Rab10 fosforylering detectie door LRRK2 activiteit met behulp van SDS-pagina met een fosfaat-bindende-Tag
14 december 2017
De huidige studie beschrijft een eenvoudige methode voor het opsporen van endogene niveaus van Rab10 fosforylering door leucine-rijke herhalen kinase 2.
Het algemene doel van dit experiment is om de Rab10-fosforylering door LRRK2 te detecteren met behulp van SDS-PAGE met een fosfaatbindend tag. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van Parkinson-onderzoek, zoals hoe ziektemutaties in LRRK2 de Rab10-fosforylering beïnvloeden. Het grote voordeel van deze techniek is dat men een ruwe schatting kan maken van de stoichiometrie van Rab10-fosforylering met behulp van een eenvoudige western blot.
Veel van de stappen van dit protocol zijn vrij standaard en worden voldoende beschreven in het tekstprotocol dat bij deze video hoort. Hier willen we u de stappen laten zien die het meest profiteren van visuele instructie. Bereid platen met getransfecteerde HEK293-cellen zoals beschreven in het tekstprotocol.
Met de platen op ijs, aspireer en gooi het medium weg. Voeg vervolgens voorzichtig twee milliliter DPBS toe aan de hoek van elke plaat en schud de platen om de oplossing te verspreiden. Verwijder vervolgens en gooi de DPBS weg.
Voeg vervolgens aan elke plaat 100 microliter lysbuffeer toe. Kantel de plaat en gebruik een schraper om het buffeer te verspreiden en het cellysaat vrij te maken. Aspireer vervolgens de lysaten en breng ze over naar microfugebuisjes die op ijs zijn voorgekoeld en wacht 10 minuten.
Verzamel vervolgens de cellysaten zonder deeltjes door de buisjes te centrifugeren en breng de supernatanten over naar nieuwe buisjes op ijs. Meet vervolgens de eiwitconcentraties van de geklaarde lysaten met behulp van de Bradford-assay. Bereid voor de concentratiegegevens 100 microliter monsters van de lysaten voor voor de gelanalyse.
Bereid dikkere lysaten voor om endogene Rab10 te meten in vergelijking met overgeëxpreseed hemagglutinine Rab10. Voltooi de bereiding van de monsters door ze vijf minuten bij 100 graden Celsius te incuberen. Bewaar de monsters vervolgens onder min 20 graden Celsius tot ze nodig zijn, tot maximaal zes maanden of langer.
Bereid om te beginnen de SDS-PAGE-cellen volgens het tekstprotocol. Laad vervolgens de gel in de tank en bevestig deze met binderclips. Vul vervolgens de tank met runningbuffer en verwijder de luchtbellen in de putjes en onder de gel met een naald die aan een spuit is bevestigd.
Voeg nu mangaanchloride toe aan de monsters en centrifugeer ze om de neerslagen te verwijderen. Laad vervolgens de gel met gelijke volumes monster, 10 microgram eiwit om overgeëxpreseed hemagglutinine Rab10 te analyseren of 30 microgram eiwit om endogene Rab10 te analyseren. Laad de lege banen met monsterbuffer met mangaanchloride.
Voeg ook de molecuulgewichtmarker toe met buffer en mangaanchloride om het hetzelfde volume te maken als de monsters. Start nu het gel bij 50 volt. Nadat het monster is gestapeld, verhoog de spanning naar 120 om scheiding te krijgen.
Wanneer de kleurstoffront de bodem van de gels bereikt, zet de spanning uit. Was vervolgens de gel drie keer als volgt. Laad de scheidingsgel in een bad met schone overdrachtsbuffer met toegevoegd EDTA en SDS.
Laat het vervolgens 10 minuten op een shaker op kamertemperatuur schudden. Voer na drie wasbeurten nog een wasbeurt uit met overdrachtsbuffer met toegevoegd SDS maar zonder EDTA. Breng vervolgens de gel over met behulp van een natte tank.
Laad de tank in een schuimdoos gevuld met ijs koud water, sluit de tank aan op een stroomvoorziening en start de overdracht. Een lange overdracht met efficiënte koeling is essentieel voor de procedure. Controleer na de overdracht de overdracht door de membraan te kleuren met Ponceau S, gevolgd door een wasbeurt in TBST volgens het tekstprotocol.
Breng vervolgens een blok aan. Dompel de blot in melkachtige TBST en schud de blot een uur op een shaker bij kamertemperatuur. Verwijder vervolgens en gooi de blokkeeroplossing weg en breng de primaire antilichaamoplossing aan.
