Een Protocol voor Real-time 3D één deeltje Tracking
3 januari 2018
Deze gegevens van het protocol, de bouw en de exploitatie van een real-time 3D één deeltje tracking Microscoop staat tracking nanoschaal fluorescerende probes hoge diffusive snelheden en lage foton graaf tarieven.
Het algemene doel van dit protocol is om een real-time, 3D, enkeldeeltjes volgmicroscoop te implementeren. Het grote voordeel van deze techniek is dat een enkele diffunderende nano-schaalobject continu kan worden gemonitord met tijdelijke resolutie beperkt door fotonen. Deze techniek kan helpen om belangrijke vragen op het gebied van virologie te beantwoorden, zoals het volgen van een enkele virion door het hele infectieproces.
Bereid het apparaat voor op een optische tafel. Deze opstelling is klaar voor kalibratie. Belangrijke componenten zijn een 488 nanometer solid-state laser, twee elektro-optische defletoren langs het pad van de straal, een afstembare akoestische gradiëntlens en een monstertafel met micro- en nano-positioneringssystemen.
Dit schema van de opstelling geeft aanvullende details. Hier is het pad van de laserstraal naar de monsterstandaard. De elektro-optische defletoren en de afstembare akoestische lens bevinden zich langs het pad van de straal.
Deze apparaten drijven dynamisch de laserstip op de monsterstandaard aan. Fotonen van het monster worden geteld door een lawinefotodiode. Een camera bewaakt de positie van het deeltje.
De positie van het monster wordt ingesteld met behulp van micro- en nanocontrollers. Een field programmable gate array bestuurt de laserspot, de berekening van de real-time positie van het deeltje, feedback van de standaard en het tellen van fotonen. Er moeten twee monsters worden voorbereid.
De eerste vereist 190 nanometer fluorescente kralen, verdund in fosfaatgebufferd zoutoplossing. Gebruik een dekglas om een vast deeltjesmonster voor te bereiden. Plaats 400 microliter van de kralenoplossing op het dekglas.
Maak nu het vrij bewegende deeltjesmonster. Hiervoor zijn 110 nanometer fluorescente kralen verdund in water nodig. Maak een vrij bewegend deeltjesmonster door 400 microliter van de oplossing op een dekglas te plaatsen.
Neem het vaste deeltjesmonster naar de microscoop om te monteren. Het monster staat op de XY nano-positioneringssysteem. Schakel de laser, de fotodetector, de controllers voor de straallijnelementen en voor de positioneringssystemen in.
Laat de Piezo nano-positioneringssysteem in een gesloten lus lopen. Verwijder vervolgens de fluorescentie-emissiefilter voor de fotodetector. Verander vervolgens de z-positie van het monster met het micro-positioneringssysteem.
Terwijl de positie varieert, gebruikt u de fotodetector om de intensiteit van de reflectie van de laser te bewaken. Maximaliseer de intensiteit om het brandpunt van de objectieflens te identificeren. Wanneer het monster in het brandpunt staat, vervangt u het fluorescentie-emissiefilter.
Werk nu met de computerbesturingssoftware. Gebruik aangepaste software om het monster raster te scannen. Stel eerst een groot rasterbereik in, het verschil tussen start en einde.
Hier is het bereik 10 micrometer in Y en 10 micrometer in X.Stel ook een grote stappengrootte in in elke richting. Hier 200 nanometer. Stel beide Z-velden in op de eerder geïdentificeerde positie van het brandpunt.
Door op scannen te drukken, start u de rasterscan. Start de scan. De software bestuurt de elektro-optische defletoren in een nachtelijke tour, verzamelt tellingen van de fotodetector, bestuurt de nano-positioneringssysteem en voert positieberekeningen uit.
De scan zal een deeltje vinden dat identificeerbaar is in de software door een platafluorescentie. Voor elke site in de scan bepaalt de software ook schattingen van de positie van het deeltje in X en Y, relatief tot het centrum van het rasterscan van de elektro-objectdefletor. Nadat het deeltje is gevonden, verkleint u het rasterbereik eromheen tot twee micrometer in X en Y. Verklein ook de stappengrootte voor beide tot 100 nanometer.
Voeg een scanbereik toe in de Z-richting van twee micrometer om de fluorescente focus te omlijsten. Stel de Z-stappengrootte in op 200 nanometer. Start de 3D rasterscan om de fluorescente focus te vinden.
De gegevens die uit de scan worden geproduceerd, tonen het brandpunt voordat de afstembare akoestische gradiëntlens wordt ingeschakeld. Ga door met het werken met de instelling van de afstembare akoestische lens binnen de besturingssoftware. Klik eerst op verbinden, vervolgens op inschakelen.
