Name: Rab10 fosforylering detectie door LRRK2 activiteit met behulp van SDS-pagina met een fosfaat-bindende-Tag (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Leer Rab10-fosforylering detecteren door LRRK2-activiteit met SDS-PAGE en fosfaat-bindende tag. Deze methode schat stoichiometrie en helpt bij het bestuderen van mutaties in Parkinson-onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij bedanken Dr. Takeshi Iwatsubo (Universiteit van Tokyo, Japan) voor het vriendelijk verstrekken de plasmiden codering van 3xFLAG-LRRK2 WT en mutanten. Wij danken ook Dr. Dario Alessi (Universiteit van Dundee, UK) voorzien van kandidatuur MLi-2 en de plasmide codering HA-Rab10. Dit werk werd gesteund door de Japan-maatschappij voor de promotie van wetenschap (JSPS) KAKENHI Grant nummer JP17K08265 (G.I.).

<ol><li>Sveinbjornsdottir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+symptoms+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">The clinical symptoms of Parkinson's disease.</a> J. Neurochem. 139 (Suppl. 1), 318-324 (2016).</li>
<li>Hernandez, D. G., Reed, X., Singleton, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+in+Parkinson+disease%3A+Mendelian+versus+non-Mendelian+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Genetics in Parkinson disease: Mendelian versus non-Mendelian inheritance.</a> J. Neurochem. 139 (Suppl. 1), 59-74 (2016).</li>
<li>Paisán-Ruíz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+the+gene+containing+mutations+that+cause+PARK8-linked+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease.</a> Neuron. 44 (4), 595-600 (2004).</li>
<li>Zimprich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+LRRK2+cause+autosomal-dominant+parkinsonism+with+pleomorphic+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology.</a> Neuron. 44 (4), 601-607 (2004).</li>
<li>Gilks, W. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+LRRK2+mutation+in+idiopathic+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">A common LRRK2 mutation in idiopathic Parkinson's disease.</a> Lancet. 365 (9457), 415-416 (2005).</li>
<li>Satake, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+association+study+identifies+common+variants+at+four+loci+as+genetic+risk+factors+for+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome-wide association study identifies common variants at four loci as genetic risk factors for Parkinson's disease.</a> Nat. Genet. 41 (12), 1303-1307 (2009).</li>
<li>Simón-Sánchez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+association+study+reveals+genetic+risk+underlying+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome-wide association study reveals genetic risk underlying Parkinson's disease.</a> Nat. Genet. 41 (12), 1308-1312 (2009).</li>
<li>Klein, C., Ziegler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imputation+of+sequence+variants+for+identification+of+genetic+risks+for+Parkinson%27s+disease%3A+a+meta-analysis+of+genome-wide+association+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Imputation of sequence variants for identification of genetic risks for Parkinson's disease: a meta-analysis of genome-wide association studies.</a> Lancet. 377 (9766), 641-649 (2011).</li>
<li>Cookson, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+leucine-rich+repeat+kinase+2+%28LRRK2%29+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) in Parkinson's disease.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11 (12), 791-797 (2010).</li>
<li>Ozelius, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRK2+G2019S+as+a+Cause+of+Parkinson%E2%80%99s+Disease+in+Ashkenazi+Jews%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">LRRK2 G2019S as a Cause of Parkinson’s Disease in Ashkenazi Jews.</a> N. Engl. J. Med. 354 (4), 424-425 (2006).</li>
<li>Lesage, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRK2+G2019S+as+a+Cause+of+Parkinson%E2%80%99s+Disease+in+North+African+Arabs%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">LRRK2 G2019S as a Cause of Parkinson’s Disease in North African Arabs.</a> N. Engl. J. Med. 354 (4), 422-423 (2006).</li>
<li>Bouhouche, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRK2+G2019S+Mutation%3A+Prevalence+and+Clinical+Features+in+Moroccans+with+Parkinson%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Parkinsons.+Dis%22%5BJournal%5D)">LRRK2 G2019S Mutation: Prevalence and Clinical Features in Moroccans with Parkinson's Disease.</a> Parkinsons. Dis. , 1-7 (2017).</li>
<li>West, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease-associated+mutations+in+leucine-rich+repeat+kinase+2+augment+kinase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease-associated mutations in leucine-rich repeat kinase 2 augment kinase activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (46), 16842-16847 (2005).</li>
