Visualisatie van Biofilm vorming in Candida albicans met behulp van een geautomatiseerd Microfluidic-apparaat
14 december 2017
Dit protocol beschrijft het gebruik van een aanpasbaar geautomatiseerde microfluidic apparaat te visualiseren van biofilm vorming in Candida albicans , onder fysiologische omstandigheden van de gastheer.
Het algemene doel van dit protocol is om de biofilmvorming van Candida albicans in realtime te visualiseren onder fysiologische omstandigheden van de gastheer. Deze methode maakt het mogelijk om de vorming van de biofilm te observeren terwijl deze zich in realtime ontwikkelt en kan worden gebruikt om de effectiviteit van antimicrobiële middelen te testen of om genetische mutanten te beoordelen. Deze techniek kan worden gebruikt om potentiële therapeutische middelen te screenen op activiteit tegen biofilms op een hoge doorvoer en hun effectiviteit kan worden gemeten, gevisualiseerd en vergeleken met huidige behandelingen.
Het grote voordeel van deze techniek is dat het kan worden gebruikt om de vorming van de biofilm te meten onder verschillende omstandigheden die van belang zijn voor onderzoekers. Hoewel deze methode specifiek is ontwikkeld om de biofilmvorming van Candida albicans te bestuderen, kan het ook worden toegepast op andere biofilmvormende micro-organismen, inclusief andere schimmelsoorten en bacteriën. Om te beginnen, bereid single colony culturen van verschillende C.albicans stammen voor uit cellen geplaatst op agar van extract pepton dextrose of YPD-medium volgens standaard microbiologische praktijken.
Schakel vervolgens het microfluïdische systeem in dat de controller, de twee voedingseenheden, de microscoop, de camera en de computer omvat die aan het systeem is gekoppeld. Zodra de computer is geladen, opent u de software die het systeem bestuurt. Zoek het streepjescodenummer van de plaat die in gebruik is en voer het nummer in wanneer dit door de software wordt gevraagd.
Stel vervolgens in de controlemodule de temperatuur van het microfluïdische systeem in op 37 graden Celsius. Klik vervolgens op de inlaatputten I1, I7, I13 en I19 en laat steriele lucht gedurende vijf minuten door de interface plaatbuizen stromen om eventuele condensatie te verwijderen. Wanneer alle condensatie is verdampt, plaatst u de 48-wel microfluïdische plaat van 0-20 dyne op de microscoopstandaard.
Voor een 12-uurs experiment met biofilmvorming, begint u door 600 microliter voorverwarmd medium toe te voegen aan de inlaatputten. Laat de schoongemaakte interface plaat langzaam op de 48-wel microfluïdische plaat zakken. Schuif vervolgens de interface plaat iets naar links totdat de buizen op de inlaat- en uitlaatputten zijn gepositioneerd en vastklikken.
Stel in het deel van de software voor scheurcontrole de stroommodus in op constant en stel de maximale scheur in op één dyne per vierkante centimeter. Klik vervolgens op de inlaatputten met media om de stroom van media van inlaat naar uitlaatputten te beginnen om het kanaal voor te bereiden. Na vijf minuten stroming, klikt u op de stopknop in het gedeelte van de software voor controle van de puttenplaat.
Verwijder vervolgens de interface plaat en observeer de putten van de microfluïdische plaat. Er zou slechts een kleine druppel media zichtbaar moeten zijn in de uitlaatputten. Om wild-type en mutant C.albicans stammen te testen, voegt u 50 microliter van de wild-type SC5314 celcultuur in spider media toe aan twee uitlaatputten, voegt u de bcr1 mutant in spider media toe aan twee uitlaatputten en voegt u de EFG1 mutant in spider media toe aan twee uitlaatputten.
Plaats de interface plaat terug op de microfluïdische plaat en klik het deksel vast. Ga terug naar het deel van de software voor scheurcontrole, stel de stroommodus in op constant en stel de maximale scheur in op twee dyne per vierkante centimeter. Klik op de uitlaatputten met cellen om de stroom van media van de uitlaat naar de inlaatputten te beginnen om te beginnen met het zaaien van C.albicans.
Klik na drie seconden op de stopknop in het gedeelte van de software voor controle van de puttenplaat om te voorkomen dat cellen de inlaatputten binnenkomen. Laat de cellen 10-20 minuten stationair blijven zonder stroming in het bekijkingskanaal voor de initiële cellulaire hechting. Open in het venster van de beeldvormingsmodule de module voor multidimensionele acquisitie en klik op het tabblad voor de stand in het menu aan de linkerkant.