Ga naar het gedeelte puls- en gatingbesturing, verander de uitvoertriggermodus van RGB naar multi-plane. Verander het vervolgens terug naar RGB om de uitvoerfase te kunnen wijzigen. Gebruik de schuifregelaars om de uitvoerfase in te stellen tussen nul graden, 90 graden en 270 graden.
Ga vervolgens naar het gedeelte frequentiebesturing. Selecteer daar een resonantiefrequentie van 68.500 hertz. Ga naar de bovenkant van het scherm en klik op geavanceerd.
Kies vervolgens het tabblad instellingen. Zoek op het nieuwe scherm de maximale frequentie van de nulkolom. Pas het aan om het frequentiebereik van de zoekopdracht te wijzigen.
Klik op opslaan kalibratie, vervolgens op kalibratie afsluiten. Keer terug naar frequentiebesturing en verander de resonantiefrequentie. Verander deze onmiddellijk terug naar 68.500 hertz om de kalibratie van kracht te laten worden.
In het gedeelte amplitudebesturing gebruikt u de schuifregelaar om de amplitude langzaam te verhogen tot 35%. Klik vervolgens op resonantie vergrendelen. Wanneer de frequentie is vergrendeld, klikt u op resonantie ontgrendelen. Keer terug naar de rasterscansoftware.
Voer twee micrometer rasterscanbereiken in die gecentreerd zijn op het deeltje in X en Y. Gebruik een stappengrootte van 100 nanometer. Centreer het deeltje in een vier micrometerbereik in Z, met een stappengrootte van 200 nanometer. In het resulterende scanbeeld is het verlichtingsgebied dat het deeltje vertegenwoordigt ongeveer één micrometer breed.
Basierend hierop past u de XY-schaalparameter aan, zodat de geschatte posities in X en Y variëren van negatief 0,5 tot 0,5 micrometer. Na een soortgelijke procedure met de Z-schaal stelt u de nano-positioneringssysteem in op de nulpositie. Schakel de stroom uit naar de nano-positioneringssysteem voordat u verdergaat.
Vervang het vaste deeltjesmonster door
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft de implementatie van een real-time, 3D, single particle tracking microscoop die is ontworpen voor het monitoren van fluorescerende probes op nanoschaal. Deze techniek maakt continue observatie van individuele diffunderende objecten mogelijk, zelfs onder fotonbeperkte omstandigheden.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschappelijk gebied
- Microscopie
- Single particle tracking
- Virologie
Achtergrond
- Real-time tracking van nanoschaal-deeltjes is cruciaal in diverse wetenschappelijke vakgebieden.
- Het begrijpen van de dynamiek van individuele virionen kan inzicht bieden in infectieprocessen.
- Deze techniek verbetert het vermogen om deeltjes met hoge diffusiesnelheden te bestuderen.
- Beperkingen in de fotontelling worden aangepakt door middel van geavanceerde optische opstellingen.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een microscoop die individuele deeltjes in realtime kan volgen.
- Het faciliteren van de studie naar virale infecties door individuele virionen te monitoren.
- Het verbeteren van de temporele resolutie bij het volgen van nanoscopische objecten.
Gebruikte methoden
- Constructie van een 3D-microscoop voor single particle tracking.
- Gebruik van een solid-state laser van 488 nanometer.
- Integratie van elektro-optische deflectoren en een instelbare akoestische gradiëntlens.
- Kalibratie van de apparatuur op een optische tafel met nauwkeurige positionering.
Belangrijkste resultaten
- De microscoop volgt nanometrische fluorescente probes met succes.
- Aangetoonde capaciteit om deeltjes te monitoren bij lage fotontellingen.
- Maakte continue observatie van individuele virionen tijdens infectie mogelijk.
- Bood inzichten in de dynamiek van virale processen.
Conclusies
- Dit protocol stelt een robuuste methode vast voor real-time particle tracking.
- Het opent nieuwe wegen voor onderzoek in de virologie en aanverwante vakgebieden.
- De techniek kan ons begrip van viraal gedrag aanzienlijk verbeteren.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Real-time 3D single particle tracking maakt continue monitoring van nanostructuur-objecten onder foton-beperkte condities mogelijk, waarmee een kritisch gat wordt gedicht in de observatie van snelle, driedimensionale cellulaire processen. Deze mogelijkheid ondersteunt mechanistische risicoreductie in de vroege ontdekkingsfase door hoogresolutie dynamische data te leveren over moleculaire interacties en transportroutes. De methode vergroot het voorspellend vertrouwen bij target-validatie en lead-identificatie door kwantitatieve, reproduceerbare spatiotemporele data te leveren die essentieel zijn voor geïnformeerde go/no-go-beslissingen in onderzoek naar drug delivery en virologie.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door individuele virionen of nanodeeltjes met een hoge spatiotemporele resolutie te volgen tijdens infectieprocessen.