<li>Ito, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTP+binding+is+essential+to+the+protein+kinase+activity+of+LRRK2%2C+a+causative+gene+product+for+familial+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">GTP binding is essential to the protein kinase activity of LRRK2, a causative gene product for familial Parkinson's disease.</a> Biochemistry. 46 (5), 1380-1388 (2007).</li>
<li>Steger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoproteomics+reveals+that+Parkinson%27s+disease+kinase+LRRK2+regulates+a+subset+of+Rab+GTPases%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Phosphoproteomics reveals that Parkinson's disease kinase LRRK2 regulates a subset of Rab GTPases.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Ito, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phos-tag+analysis+of+Rab10+phosphorylation+by+LRRK2%3A+a+powerful+assay+for+assessing+kinase+function+and+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Phos-tag analysis of Rab10 phosphorylation by LRRK2: a powerful assay for assessing kinase function and inhibitors.</a> Biochem. J. 473, 2671-2685 (2016).</li>
<li>Kinoshita, E., Kinoshita-Kikuta, E., Takiyama, K., Koike, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphate-binding+tag%2C+a+new+tool+to+visualize+phosphorylated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Phosphate-binding tag, a new tool to visualize phosphorylated proteins.</a> Mol. Cell. Proteomics. 5 (4), 749-757 (2006).</li>
<li>Database, J. S. E. Using a Hemacytometer to Count Cells. J. Vis. Exp. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells">https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells</a> (2017).</li>
<li>Ni, D., Xu, P., Gallagher, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27038386">Immunoblotting and Immunodetection.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. (114), 10.8.1-10.8.37 (2016).</li>
<li>Reith, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GSK2578215A%3B+a+potent+and+highly+selective+2-arylmethyloxy-5-substitutent-N-arylbenzamide+LRRK2+kinase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem.+Lett%22%5BJournal%5D)">GSK2578215A; a potent and highly selective 2-arylmethyloxy-5-substitutent-N-arylbenzamide LRRK2 kinase inhibitor.</a> Bioorg. Med. Chem. Lett. 22 (17), 5625-5629 (2012).</li>
<li>Fell, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MLi-2%2C+a+potent%2C+selective+and+centrally+active+compound+for+exploring+the+therapeutic+potential+and+safety+of+LRRK2+kinase+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">MLi-2, a potent, selective and centrally active compound for exploring the therapeutic potential and safety of LRRK2 kinase inhibition.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 355, 397-409 (2015).</li>
<li>Dzamko, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+LRRK2+kinase+activity+leads+to+dephosphorylation+of+Ser%28910%29%2FSer%28935%29%2C+disruption+of+14-3-3+binding+and+altered+cytoplasmic+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Inhibition of LRRK2 kinase activity leads to dephosphorylation of Ser(910)/Ser(935), disruption of 14-3-3 binding and altered cytoplasmic localization.</a> Biochem. J. 430 (3), 405-413 (2010).</li>
<li>Thévenet, J., Pescini Gobert, R., Hooft van Huijsduijnen , R., Wiessner, C., Sagot, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+LRRK2+expression+points+to+a+functional+role+in+human+monocyte+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Regulation of LRRK2 expression points to a functional role in human monocyte maturation.</a> PLoS One. 6 (6), e21519(2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier beschrijven we een facile en robuuste methode voor het opsporen van Rab10 fosforylering door LRRK2 endogene niveau op basis van de methodologie van de P-tag. Omdat het op dit moment beschikbare antilichaam tegen gefosforyleerd Rab10 alleen met overexpressie eiwitten15 werkt, is de huidige methode met behulp van P-tag SDS-pagina de enige manier om te beoordelen van endogene niveaus van Rab10 fosforylering. Bovendien kan de huidige methode de schatting van de stoichiometrie van fosforylering va...

PD is één van de meest voorkomende neurodegeneratieve ziekten, voornamelijk op het gebied van Dopaminerge neuronen in de veroorzaakt, resulterend in een dysfunctie van de motor systemen in ouderen1. Terwijl de meeste patiënten PD in een sporadische manier ontwikkelen, zijn er gezinnen overnemen van de ziekte. Mutaties in meerdere genen zijn bevonden om te worden gekoppeld aan FPD2. Een van de oorzakelijke genen voor FPD is LRRK2, waarin acht missense mutaties (N1437H, R1441C/G/H/S, Y1699C, G2019S en I2020T) gekoppeld aan een dominant erfelijke FPD genaamd PARK8 dusver gerapporteerde3,4,5. Verschillende genoom-brede vereniging studies (GWAS) van sporadische PD-patiënten hebben ook genomic variaties op de LRRK2 locus geïdentificeerd als een risicofactor voor PD, suggereert dat de afwijking in de functie van LRRK2 een veelvoorkomende oorzaak van neurodegeneratie in beide sporadische is en PARK8 FPD6,7,8.
