogenetische analyse is een nuttig instrument voor het verklaren van de evolutionaire verwantschap tussen homologe proteïnen of genen uit verschillende organisme groepen.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van fytogenetische veld, zoals hoe om sequenties te verzamelen en hoe om het juiste berekeningsmodel te selecteren. Het grootste voordeel van deze techniek is dat het heel gemakkelijk te leren is. Over het algemeen kunnen degenen die nieuw zijn met deze methode worstelen, simpelweg omdat ze niet weten hoe ze de gegevens moeten verwerken vanwege een gebrek aan basiskennis van de principes en methoden van fylogenie.
Deze methode werd voor het eerst ontwikkeld toen we de uitlijning van eukaryotische SWEET-genen analyseerden. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat er een groot aantal keuzes en instellingen zijn voor verschillende aspecten van de uitlijning. Begin deze procedure met de selectie van 35 kandidaat SWEET-eiwitten uit eencellige eukaryote organismen zoals beschreven in het tekstprotocol.
Lign de 35 SWEET-sequenties door ze in te voeren in Clustal Omega. Kopieer en plak de eiwitsequenties in FASTA-formaat in het invoervak of upload een sequentiebestand in FASTA-formaat. Geef aan dat het een aminozuursequentie is door op het pictogram onder het uitklapmenu in de sectie stap één te klikken.
Specificeer het uitvoerformaat en andere parameters in de sectie stap twee indien nodig. Voor deze studie, stel het uitvoerformaat in als Clustal zonder nummer en laat de andere parameters op de standaardinstellingen. In de meeste gevallen werken de standaardparameters goed zonder enige specificatie.
Dien en voer de uitlijning in in de sectie stap drie. Het kan enkele seconden tot minuten duren voordat de uitlijning is voltooid. In het Resultaatoverzichtspaneel, klik met de rechtermuisknop op de link onder de Uitlijning in CLUSTAL-formaat en sla de uitgelijnde sequenties op als 35.clustal.
Om het uitlijningsresultaatbestand in BioEdit te openen, klikt u op Sequence en selecteert u Edit Mood in het eerste uitklapmenu op het hoofdpaneel van BioEdit. Klik vervolgens op Edit Residues in het submenu. Selecteer de uitstaande sequenties aan de linkerkant van de uitlijning met de cursor en klik op de Verwijder-pictogram onder het Bewerk-menu om de geselecteerde sequenties te verwijderen.
Selecteer en verwijder de sequenties aan de rechterkant van het eerste MtN3-speekseldomein en sla de bijgesneden eerste MtN3-speekseldomeinsequenties op als 35-1.fas. Verwijder op dezelfde manier de linker- en rechterkantsequenties van het tweede MtN3-speekseldomein en sla het op als 35-2.fas. De eerste en de tweede MtN3-speekseldomeinsequenties kunnen worden voorspeld met ritme of TMHMM van tevoren.
Open het bestand 35-1. fas met MEGA en klik op Uitlijnen wanneer gevraagd. Onder het Bewerk-menu klikt u op Alles selecteren.
Klik vervolgens op Selecteer sequenties. De namen en sequenties van de taxa worden in het zwart geselecteerd. Kies Kopieer uit het Bewerk-menu om de sequenties naar het klembord te kopiëren en plak vervolgens de gekopieerde sequenties in een doc-bestand.
Vervang in het doc-bestand alle nummertekens door het groter-dan-teken en verwijder vervolgens alle niet-gerelateerde tekens om ze om te zetten in FASTA-formaat. Voeg 1 toe aan het einde van elke taxonnaam om ze te markeren als de eerste MtN3-speekseldomeinsequenties. Verwerk de tweede MtN3-speekseldomeinsequenties op dezelfde manier en voeg 2 toe na elke taxonnaam.
Combineer nu de eerste en tweede MtN3-speekseldomeinsequenties in FASTA-formaat in een doc-bestand. Om dit te doen, laadt u de gecombineerde sequenties opnieuw in Clustal Omega en lijnt u de sequenties zoals eerder. Sla het resultaat op als 35realigned.clustal.