Laad in het gedeelte voor de stand de hoofdstandlijst voor de 48-wel 0-20 dyne microfluïdische plaat. Open vervolgens de module voor aanpassing van de herlaad van het monster en verplaats de stand naar de modules voor absolute positie. Druk in de module voor aanpassing van de herlaad van het monster op de live-knop om een beeldvoorbeeld met kruislijnen te zien.
Gebruik de joystick om de puttenplaat zo te positioneren dat de punt van de pijl naast bekijkingskanaal vier zich uitlijnt met de kruislijnen in de software. Ga vervolgens naar het menu voor het verplaatsen van de stand naar de absolute positie en druk op de knop voor het instellen van de oorsprong. Ga vervolgens terug naar de module voor aanpassing van de herlaad van het monster, klik op het gedeelte voor het initiële referentiepunt in het menu aan de linkerkant en laad het bestand voor de 48-wel 0-20 dyne microfluïdische plaat.
Dubbelklik in het gedeelte voor de stand van de module voor multidimensionele acquisitie op standpositie 22.2 om de microscoopbeeldstand en de camerafocus in nauwe nabijheid te brengen van de pijlmarkering bij bekijkingskanaal 22. Gebruik vervolgens de joystick om de puttenplaat zo te positioneren dat de punt van de pijl naast bekijkingskanaal 22 zich uitlijnt met de kruislijnen. Kopieer de Y-coördinaat in de module voor multidimensionele acquisitie in de Y-positie van.
2 in het tabblad voor het bijwerken van referentiepunten van de module voor aanpassing van de herlaad van het monster. Klik vervolgens in het tabblad voor het bijwerken van standposities van de module voor aanpassing van de herlaad van het monster op toepassen op de MDA standlijst. Gebruik in het venster van de beeldvormingsmodule de module voor multidimensionele acquisitie en klik op het tabblad voor opslaan in het menu aan de linkerkant.
Selecteer vervolgens de bestandsnaam voor het experiment en de map om de verworven beelden op de computer op te slaan. Klik vervolgens op het tabblad voor tijdslapse en stel het in om 145 totaal beelden te verwerven met vijf minuten tussen elk beeld. Stel vervolgens in het tabblad voor golflengten het aantal golflengten in op een en leg vast met 50% Brightfield en 5
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode om de biofilmvorming van Candida albicans in real-time te visualiseren onder fysiologische condities van de gastheer. De techniek maakt het mogelijk om de effectiviteit van antimicrobiële middelen en genetische mutanten te beoordelen.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Microbiologie
- Mycologie
- Biofilmonderzoek
Achtergrond
- Biofilms zijn complexe gemeenschappen van micro-organismen.
- Candida albicans is een veelvoorkomende schimmelpathogeen.
- Inzicht in biofilmvorming is cruciaal voor de ontwikkeling van behandelingen.
- Deze methode kan worden aangepast voor diverse micro-organismen.
Doel van de studie
- Om biofilmvorming in real time te visualiseren.
- Om de effectiviteit van antimicrobiële middelen te testen.
- Om genetische mutanten van Candida albicans te beoordelen.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van enkelvoudige kolonieculturen vanuit YPD-medium.
- Gebruik van een aanpasbaar geautomatiseerd microfluïdisch apparaat.
- Real-time observatie van biofilmontwikkeling.
- High-throughput screening naar potentiële therapeutische middelen.
Belangrijkste resultaten
- Real-time visualisatie van biofilmvorming.
- Mogelijkheid om de effectiviteit van behandelingen te vergelijken.
- Toepassing op andere biofilmvormende micro-organismen.
- Veelzijdige methode die aanpasbaar is aan diverse experimentele condities.
Conclusies
- Deze methode biedt inzicht in de dynamiek van biofilms.
- Het kan bijdragen aan de ontwikkeling van nieuwe antifungale therapieën.