LRRK2 is een groot eiwit (2,527 aminozuren), die bestaat uit een rijk aan leucine herhalen domein, een Ras van de GTP-bindende van complexe eiwitten (ROC) domein, een C-terminal van ROC (COR) domein, een serine/threonine proteïne kinase domein, en een WD40 herhalen domein9. De acht FPD mutaties zoeken in deze functionele domeinen; N1437H en R1441C/G/H/S in het domein van de ROC, Y1699C in het domein van het CVDR, G2019S en I2020T in het domein kinase. Aangezien de G2019S mutatie, die het vaakst vlindertje mutatie PD patiënten10,11,12, verhoogt het kinaseactiviteit van LRRK2 door 2-3 vouwen in vitro13, is het veronderstelde dat de abnormale toename van fosforylering van de LRRK2 substrate(s) giftig voor zenuwcellen is. Het is echter onmogelijk om te bestuderen of de fosforylatie van fysiologisch relevante LRRK2 substraten is gewijzigd in familiale/sporadische PD-patiënten als gevolg van het gebrek aan methoden evalueren het in patiënt afgeleide monsters.
Proteïne Fosforylatie is over het algemeen herkend door immunoblotting of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) met behulp van antilichamen specifiek herkennen de gefosforyleerd staat van eiwitten of door massaspectrometrische analyse. Echter, de voormalige strategie niet soms worden toegepast wegens de moeilijkheden bij het creëren van fosforylering-specifieke antilichamen. Metabole labeling van cellen met radioactieve fosfaat is een andere optie te onderzoeken fysiologische niveaus van fosforylering fosforylering-specifieke antilichamen niet dadelijk beschikbaar zijn. Echter het vereist een grote hoeveelheid radioactief materiaal en daarom gaat sommige gespecialiseerde apparatuur voor stralingsbescherming14. Massaspectrometrische analyse is gevoeliger in vergelijking met deze immunochemical methoden en werd populair in het analyseren van proteïne fosforylatie. Echter, de bereiding van de monsters is tijdrovende en dure instrumenten nodig zijn voor de analyse.
Een subset van de familie van de Rab GTPase met inbegrip van Rab10 en Rab8 werd onlangs gemeld als directe fysiologische substraten voor LRRK2 op basis van het resultaat van een grootschalige phosphoproteomic analyse15. We toonden dan dat Rab10 fosforylering door FPD mutaties in muis embryonale fibroblasten en in de longen van knockin muizen16werd verhoogd. In dit verslag, kozen we om een polyacrylamide-gelelektroforese voor natrium dodecyl sulfaat (SDS-pagina) in dienst-op basis van de methode waarbij een P-tag molecuul mede gepolymeriseerde in SDS-pagina gelen (P-tag SDS-PAGE is) voor het opsporen van de endogene niveaus van fosforylering van de Rab10, omdat een hooggevoelige antilichaam specifiek voor gefosforyleerd Rab10 ontbrak nog. We hebben gefaald om te ontdekken de fosforylatie van endogene Rab8 te wijten aan de slechte selectiviteit van momenteel beschikbare antilichamen voor totale Rab8. Daarom besloten hebben we om zich te concentreren op de Rab10 fosforylering. LRRK2 kinaseenzym Rab10 op Thr73 zoeken in het midden van de regio zeer geconserveerde "Wissel II". Hoge instandhouding van de fosforylatie sites onder Rab eiwitten misschien wel een van de redenen waarom phosphospecific antilichamen herkennen van afzonderlijke Rab eiwitten zijn moeilijk om te maken.
De fosforylering van de Rab8A door LRRK2 remt de binding van Rabin8, een guanine nucleotide uitwisseling factor (GEF), die Rab8A activeert door de afhankelijke BBP met GTP15uit te wisselen. Fosforylering van de Rab10 en Rab8A door LRRK2 remt ook de binding van BBP-dissociatie-remmers (GDIs), die essentieel voor de activering van Rab eiwitten zijn door winning van BBP-gebonden Rab eiwitten uit membranen15. Collectief, is het veronderstelde dat de fosforylatie van Rab eiwitten door LRRK2 hen activering verhindert hoewel de exacte moleculaire mechanisme en fysiologische gevolgen van de fosforylatie onduidelijk blijven.