Schud de membraan nu een nacht bij vier graden Celsius. Verwijder de volgende dag de primaire antilichaamoplossing. Was vervolgens de membraan drie keer met vers TBST zoals eerder.
Na de wasbeurten dompelt u de blot in secundaire antilichaamoplossing en incubeert u het membraan op een rocker gedurende ongeveer een uur bij kamertemperatuur. Was na de incubatie de membraan nogmaals drie keer met TBST. Ontwikkel nu het membraan.
Voeg een milliliter ECL-oplossing toe aan een groot vel plasticfolie. Leg vervolgens de membraan in de ECL en draai het snel om om beide kanten nat te maken. Til vervolgens het membraan op en laat het weglekken.
Na het weglekken laat u een rand gedurende ongeveer vijf seconden op een papieren handdoek rusten om overtollig oplossing weg te wikkelen. Wikkel vervolgens het membraan in stijf doorzichtig film zonder rimpels en breng het over naar een zwarte lade voor beeldvorming. HEK293-cellen werden getransfecteerd met hemagglutinine Rab10 wild-type en 3xFLAG-LRRK2.
Wild-type kinase die inactieve familiemutaties van LRRK2 bij familiaire Parkinson-ziekte werden getest. Co-overexpressie van LRRK2 en Rab10 resulteerde in een grote bandverschuiving in de P-tag-gel. In tegenstelling hiermee resulteerde co-expressie met een kinase-inactieve mutant in geen enkele verandering in de mobiliteit van Rab10, wat de kinase als de oorzaak van de bandverschuiving aantoont.
Zoals verwacht, verhoogden alle familiale PD-mutaties ook de bandverschuiving. Het P-tag-gelsysteem werd ook gebruikt om muis 3T3-Swiss albino embryonale fibroblastencellen te analyseren die werden behandeld met een LRRK2-remmer. De bandverschuiving die overeenkomt met gefosforyleerd endogene Rab10 verdween wanneer de cellen werden behandeld met GSK2578215A.
Dezelfde test werd ook uitgevoerd met behulp van humane A549-cellen. In deze experimenten werd de werkzaamheid van de LRRK2-remmer gevalideerd met behulp van de anti-p serine 935 LRRK2-antilichaam, een goed gevestigde marker voor LRRK2-remming. Eenmaal onder de knie, heeft deze techniek slechts 14 minuten extra nodig in vergelijking met een reguliere western blotting-procedure, wat is
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een methode voor het detecteren van endogene Rab10-fosforylering door LRRK2 met behulp van SDS-PAGE met een fosfaatbindende tag. Deze techniek is van groot belang voor het begrijpen van de impact van LRRK2-mutaties in onderzoek naar de ziekte van Parkinson.
Belangrijkste Onderdeelen van de Studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Biochemie
Achtergrond
- Rab10 is een substraat van LRRK2, een eiwit dat betrokken is bij de ziekte van Parkinson.
- Inzicht in de fosforylering van Rab10 kan inzicht bieden in de rol van LRRK2 bij neurodegeneratie.
- Huidige methoden om fosforylering te bestuderen kunnen complex en tijdrovend zijn.
- Deze studie heeft tot doel het detectieproces te vereenvoudigen.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een eenvoudige methode voor het detecteren van Rab10-fosforylering.
- Het beoordelen van hoe LRRK2-mutaties de Rab10-fosforyleringsniveaus beïnvloeden.
- Het bieden van een visuele gids voor de belangrijkste experimentele stappen.
Gebruikte methoden
- Transfectie van HEK293-cellen met LRRK2.
- Gebruik van SDS-PAGE voor eiwit-scheiding.
- Toepassing van een fosfaatbindende tag voor detectie.
- Western blot-analyse voor stoichiometrische schatting.
Belangrijkste resultaten
- De methode maakt het mogelijk om de stoichiometrie van de Rab10-fosforylering te schatten.
- Visuele instructies verbeteren het begrip van het protocol.
- De resultaten geven de impact van LRRK2-mutaties op de fosforyleringsniveaus aan.
- Deze aanpak kan verder onderzoek naar de ziekte van Parkinson faciliteren.
Conclusies
- De ontwikkelde methode is effectief voor het bestuderen van Rab10-fosforylering.