- Potentieel voor bredere toepassingen in microbiologisch onderzoek.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Real-time visualisatie van biofilmvorming onder fysiologisch relevante stroomcondities vult een kritisch gat in de validatie van antifungale doelwitten, waardoor mechanische risicoreductie van virulentiepaden mogelijk wordt. Deze aanpak ondersteunt het voorspellende vertrouwen bij de identificatie van lead-verbindingen door genetische of farmacologische perturbaties te koppelen aan dynamische biofilmfenotypes. De methode verbetert de translationele continuïteit van ontdekking naar preklinische evaluatie door kwantitatieve, reproduceerbare resultaten te leveren voor go/no-go beslissingen.
Strategische toepassingen in biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door de dynamiek van biofilmontwikkeling in real-time te visualiseren onder gecontroleerde afschuifspanning.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt de functionele validatie van targets door de biofilmvorming in wild-type stammen te vergelijken met genetische mutanten zoals bcr1 en EFG1.
- Operationele waarde: Faciliteert de standaardisatie van assays door geautomatiseerde microfluïdische controle van temperatuur, stroomsnelheid en mediasamenstelling.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve time-lapse beelddata om antimicrobiële effecten te beoordelen, zoals amfotericine B-gemedieerde biofilmremming.
- Operationele waarde: Maakt high-throughput screening van potentiële therapeutica mogelijk met reproduceerbare metrieken voor biofilmvorming onder laminaire stroming.
- Operationele waarde: Ondersteunt de aanpassing van de assay voor verschillende microbiële soorten, inclusief bacteriën en andere schimmels, waardoor het nut van het platform wordt uitgebreid.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Levert ziekterelevante inzichten door gastheercondities na te bootsen die worden aangetroffen in vasculaire katheters en slijmvlieslagen.
- Operationele waarde: Biedt voorspellende risicovermindering door in vitro biofilmdynamiek te correleren met vastgestelde in vivo assayresultaten.
- Strategische waarde: Informeert risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door biofilm-defecte mutanten of verbindingen met remmende activiteit te identificeren.
Integratie van Pipeline & Workflow
De microfluïdische biofilmanalyse is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van targetvalidatie via lead-identificatie tot preklinische ondersteuning, waardoor iteratieve design-make-test-cycli mogelijk worden gemaakt.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt het testen van hypothesen over virulentiefactoren door de vorming van hyfen en de ontwikkeling van de intercellulaire matrix in de loop van de tijd te visualiseren.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid door gestandaardiseerde beeldacquisitie en het genereren van timelapse-video's voor comparatieve analyse.
- Analyses: Maakt kwantitatieve vergelijking mogelijk van de biofilmarchitectuur, adhesie en dispersie onder variërende omstandigheden van schuifspanning en blootstelling aan geneesmiddelen.
- Translationeel onderzoek: Verbindt bevindingen uit fundamenteel onderzoek met preklinische continuïteit door biofilmvorming te modelleren op abiotische oppervlakken die relevant zijn voor medische hulpmiddelen.
- Herbruikbaarheid binnen de organisatie: Vestigt een herbruikbaar platform voor het screenen van antifungale en antibiofilm-verbindingen over meerdere therapeutische gebieden.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit in biofilmvormingspaden te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid via geautomatiseerde vloeistofcontrole en gestandaardiseerde beeldvormingsprotocollen.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroege risicoreductie van biofilm-actieve verbindingen mogelijk te maken vóór kostbare in vivo studies.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering door genetische of chemische perturbaties te koppelen aan kwantificeerbare biofilmdefecten.
Overwegingen voor de Implementatie
- Vereist expertise in de bereiding van microbiologische culturen en het bedienen van microfluïdische systemen.
- Afhankelijk van toegang tot geautomatiseerde microfluïdische platforms met nauwkeurige controle over schuifspanning en temperatuur.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor beeldacquisitie, analyse en datainterpretatie door zowel biologie- als imagingteams.
- Omvat overwegingen voor aanpassing bij het uitbreiden van de methode naar biofilms van gemengde soorten of alternatieve microbiële koninkrijken.
- Praktische beperkingen omvatten de noodzaak van geoptimaliseerde kleurings- of contrastmiddelen om de visualisatie van specifieke biofilmcomponenten te verbeteren.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Title
1:02
Preparation of Microfluidic Channels of the Microfluidic Plate
2:08
Candida albicans Biofilm Formation in the Microfluidic System
4:06
Setting Up the Stage Positions for the Microfluidic Experiment
6:01
Microfluidic Experiment Image Acquisition
7:38
Analyzing the Results
9:07
Results: Drug Exposure and Genetic Mutations Can Alter Biofilm Formation
10:20
Conclusion