P-tag SDS-pagina werd uitgevonden door Kinoshita et al. in 2006: bij deze methode wordt acrylamide covalent gekoppeld is met P-tag, een molecule vastleggen van fosfaten met hoge affiniteit, die copolymerized in SDS-pagina gels17. Omdat de moleculen van de P-tag in een SDS-pagina gel retard selectief elektroforetische mobiliteit van gefosforyleerd eiwitten, P-tag SDS-pagina gefosforyleerd eiwitten kan scheiden van degenen die niet phosphorylated (Figuur 1). Als de eiwit-of-interest is phosphorylated op meerdere residuen, worden een ladder van bands overeenkomt met differentieel gefosforyleerd formulieren nageleefd. In het geval van Rab10 observeren wij slechts één verschoven band, die aangeeft dat de Rab10 is phosphorylated alleen op Thr73. Het grote voordeel van P-tag SDS-pagina over immunoblotting met fosforylatie-specifieke antilichamen is dat gefosforyleerd Rab10 kan worden gedetecteerd door immunoblotting met niet-fosforylatie-specifieke antilichamen (d.w.z., herkennen totale Rab10) Na overgedragen worden op membranen, dat is over het algemeen meer specifieke, gevoelige en beschikbaar uit commerciële/academische bronnen. Een ander voordeel van het gebruik van de P-tag SDS-pagina is dat men benaderende raming van de stoichiometrie van fosforylering verkrijgen kan, wat onmogelijk door immunoblotting met fosforylatie-specifieke antilichamen of metabole labeling van cellen met radioactieve is fosfaten.
Afgezien van het gebruik van goedkope P-tag acrylamide en een aantal kleine wijzigingen daaraan, volgt de huidige methode voor de detectie van Rab10 fosforylering door LRRK2 een algemeen protocol voor immunoblotting.Daarom moet het eenvoudig en gemakkelijk uitvoerbare in de laboratoria waar immunoblotting is een gebruikelijke praktijk, met alle soorten monsters met inbegrip van gezuiverde eiwitten, cel lysates en weefsel homogenates.

```html
<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS)</td><td>zelfgemaakt</td><td></td><td>150 mM NaCl, 8 mM Na2HPO4-12H2O, 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4 in MilliQ water en gesteriliseerd door autoclaving</td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Nacalai Tesque</td><td>31320-34</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdisodiumwaterstoffosfaat 12-Water</td><td>Wako</td><td>196-02835</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchloride</td><td>Wako</td><td>163-03545</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumdiwaterstoffosfaat</td><td>Wako</td><td>169-04245</td><td></td></tr><tr><td>2,5% Trypsine (10X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4549</td><td>Verdun 10-voudig met steriele DPBS voor het bereiden van werkoplossing</td></tr><tr><td>Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (DMEM)</td><td>Wako</td><td>044-29765</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal runderserum</td><td>BioWest</td><td>S1560</td><td>Verhit geïnactiveerd bij 56 &deg;C gedurende 30 min</td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine (100X)</td><td>Wako</td><td>168-23191</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Wako</td><td>342-01375</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxide</td><td>Wako</td><td>198-13765</td><td></td></tr><tr><td>Polyethyleenimine HCl MAX, Lineair, Mw 40.000 (PEI MAX 40000)</td><td>PolySciences, Inc.</td><td>24765-1</td><td>Staloplossing werd bereid in 20 mM HEPES-NaOH pH 7,0 bij 1 mg/mL en de pH werd vervolgens aangepast tot 7,0 met NaOH</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide</td><td>Wako</td><td>045-28335</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>STAR</td><td>RSP-THA500G</td><td></td></tr><tr><td>Zoutzuur</td><td>Wako</td><td>080-01066</td><td></td></tr><tr><td>Polyoxyethyleen(10) Octylfenylether</td><td>Wako</td><td>160-24751</td><td>Equivalent aan Triton X-100</td></tr><tr><td>Ethyleenglycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraazijnzuur (EGTA)</td><td>Wako</td><td>346-01312</td><td></td></tr><tr><td>Natriumorthovanadate(V)</td><td>Wako</td><td>198-09752</td><td></td></tr><tr><td>Natriumfluoride</td><td>Kanto Chemical</td><td>37174-20</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Glycerofosforzuur Dinatriumzout Pentahydraat</td><td>Nacalai Tesque</td><td>17103-82</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyrofosfaat decahydraat</td><td>Kokusan Chemical</td><td>2113899</td><td></td></tr><tr><td>Microcystine-LR</td><td>Wako</td><td>136-12241</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Wako</td><td>196-00015</td><td></td></tr><tr><td>Complete EDTA-vrije proteaseremmercocktail</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>Los