- Operationele waarde: Maakt functionele targetvalidatie mogelijk door directe observatie van moleculaire dynamiek in bijna-natuurlijke omgevingen.
- Predictieve waarde: Ondersteunt portfolio-triage door het genereren van kwantitatieve gegevens over deeltjesdiffusie, binding en transportkinetiek onder fysiologisch relevante omstandigheden.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert kwantitatieve metingen van afhankelijke variabelen (positie, traject, diffusiecoëfficiënt) die essentieel zijn voor assay-standaardisatie en hit-bevestiging.
- Operationele waarde: Maakt de preparatie van gevalideerde biologische systemen voor downstream screening mogelijk via nauwkeurige 3D-lokalisatie en tracking van fluorescerende probes.
- Schaalbaarheid: Ondersteunt hergebruik van het platform door een robuuste single-excitation/single-detection lay-out en gekalibreerde elektro-optische en akoestische gradiëntlensbesturing.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen fundamenteel onderzoek en preklinisch werk door real-time observatie mogelijk te maken van de internalisatie van cellulaire vracht en transportroutes die relevant zijn voor geneesmiddelentoediening.
- Mechanische risicoreductie: Vermindert onzekerheden in modellen voor virale entry en intracellulair transport door directe visualisatie van het gedrag van individuele deeltjes in oplossing.
- Risico-geoptimaliseerde voortgang: Ondersteunt go/no-go-beslissingen door reproduceerbare, high-fidelity data te leveren over het gedrag van nanodeeltjes onder omstandigheden met een lage fotonenflux.
Pipeline- en workflowintegratie
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm, van hypothesetoetsing via lead-identificatie tot preklinische validatie, in het bijzonder voor studies die dynamische resolutie op nanoschaal in drie dimensies vereisen.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetesten en het verduidelijken van signaalpaden door het mogelijk maken van continue tracking van enkelvoudige deeltjes in een 3D-ruimte onder fysiologische nabootsing.
- Screening: Verbetert de assay-gereedheid door reproduceerbare lokalisatie en tracking van deeltjes, wat een betrouwbare evaluatie van verbindingen of nanodeeltjes faciliteert.
- Analytica: Genereert kwantitatieve output (positie, snelheid, insluiting) die een objectieve vergelijking van experimentele condities en therapeutische kandidaten mogelijk maakt.
- Translationeel Onderzoek: Sluit aan bij preklinische continuïteit door het modelleren van drugdelivery-routes en virale infectiedynamiek in biologisch relevante systemen.
- Herbruikbaarheid binnen de organisatie: Functioneert als een herbruikbare platformcapaciteit dankzij de modulaire optische lay-out, het kalibratieprotocol en de aanpasbaarheid aan verschillende monstertypes en trackingdoelstellingen.
Operationele & bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen bij targetvalidatie door mechanische ambiguïteit in biologische processen op nanoschaal te verminderen.
- Operationele waarde: Waarborgt standaardisatie en reproduceerbaarheid door gekalibreerde rasterscanning, positieschattingalgoritmen en feedbackgestuurde nanopositionering.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie en vermindert biologische risico's in een laat stadium door vroege, datagestuurde beslissingen mogelijk te maken over de druggability van targets en de haalbaarheid van aflevermechanismen.
- Impact op de portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering door middel van kwantitatieve trackinggegevens met een hoge resolutie die de criteria voor verdere ontwikkeling in drug delivery en antivirale ontwikkeling informeren.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in optische uitlijning, lasersafety en real-time controlesystemen, inclusief FPGA-gebaseerde feedbackloops.
- Is afhankelijk van gespecialiseerde instrumentatie: een 488 nm solid-state laser, 2D elektro-optische deflectoren, een instelbare akoestische gradiëntlens, een avalanche-fotodiode en nanopositioneringspodia.
- Vereist cross-team standaardisatie voor kalibratieprotocollen, parameters voor positieschatting en het afstemmen van integrale regelconstanten tussen gebruikers en laboratoria.
- Omvat aanpassingen bij de overgang van vaste bead-monsters naar vrij bewegende deeltjes in visceuze of complexe biologische media.
- Praktische beperkingen omvatten de gevoeligheid voor fotontellingssnelheden en de noodzaak voor zorgvuldige optimalisatie van trackingdrempels (bijv. 3 kHz start, 1,5 kHz eind) om de lock-on te behouden onder omstandigheden met een laag signaal.