Open het 35realigned. clustal-bestand in BioEdit. Verwijder de oneven aminozuurresiduen aan beide uiteinden van de uitgelijnde sequenties en sla de sequenties vervolgens op als 35realigned.fas.
Klik op Ja wanneer gewaarschuwd dat sommige niet-standaardtekens niet kunnen worden opgeslagen. Open 35realigned. fas in MEGA.
Klik op het Gegevensmenu en kies Exporteer Uitlijning. Sla vervolgens de uitlijning op in POP-formaat als 35. volgende voor later gebruik in MR Base.
Klik ondertussen op het Models-pictogram op het hoofdpaneel van MEGA. Kies Vind Beste DNA-eiwitmodellen en klik op OK in het pop-upvenster. Klik op Compute om het modelzoekproces te starten.
Er wordt een nieuw voortgangspaneel geopend. Dit proces duurt enkele minuten tot enkele dagen, afhankelijk van de complexiteit van de geladen sequenties en de prestaties van de computer. Er wordt een tabel geopend met de resultaten nadat het modelzoekproces is voltooid.
De kleinste BIC-score wordt als eerste vermeld, gevolgd door een reeks verschillende modellen met geleidelijk toenemende BIC-scores. Het eerste model LG+G+F met de kleinste BIC-score is het aanbevolen model voor de ML-boom op basis van het 35realigned. fas-bestand.
Klik vervolgens op het Phylogeny-pictogram op het hoofdpaneel van MEGA. Klik op Bouw/Test de Maximum Likelihood-boom en klik vervolgens op Ja op het pop-uppaneel. Er wordt een nieuw venster geopend met verschillende parameters die moeten worden opgegeven.
Stel eerst de bootstrapwaarde in de test van de fylogenetische box in. 500 of 1.000 is in de meeste gevallen voldoende. Kies onder het Substitutiemodel aminozuur als het soort substitutie.
Het doel van het kiezen van een substitutiemodel is om de ware verschil tussen sequenties te schatten op basis van hun huidige toestand. Selecteer LG met Freqs Model in het Model en Methode-vak. Selecteer in het Vak Tarieven en Patronen gamma verdeeld om tarievenvariatie over sites te beschrijven, zoals meer gewicht geven aan veranderingen op langzaam evoluerende sites.
Selecteer in het Gegevenssubsetvak volledige verwijdering om alle kolommen met koppeltekens te verwijderen. Houd alle andere parameters in hun standaardtoestand. Na specificatie van deze parameters, klikt u op het Compute-pictogram om de berekening
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het construeren van een fylogenetische stamboom op basis van sequentiehomologie van SWEETs van eukaryoten en SemiSWEETs van prokaryoten. De techniek is gebruiksvriendelijk en helpt bij het begrijpen van evolutionaire relaties tussen homologe eiwitten of genen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Fylogenetica
- Proteïne-evolutie
- Sequentieanalyse
Achtergrond
- Fylogenetische analyse helpt bij het verklaren van evolutionaire verwantschap.
- Het begrijpen van SWEET- en SemiSWEET-eiwitten is essentieel voor evolutionaire studies.
- Nieuwkomers kunnen moeite hebben met de dataverwerking door een gebrek aan fundamentele kennis.
- Visuele demonstraties verbeteren het begrip van de methode.
Doel van de studie
- Om een heldere methodologie te bieden voor het construeren van fylogenetische stambomen.
- Om de selectie van passende computationele modellen te vergemakkelijken.
- Om onderzoekers te ondersteunen bij het verzamelen en analyseren van sequentiegegevens.
Gebruikte methoden
- Selectie van 35 kandidaat-SWEET-eiwitten uit unicellulaire eukaryoten.
- Alignment van eukaryote SWEET-genen.
- Gebruik van verschillende instellingen voor alignment-aspecten.
- Visuele demonstraties om gebruikers door het proces te leiden.
Belangrijkste resultaten
- De methode vereenvoudigt het proces van fylogenetische analyse.
- Het biedt een kader voor het begrijpen van eiwitevolutie.
- Gebruikers kunnen sequentiegegevens effectief verwerken met de juiste begeleiding.
- Visuele hulpmiddelen verbeteren de leerresultaten aanzienlijk.