een tablet op in 1 mL water, die kan worden bewaard bij -20 &deg;C gedurende een maand. Gebruik het bij 1:50 verdunning voor cellyse</td></tr><tr><td>Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23200</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfaat</td><td>Nacalai Tesque</td><td>31607-65</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Wako</td><td>075-00616</td><td></td></tr><tr><td>Broomfenolblauw</td><td>Wako</td><td>021-02911</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>Kanto Chemical</td><td>25099-00</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Wako</td><td>056-06967</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Wako</td><td>136-01837</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaatbindende tag acrylamide</td><td>Wako</td><td>AAL-107</td><td>P-tag acrylamide</td></tr><tr><td>40% (w/v) acrylamideoplossing</td><td>Nacalai Tesque</td><td>06119-45</td><td>Acrylamid:Bis = 29:1</td></tr><tr><td>Tetramethylethyleendiamine (TEMED)</td><td>Nacalai Tesque</td><td>33401-72</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfaat (APS)</td><td>Wako</td><td>016-08021</td><td>10% (w/v) oplossing werd bereid door het poeder van ammoniumpersulfaat op te lossen in MilliQ water</td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Wako</td><td>166-04831</td><td></td></tr><tr><td>Mangaanchloride tetrahydraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3634</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Prestained Standard</td><td>Bio-Rad</td><td>1610374, 1610373, 1610377</td><td>Molecuulgewichtmarker gebruikt in het protocol</td></tr><tr><td>WIDE-VIEW Prestained Protein Size Marker III</td><td>Wako</td><td>230-02461</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Nacalai Tesque</td><td>17109-64</td><td></td></tr><tr><td>Amersham Protran NC 0.45</td><td>GE Healthcare</td><td>10600007</td><td>Nitrocellulosemembraan</td></tr><tr><td>Durapore Membraanfilter</td><td>EMD Millipore</td><td>GVHP00010</td><td>PVDF-membraan</td></tr><tr><td>Filterpapieren nr. 1</td><td>Advantec</td><td>00013600</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Nacalai Tesque</td><td>28322-72</td><td></td></tr><tr><td>Azijnzuur</td><td>Wako</td><td>017-00251</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td>polyoxyethyleensorbitanmonolauraat</td></tr><tr><td>Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA)</td><td>Wako</td><td>345-01865</td><td></td></tr><tr><td>Melkeiwitpoeder</td><td>Difco Laboratories</td><td>232100</td><td></td></tr><tr><td>Immunostar</td><td>Wako</td><td>291-55203</td><td>ECL-oplossing (Normale gevoeligheid)</td></tr><tr><td>Immunostar LD</td><td>Wako</td><td>290-69904</td><td>ECL-oplossing (Hoge gevoeligheid)</td></tr><tr><td>CBB-kleuroplossing</td><td>zelfgemaakt</td><td></td><td>1 g CBB R-250, 50% (v/v) methanol, 10% (v/v) azijnzuur in 1 L MilliQ water</td></tr><tr><td>CBB R-250</td><td>Wako</td><td>031-17922</td><td></td></tr><tr><td>CBB-ontkleuringsoplossing</td><td>zel

rab10 fosforylering detectie door lrrk2 activiteit met behulp van sds-pagina met een fosfaat-bindende-tag

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Mutaties in leucine-rijke herhalen kinase 2 (LRRK2) hebben aangetoond dat het familiale Parkinson's disease (FPD) worden gekoppeld. Aangezien abnormale activering van het kinaseactiviteit van LRRK2 is betrokken bij de pathogenese van PD, is het essentieel een methode om te evalueren van de fysiologische niveaus van het kinaseactiviteit van LRRK2 vast te stellen. Recente studies is gebleken dat LRRK2 kinaseenzym leden van de Rab GTPase-familie, waaronder Rab10, onder fysiologische omstandigheden. Hoewel de fosforylatie van endogene Rab10 door LRRK2 in gekweekte cellen kon worden opgespoord door massaspectrometrie, is het moeilijk om het te ontdekken door immunoblotting vanwege de slechte gevoeligheid van momenteel beschikbare fosforylatie-specifieke antilichamen voor geweest Rab10. Hier beschrijven we een eenvoudige methode voor het opsporen van de endogene niveaus van fosforylering van de Rab10 door LRRK2 van gebaseerd op immunoblotting met behulp van elektroforese natrium dodecyl sulfaat polyacrylamidegel (SDS-PAGE) gecombineerd met een fosfaat-bindende tag (P-tag), die N-(5-(2-aminoethylcarbamoyl)pyridin-2-ylmetyl) -N,N',N'- tris (pyridin-2-yl-methyl) - 1,3 - diaminopropan-2-ol. Dit protocol biedt niet alleen een voorbeeld van de methode met behulp van de P-tag maar maakt het ook mogelijk de beoordelingvan hoe mutaties alsmede remmer behandeling/administratie of andere factoren veranderen de stroomafwaartse signalering van LRRK2 in cellen en weefsels .