- Het biedt een waardevol instrument voor onderzoekers die LRRK2-gerelateerde mechanismen bestuderen.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op deze techniek om therapeutische targets te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Deze methode maakt de detectie mogelijk van endogene Rab10-fosforylering door LRRK2, een sleutelgebeurtenis in de pathogenese van de ziekte van Parkinson, waarbij gebruik wordt gemaakt van een fosfaatbindende tag om de beperkingen van fosforyleringsspecifieke antilichamen te overwinnen. Het biedt een snelle, antilichaam-onafhankelijke benadering om de LRRK2-kinasedactiviteit en de effectiviteit van remmers in cellulaire modellen te beoordelen, wat bijdraagt aan target-validatie en mechanische risicoreductie bij de ontwikkeling van geneesmiddelen tegen neurodegeneratie. De techniek faciliteert de kwantitatieve vergelijking van fosforyleringstoestanden over genetische en farmacologische perturbaties heen, wat input biedt voor go/no-go-beslissingen in LRRK2-gerichte programma's.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar de fosforylering van LRRK2-substraten mogelijk om Rab10 te valideren als een functionele read-out van kinaseactiviteit in ziekterelateerde modellen.
- Operationele waarde: Biedt een eenvoudige immunoblot-gebaseerde assay om wild-type en pathogene LRRK2-mutanten te vergelijken voor targetbevestiging.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve mobiliteitsverschuivingen die proportioneel zijn aan de fosforyleringsstoichiometrie, waardoor dosis-responsanalyse van LRRK2-remmers mogelijk wordt.
- Operationele waarde: Vereist enkel standaard SDS-PAGE en western blot-infrastructuur, wat een snelle aanpassing in verschillende laboratoria voor compound screening mogelijk maakt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Detecteert endogene Rab10-fosforylering in meerdere celtypen (HEK293, A549, muizenfibroblasten), wat de translationele relevantie tussen verschillende soorten ondersteunt.
- Operationele waarde: Valideert de target-interactie van LRRK2-remmers (bijv. GSK2578215A) via het verlies van het fosforyleringssignaal, wat inzicht geeft in de preklinische farmacodynamiek.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen de cascade voor de validatie van LRRK2-targets, van initiële hypothesetoetsing in overexpressiesystemen tot endogene pathway-modulatie in ziektemodellen, ter ondersteuning van de progressie van lead-identificatie naar de selectie van preklinische kandidaten.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt mechanistische risicoreductie door LRRK2-kinaseactiviteit te koppelen aan de fosforyleringsstatus van Rab10 in cellulaire contexten.
- Screening: Maakt beoordeling van compound-effecten op fosforyleringsniveaus mogelijk met behulp van gestandaardiseerde eiwitinputs (10–30 µg) en mobility shift-uitlezingen.
- Analytica: Biedt semi-kwantitatieve stoichiometrie-schattingen via band shift-intensiteit, wat vergelijking tussen condities zonder massaspectrometrie faciliteert.
- Translationeel onderzoek: Demonstreert inhibitor-gevoeligheid in menselijke cellen en knaagdiellen, wat de translationele continuïteit van LRRK2-Rab10-signalering ondersteunt.
- Enterprise-hergebruik: Herbruikbaar in verschillende cellijnen, weefsels en perturbatietypen (mutanten, inhibitoren, activatoren) als een modulair detectieplatform.
Operationele impact & impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit in LRRK2-signalering door direct bewijs van substraatfosforylering te leveren.
- Operationele waarde: Voegt slechts 14 minuten toe aan standaard western blotting, waardoor de impact op de doorvoer wordt geminimaliseerd terwijl de datarijkdom wordt vergroot.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door LRRK2-modulatie te correleren met functionele downstream-signalering.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van LRRK2-modulatoren mogelijk op basis van de betrokkenheid van het doelpuntpad.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in cellyse, de opzet van kinase-assays en de optimalisatie van western blots.
- Afhankelijk van de toegang tot fosfaatbindend tag-reagens en mangaanchloride voor gelbereiding.
- Vereist standaardisatie van de eiwitbelading (10 µg voor overexpressie, 30 µg voor endogeen Rab10) over de experimentele groepen.
- Aanpassing aan primaire weefsels kan optimalisatie van de lysecondities vereisen om fosforyleringstoestanden te behouden.
- Beperkt tot het detecteren van mobiliteitsshifts geïnduceerd door fosforylering; identificeert geen specifieke fosforyleringsplaatsen zonder aanvullende methoden.
