Een Protocol voor Real-time 3D één deeltje Tracking
January 3rd, 2018
Deze gegevens van het protocol, de bouw en de exploitatie van een real-time 3D één deeltje tracking Microscoop staat tracking nanoschaal fluorescerende probes hoge diffusive snelheden en lage foton graaf tarieven.
Het algemene doel van dit protocol is om een real-time, 3D, enkeldeeltjes volgmicroscoop te implementeren. Het grote voordeel van deze techniek is dat een enkele diffunderende nano-schaalobject continu kan worden gemonitord met tijdelijke resolutie beperkt door fotonen. Deze techniek kan helpen om belangrijke vragen op het gebied van virologie te beantwoorden, zoals het volgen van een enkele virion door het hele infectieproces.
Bereid het apparaat voor op een optische tafel. Deze opstelling is klaar voor kalibratie. Belangrijke componenten zijn een 488 nanometer solid-state laser, twee elektro-optische defletoren langs het pad van de straal, een afstembare akoestische gradiëntlens en een monstertafel met micro- en nano-positioneringssystemen.
Dit schema van de opstelling geeft aanvullende details. Hier is het pad van de laserstraal naar de monsterstandaard. De elektro-optische defletoren en de afstembare akoestische lens bevinden zich langs het pad van de straal.
Deze apparaten drijven dynamisch de laserstip op de monsterstandaard aan. Fotonen van het monster worden geteld door een lawinefotodiode. Een camera bewaakt de positie van het deeltje.
De positie van het monster wordt ingesteld met behulp van micro- en nanocontrollers. Een field programmable gate array bestuurt de laserspot, de berekening van de real-time positie van het deeltje, feedback van de standaard en het tellen van fotonen. Er moeten twee monsters worden voorbereid.
De eerste vereist 190 nanometer fluorescente kralen, verdund in fosfaatgebufferd zoutoplossing. Gebruik een dekglas om een vast deeltjesmonster voor te bereiden. Plaats 400 microliter van de kralenoplossing op het dekglas.
Maak nu het vrij bewegende deeltjesmonster. Hiervoor zijn 110 nanometer fluorescente kralen verdund in water nodig. Maak een vrij bewegend deeltjesmonster door 400 microliter van de oplossing op een dekglas te plaatsen.
Neem het vaste deeltjesmonster naar de microscoop om te monteren. Het monster staat op de XY nano-positioneringssysteem. Schakel de laser, de fotodetector, de controllers voor de straallijnelementen en voor de positioneringssystemen in.
Laat de Piezo nano-positioneringssysteem in een gesloten lus lopen. Verwijder vervolgens de fluorescentie-emissiefilter voor de fotodetector. Verander vervolgens de z-positie van het monster met het micro-positioneringssysteem.
Terwijl de positie varieert, gebruikt u de fotodetector om de intensiteit van de reflectie van de laser te bewaken. Maximaliseer de intensiteit om het brandpunt van de objectieflens te identificeren. Wanneer het monster in het brandpunt staat, vervangt u het fluorescentie-emissiefilter.
Werk nu met de computerbesturingssoftware. Gebruik aangepaste software om het monster raster te scannen. Stel eerst een groot rasterbereik in, het verschil tussen start en einde.
Hier is het bereik 10 micrometer in Y en 10 micrometer in X.Stel ook een grote stappengrootte in in elke richting. Hier 200 nanometer. Stel beide Z-velden in op de eerder geïdentificeerde positie van het brandpunt.
Door op scannen te drukken, start u de rasterscan. Start de scan. De software bestuurt de elektro-optische defletoren in een nachtelijke tour, verzamelt tellingen van de fotodetector, bestuurt de nano-positioneringssysteem en voert positieberekeningen uit.