Overexpressie systeem: Fosforylatie van HA-Rab10 door 3 × vlag-LRRK2 in de HEK293 cellen:
HEK293 cellen werden transfected met 0.266 µg HA-Rab10 wild-type en 1.066 µg 3 × vlag-LRRK2 (wild-type, kinase-inactieve mutant (K1906M) of FPD mutanten). Rab10 fosforylatie werd onderzocht door P-tag SDS-pagina gevolgd door immunoblotting met behulp van een anti-HA antilichaam (Figuur 2). 10 µg van eiwitten zijn ...

De huidige studie beschrijft een eenvoudige methode voor het opsporen van endogene niveaus van Rab10 fosforylering door leucine-rijke herhalen kinase 2.

Rab10 fosforylering detectie door LRRK2 activiteit met behulp van SDS-pagina met een fosfaat-bindende-Tag

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Het algemene doel van dit experiment is om de Rab10-fosforylering door LRRK2 te detecteren met behulp van SDS-PAGE met een fosfaatbindend tag. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van Parkinson-onderzoek, zoals hoe ziektemutaties in LRRK2 de Rab10-fosforylering beïnvloeden. Het grote voordeel van deze techniek is dat men een ruwe schatting kan maken van de stoichiometrie van Rab10-fosforylering met behulp van een eenvoudige western blot.Veel van de stappen van dit protocol zijn vrij standaard en worden voldoende beschreven in het tekstprotocol dat bij deze video hoort. Hier willen we u de stappen laten zien die het meest profiteren van visuele instructie. Bereid platen met getransfecteerde HEK293-cellen zoals beschreven in het tekstprotocol.Met de platen op ijs, aspireer en gooi het medium weg. Voeg vervolgens voorzichtig twee milliliter DPBS toe aan de hoek van elke plaat en schud de platen om de oplossing te verspreiden. Verwijder vervolgens en gooi de DPBS weg.Voeg vervolgens aan elke plaat 100 microliter lysbuffeer toe. Kantel de plaat en gebruik een schraper om het buffeer te verspreiden en het cellysaat vrij te maken. Aspireer vervolgens de lysaten en breng ze over naar microfugebuisjes die op ijs zijn voorgekoeld en wacht 10 minuten.Verzamel vervolgens de cellysaten zonder deeltjes door de buisjes te centrifugeren en breng de supernatanten over naar nieuwe buisjes op ijs. Meet vervolgens de eiwitconcentraties van de geklaarde lysaten met behulp van de Bradford-assay. Bereid voor de concentratiegegevens 100 microliter monsters van de lysaten voor voor de gelanalyse.Bereid dikkere lysaten voor om endogene Rab10 te meten in vergelijking met overgeëxpreseed hemagglutinine Rab10. Voltooi de bereiding van de monsters door ze vijf minuten bij 100 graden Celsius te incuberen. Bewaar de monsters vervolgens onder min 20 graden Celsius tot ze nodig zijn, tot maximaal zes maanden of langer.Bereid om te beginnen de SDS-PAGE-cellen volgens het tekstprotocol. Laad vervolgens de gel in de tank en bevestig deze met binderclips. Vul vervolgens de tank met runningbuffer en verwijder de luchtbellen in de putjes en onder de gel met een naald die aan een spuit is bevestigd.Voeg nu mangaanchloride toe aan de monsters en centrifugeer ze om de neerslagen te verwijderen. Laad vervolgens de gel met gelijke volumes monster, 10 microgram eiwit om overgeëxpreseed hemagglutinine Rab10 te analyseren of 30 microgram eiwit om endogene Rab10 te analyseren. Laad de lege banen met monsterbuffer met mangaanchloride.Voeg ook de molecuulgewichtmarker toe met buffer en mangaanchloride om het hetzelfde volume te maken als de monsters. Start nu het gel bij 50 volt. Nadat het monster is gestapeld, verhoog de spanning naar 120 om scheiding te krijgen.Wanneer de kleurstoffront de bodem van de gels bereikt, zet de spanning uit. Was vervolgens de gel drie keer als volgt. Laad de scheidingsgel in een bad met schone overdrachtsbuffer met toegevoegd EDTA en SDS.Laat het vervolgens 