Conclusies
- Deze methode is toegankelijk voor onderzoekers die nieuw zijn in de fylogenetica.
- Het slaat een brug tussen theoretische kennis en praktische toepassing.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op deze fundamentele methodologie.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Managers
Fylogenetische analyse van eiwitfamilies, zoals SWEET-transporters, maakt mechanische risicoreductie mogelijk in de vroege fase van ontdekking door evolutionaire oorsprongen en functionele divergentie te verduidelijken. Deze aanpak ondersteunt targetvalidatie door geconserveerde domeinen te onderscheiden van lineagespecifieke innovaties, waardoor ambiguïteit bij het genereren van hypothesen wordt verminderd. Inzichten in genfusiegebeurtenissen informeren translationele biomarkerstrategieën en de selectie van preklinische modellen voor transportgerelateerde pathways.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door de domeinarchitectuur te herleiden naar prokaryote en archaeële voorouders.
- Operationele waarde: Verduidelijkt de validatie van functionele targets via de evolutionaire conservering van MtN3-spekseldomeinen in SWEET-eiwitten.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de triage van de portfolio door evolutionair beperkte regio's te identificeren die minder vatbaar zijn voor compensatiemechanismen.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor door domeingrenzen te definiëren voor de constructie van chimerische eiwitten.
- Operationele waarde: Maakt assay-standaardisatie mogelijk door sequentie-uitgelijnde MtN3-domeinen als kwantitatieve read-outs voor transporteractiviteit te gebruiken.
- Schaalbaarheid: Faciliteert platformhergebruik via Clustal Omega- en MEGA-pipelines voor screening van de SWEET-familie over verschillende soorten heen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Continuïteit: Verbindt ontdekking met preklinische validatie door domeinconservatie over eukaryoten en prokaryoten te bevestigen.
- Afstemming van Biomarkers: Ondersteunt mechanistische risicoreductie door divergentie van het SWEET-domein te correleren met fenotypische resultaten van suikertransport.
- Risico-gecorrigeerde Vooruitgang: Informeert go/no-go-beslissingen door evolutionaire beperkingen op de mutationele tolerantie van het target te benadrukken.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm, van het testen van doelhypotheses tot de identificatie van lead-verbindingen, door evolutionaire context te bieden voor de eiwitfunctie.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothese-toetsing door te verduidelijken of de waargenomen SWEET-functie voortkomt uit verticale overerving of horizontale genoverdracht.
- Screening: Beschrijft de geschiktheid van assays door uitgelijnde MtN3-domeinen te gebruiken als stabiele, kwantificeerbare eenheden voor high-throughput screening.
- Analytics: Benadrukt de resultaten van Maximum Likelihood en Bayesian Inference als statistische maten voor clade-betrouwbaarheid voor de prioritering van targets.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt met preklinische continuïteit door domeinconservatie te valideren als een proxy voor functionele preservering in ziektemodellen.
- Enterprise Reuse: Kaderen de Clustal Omega-MEGA-MrBayes workflow als een herbruikbare capaciteit voor het verminderen van risico's bij transporterfamilie-onderzoeken over verschillende projecten heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen bij de selectie van targets door evolutionaire risicoreductie van mechanistische aannames.
- Operationele waarde: Standaardisatie en reproduceerbaarheid via vaste aligneringsparameters en modelselectiecriteria (LG+G+F).
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen door het risico op falen in een late fase door een onjuiste toekenning van het targetmechanisme te verminderen.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering op basis van evolutionaire constraint-scores afgeleid van fylogenetische clade-ondersteuning.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in sequentie-alignment, fylogenetische modeltesten en boominterpretatie.
- Is afhankelijk van toegang tot Clustal Omega, MEGA en MrBayes voor alignment en boomconstructie.
- Maakt standaardisatie tussen teams noodzakelijk voor protocollen voor sequentiecuratie en modelselectie.
- Omvat overwegingen voor adaptatie bij toepassing op niet-transportereiwitfamilies met verschillende domeinarchitecturen.
- Wordt beperkt door het onvermogen om de functionele equivalentie van afgeleide ancestrale toestanden te bevestigen zonder experimentele validatie.