De scan zal een deeltje vinden dat identificeerbaar is in de software door een platafluorescentie. Voor elke site in de scan bepaalt de software ook schattingen van de positie van het deeltje in X en Y, relatief tot het centrum van het rasterscan van de elektro-objectdefletor. Nadat het deeltje is gevonden, verkleint u het rasterbereik eromheen tot twee micrometer in X en Y. Verklein ook de stappengrootte voor beide tot 100 nanometer.
Voeg een scanbereik toe in de Z-richting van twee micrometer om de fluorescente focus te omlijsten. Stel de Z-stappengrootte in op 200 nanometer. Start de 3D rasterscan om de fluorescente focus te vinden.
De gegevens die uit de scan worden geproduceerd, tonen het brandpunt voordat de afstembare akoestische gradiëntlens wordt ingeschakeld. Ga door met het werken met de instelling van de afstembare akoestische lens binnen de besturingssoftware. Klik eerst op verbinden, vervolgens op inschakelen.
Ga naar het gedeelte puls- en gatingbesturing, verander de uitvoertriggermodus van RGB naar multi-plane. Verander het vervolgens terug naar RGB om de uitvoerfase te kunnen wijzigen. Gebruik de schuifregelaars om de uitvoerfase in te stellen tussen nul graden, 90 graden en 270 graden.
Ga vervolgens naar het gedeelte frequentiebesturing. Selecteer daar een resonantiefrequentie van 68.500 hertz. Ga naar de bovenkant van het scherm en klik op geavanceerd.
Kies vervolgens het tabblad instellingen. Zoek op het nieuwe scherm de maximale frequentie van de nulkolom. Pas het aan om het frequentiebereik van de zoekopdracht te wijzigen.
Klik op opslaan kalibratie, vervolgens op kalibratie afsluiten. Keer terug naar frequentiebesturing en verander de resonantiefrequentie. Verander deze onmiddellijk terug naar 68.500 hertz om de kalibratie van kracht te laten worden.
In het gedeelte amplitudebesturing gebruikt u de schuifregelaar om de amplitude langzaam te verhogen tot 35%. Klik vervolgens op resonantie vergrendelen. Wanneer de frequentie is vergrendeld, klikt u op resonantie ontgrendelen. Keer terug naar de rasterscansoftware.
Voer twee micrometer rasterscanbereiken in die gecentreerd zijn op het deeltje in X en Y. Gebruik een stappengrootte van 100 nanometer. Centreer het deeltje in een vier micrometerbereik in Z, met een stappengrootte van 200 nanometer. In het resulterende scanbeeld is het verlichtingsgebied dat het deeltje vertegenwoordigt ongeveer één micrometer breed.
Basierend hierop past u de XY-schaalparameter aan, zodat de geschatte posities in X en Y variëren van negatief 0,5 tot 0,5 micrometer. Na een soortgelijke procedure met de Z-schaal stelt u de nano-positioneringssysteem in op de nulpositie. Schakel de stroom uit naar de nano-positioneringssysteem voordat u verdergaat.
Vervang het vaste deeltjesmonster door
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol beschrijft de implementatie van een real-time, 3D, single particle tracking microscoop die is ontworpen om fluorescente sondes op nanoschaal te monitoren. Deze techniek maakt continue observatie van enkele diffunderende objecten mogelijk, zelfs onder foton-beperkte omstandigheden.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Microscopie
- Single particle tracking
- Virologie
Achtergrond
- Real-time tracking van nanoschalige deeltjes is cruciaal in verschillende wetenschappelijke velden.
- Het begrijpen van de dynamica van enkele virionen kan inzichten bieden in infectieprocessen.
- Deze techniek verbetert het vermogen om deeltjes bij hoge diffusiesnelheden te bestuderen.
- Fotontellingsbeperkingen worden aangepakt door geavanceerde optische setups.
Doel van de studie
- Om een microscoop te ontwikkelen die enkele deeltjes in real-time kan volgen.
- Om de studie van virale infecties te vergemakkelijken door individuele virionen te monitoren.