10 minuten op een shaker op kamertemperatuur schudden. Voer na drie wasbeurten nog een wasbeurt uit met overdrachtsbuffer met toegevoegd SDS maar zonder EDTA. Breng vervolgens de gel over met behulp van een natte tank.Laad de tank in een schuimdoos gevuld met ijs koud water, sluit de tank aan op een stroomvoorziening en start de overdracht. Een lange overdracht met efficiënte koeling is essentieel voor de procedure. Controleer na de overdracht de overdracht door de membraan te kleuren met Ponceau S, gevolgd door een wasbeurt in TBST volgens het tekstprotocol.Breng vervolgens een blok aan. Dompel de blot in melkachtige TBST en schud de blot een uur op een shaker bij kamertemperatuur. Verwijder vervolgens en gooi de blokkeeroplossing weg en breng de primaire antilichaamoplossing aan.Schud de membraan nu een nacht bij vier graden Celsius. Verwijder de volgende dag de primaire antilichaamoplossing. Was vervolgens de membraan drie keer met vers TBST zoals eerder.Na de wasbeurten dompelt u de blot in secundaire antilichaamoplossing en incubeert u het membraan op een rocker gedurende ongeveer een uur bij kamertemperatuur. Was na de incubatie de membraan nogmaals drie keer met TBST. Ontwikkel nu het membraan.Voeg een milliliter ECL-oplossing toe aan een groot vel plasticfolie. Leg vervolgens de membraan in de ECL en draai het snel om om beide kanten nat te maken. Til vervolgens het membraan op en laat het weglekken.Na het weglekken laat u een rand gedurende ongeveer vijf seconden op een papieren handdoek rusten om overtollig oplossing weg te wikkelen. Wikkel vervolgens het membraan in stijf doorzichtig film zonder rimpels en breng het over naar een zwarte lade voor beeldvorming. HEK293-cellen werden getransfecteerd met hemagglutinine Rab10 wild-type en 3xFLAG-LRRK2.Wild-type kinase die inactieve familiemutaties van LRRK2 bij familiaire Parkinson-ziekte werden getest. Co-overexpressie van LRRK2 en Rab10 resulteerde in een grote bandverschuiving in de P-tag-gel. In tegenstelling hiermee resulteerde co-expressie met een kinase-inactieve mutant in geen enkele verandering in de mobiliteit van Rab10, wat de kinase als de oorzaak van de bandverschuiving aantoont.Zoals verwacht, verhoogden alle familiale PD-mutaties ook de bandverschuiving. Het P-tag-gelsysteem werd ook gebruikt om muis 3T3-Swiss albino embryonale fibroblastencellen te analyseren die werden behandeld met een LRRK2-remmer. De bandverschuiving die overeenkomt met gefosforyleerd endogene Rab10 verdween wanneer de cellen werden behandeld met GSK2578215A.Dezelfde test werd ook uitgevoerd met behulp van humane A549-cellen. In deze experimenten werd de werkzaamheid van de LRRK2-remmer gevalideerd met behulp van de anti-p serine 935 LRRK2-antilichaam, een goed gevestigde marker voor LRRK2-remming. Eenmaal onder de knie, heeft deze techniek slechts 14 minuten extra nodig in vergelijking met een reguliere western blotting-procedure, wat is

rab10-phosphorylation-detection-lrrk2-activity-using-sds-page-with

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Leucine Rich Herhaal Kinase 2 is een grote multidomein kinase, mutaties in die de meest voorkomende genetische oorzaak van de ziekte van Parkinson. Analyse van de kinase-activiteit van dit eiwit heeft zich bewezen als een essentieel instrument in het begrijpen van de biologie en de disfunctie van dit eiwit te zijn. In dit...

Het testen van de kinase-activiteit van LRRK2 In vitro</em

This video demonstrates a sensitive quantification technique of protein phosphorylation using a single-molecule pull-down assay. The functionalization of polyethylene glycol-biotin and the use of labeled antibodies increases the detection of phosphorylated tyrosine with specificity.

Single-Molecule Pull-Down Assay for Protein Phosphorylation Analysis: A High Throughput Technique to Quantify Protein Phosphorylation in Cell Lysate

Leucine rich repeat kinases 1 en 2 (LRRK1 en LRRK2) zijn multidomain eiwitten die zowel GTPase en kinase domeinen coderen en die gefosforyleerd zijn in cellen. Hier presenteren we een protocol om LRRK1 en LRRK2 label in cellen met 32p orthofosfaat, waardoor een middel om hun algemene cellulaire fosforylering te meten.

Metabole Labeling van leucine rich repeat Kinasen 1 en 2 met radioactieve fosfaat

Hier beschrijven we een procedure die een gedetailleerde analyse mogelijk maakt van de fosforyleringsafhankelijke activering van de IRF3-transcriptiefactor. Dit wordt bereikt door de combinatie van een hoge resolutie SDS-PAGE en een native-PAGE gekoppeld aan immunoblots met behulp van meerdere fosfospecifieke antilichamen.

Een hoge resolutie methode om Fosforylatie-afhankelijke activering van IRF3 Monitor

Peptide competitiebepalingen worden veel gebruikt in een verscheidenheid aan moleculaire en immunologische experimenten. Dit document beschrijft een gedetailleerde methode voor een in vitro oligopeptide-concurrerende kinase-analyse en de bijbehorende validatieprocedures, die nuttig kunnen zijn om specifieke fosforyleringsplaatsen te vinden.

Oligopeptide Concurrentie Assay voor Fosforylatie Site Bepaling

Mutaties in het leucine rijke reinase 2 gen (LRRK2) veroorzaken erfelijke de ziekte van Parkinson. We hebben een eenvoudige en robuuste methode ontwikkeld voor het beoordelen van LRRK2-gecontroleerde fosforylatie van Rab10 bij menselijke perifere bloedneutrofielen. Dit kan helpen bij het identificeren van personen met een verhoogde LRRK2 kinase traject activiteit.

Menselijke perifere bloed neutrofiele isolatie voor het ondervragen van de Parkinson Geassocieerde LRRK2 Kinase Pathway door de beoordeling van Rab10 fosforylatie

De doelstelling van dit protocol is label, verrijken en identificeren van substraten voor proteïne kinase CK2 uit een complexe biologische monster zoals een cel lysate of weefsel homogenaat. Deze methode maakt gebruik van unieke aspecten van CK2 biologie voor dit doel.

Identificatie van nieuwe CK2 Kinase substraten met behulp van een veelzijdige benadering van de biochemische

We kenmerkten een nieuwe kinase eiwit met behulp van robuuste biochemische benaderingen: Western Blot analyse met een dedicated specifieke antilichaam op verschillende cel lijnen en weefsels, interacties door coimmunoprecipitation experimenten, kinase activiteit gedetecteerd door westerse Vlek gebruikend een phospho-specifiek antilichaam en door γ [32P] ATP etikettering.

Karakterisering op moleculair niveau met behulp van robuuste biochemische benaderingen van een nieuwe kinase proteïne

Dit protocol beschrijft een snelle en gevoelige kwantificatie van Förster resonantie energieoverdracht (FRET) sensorgegevens met een maat draagbare FRET analyzer. De inrichting werd gebruikt voor maltose binnen een kritisch temperatuurtraject dat detectiegevoeligheid maximaliseert, zodat praktische en efficiënte evaluatie van het suikergehalte detecteren.

Uiterst gevoelige en Rapid fluorescentiedetectie met een Portable FRET Analyzer

Deze studie beschrijft biofysische, biochemische en moleculaire technieken om de chaperone activiteit van Escherichia coli HdeB karakteriseren onder zure pH-omstandigheden. Deze werkwijzen zijn met succes toegepast voor andere zuur-beschermende chaperones zoals HdeA en kan worden aangepast om te werken voor andere chaperones en stresscondities.

Detectie van de pH-afhankelijke activiteit van<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; en<em&gt; In Vivo</em

Leer Rab10-fosforylering detecteren door LRRK2-activiteit met SDS-PAGE en fosfaat-bindende tag. Deze methode schat stoichiometrie en helpt bij het bestuderen van mutaties in Parkinson-onderzoek.

Rab10 fosforylering detectie door LRRK2 activiteit met behulp van SDS-pagina met een fosfaat-bindende-Tag

Meer video's verkennen