- Om de temporele resolutie van het volgen van nanoschalige objecten te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Constructie van een 3D single particle tracking microscoop.
- Gebruik van een 488 nanometer solid state laser.
- Incorporatie van elektro-optische deflecors en een afsteekbare akoestische gradiëntlens.
- Calibratie van het apparaat op een optische tafel met nauwkeurige positionering.
Belangrijkste resultaten
- De microscoop volgt met succes fluorescente sondes op nanoschaal.
- Aangetoond vermogen om deeltjes te monitoren bij lage fotontellingssnelheden.
- Maakte continue observatie van enkele virionen tijdens infectie mogelijk.
- Bijgedragen aan inzichten in de dynamica van virale processen.
Conclusies
- Dit protocol stelt een robuuste methode voor real-time deeltjestracking vast.
- Het opent nieuwe wegen voor onderzoek in de virologie en aanverwante velden.
- De techniek kan ons begrip van virologisch gedrag aanzienlijk verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Real-time 3D single particle tracking enables continuous monitoring of nanoscale objects under photon-limited conditions, addressing a critical gap in observing fast, three-dimensional cellular processes. This capability supports mechanistic de-risking in early discovery by providing high-resolution dynamic data on molecular interactions and trafficking pathways. The method enhances predictive confidence in target validation and lead identification by delivering quantitative, reproducible spatiotemporal data essential for informed go/no-go decisions in drug delivery and virology research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by tracking single virions or nanoparticles through infection processes with high spatiotemporal resolution.
- Operational Value: Provides functional target validation through direct observation of molecular dynamics in near-native environments.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by generating quantitative data on particle diffusion, binding, and transport kinetics under physiologically relevant conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers quantitative dependent variable measurements (position, trajectory, diffusion coefficient) essential for assay standardization and hit confirmation.
- Operational Value: Enables preparation of validated biological systems for downstream screening via precise 3D localization and tracking of fluorescent probes.
- Scalability: Supports platform reuse through robust single-excitation/single-detection layout and calibrated electro-optic and acoustic gradient lens control.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical work by enabling real-time observation of cellular cargo internalization and transport pathways relevant to drug delivery.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in viral entry and intracellular trafficking models through direct visualization of single-particle behavior in solution.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by providing reproducible, high-fidelity data on nanoparticle behavior under low photon flux conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, particularly for studies requiring dynamic, nanoscale resolution in three dimensions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling continuous tracking of single particles in 3D space under physiological mimicry.
- Screening: Enhances assay readiness through reproducible particle localization and tracking, facilitating reliable compound or nanoparticle evaluation.
- Analytics: Generates quantitative outputs (position, velocity, confinement) that allow objective comparison of experimental conditions and therapeutic candidates.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling drug delivery pathways and viral infection dynamics in biologically relevant systems.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform capability due to its modular optical layout, calibration protocol, and adaptability to different sample types and tracking objectives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in nanoscale biological processes.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through calibrated raster scanning, position estimation algorithms, and feedback-controlled nano-positioning.
- Strategic Value: Improves capital efficiency and reduces late-stage biological risk by enabling early, data-driven decisions on target druggability and delivery mechanism feasibility.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through quantitative, high-resolution tracking data that inform advancement criteria in drug delivery and antiviral development.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical alignment, laser safety, and real-time control systems including FPGA-based feedback loops.
- Depends on specialized instrumentation: 488 nm solid-state laser, 2D electro-optic deflectors, tunable acoustic gradient lens, avalanche photodiode, and nano-positioning stages.
- Necessitates cross-team standardization for calibration protocols, position estimation parameters, and integral control constant tuning across users and labs.
- Involves adaptation considerations when transitioning from fixed bead samples to freely moving particles in viscous or complex biological media.
- Practical limitations include sensitivity to photon count rates and the need for careful optimization of tracking thresholds (e.g., 3 kHz start, 1.5 kHz end) to maintain lock-on under low-signal conditions.
