Name: Real-time analyse van transcriptiefactor bindend, transcriptie, vertaling en omzet globale u gebeurtenissen wilt weergeven tijdens de activatie van de cellulaire (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: Leer een gecombineerde methode voor genregulatie-analyse met ChIP-seq, 4sU-seq en ribosoomprofilering in cellijnen en primaire cellen. Deze aanpak volgt transcriptiefactorbinding, transcriptie en vertaling in tijd.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij bedanken Lars Dölken voor advies om 4sU labeling voor primaire T-cellen; Elisabeth Graf en Thomas Schwarzmayr voor kritische hulp in bibliotheek generaties en sequencing; Dirk Eick en Andrew Flatley voor het verstrekken van RNAPII en T cel antilichamen; N. Henriëtte Uhlenhaut en Franziska Greulich voor hulp bij de voorbereiding van de bibliotheek voor ChIP-seq; Caroline C. Friedel werd gesteund door subsidies FR2938/7-1 en CRC 1123 (Z2) van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG); Elke Glasmacher werd gesteund door de subsidie GL 870/1-1 van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) en het Duitse centrum voor Diabetes onderzoek (DZD), Helmholtz Zentrum München.

<ol><li>Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nat Methods. 5 (7), 621-628 (2008).</li>
<li>Chavez, S., Garcia-Martinez, J., Delgado-Ramos, L., Perez-Ortin, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+controlling+mRNA+turnover+during+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genet%22%5BJournal%5D)">The importance of controlling mRNA turnover during cell proliferation.</a> Curr Genet. 62 (4), 701-710 (2016).</li>
<li>Rutkowski, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+disruption+of+host+transcription+termination+in+HSV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Widespread disruption of host transcription termination in HSV-1 infection.</a> Nat Commun. 6, 7126(2015).</li>
<li>Ozsolak, F., Milos, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+sequencing%3A+advances%2C+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA sequencing: advances, challenges and opportunities.</a> Nat Rev Genet. 12 (2), 87-98 (2011).</li>
<li>Carninci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+mammalian+promoter+architecture+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of mammalian promoter architecture and evolution.</a> Nat Genet. 38 (6), 626-635 (2006).</li>
<li>Churchman, L. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nascent+transcript+sequencing+visualizes+transcription+at+nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nascent transcript sequencing visualizes transcription at nucleotide resolution.</a> Nature. 469 (7330), 368-373 (2011).</li>
<li>Core, L. J., Waterfall, J. J., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nascent+RNA+sequencing+reveals+widespread+pausing+and+divergent+initiation+at+human+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nascent RNA sequencing reveals widespread pausing and divergent initiation at human promoters.</a> Science. 322 (5909), 1845-1848 (2008).</li>
<li>Hah, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+extensive%2C+and+transient+transcriptional+response+to+estrogen+signaling+in+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A rapid, extensive, and transient transcriptional response to estrogen signaling in breast cancer cells.</a> Cell. 145 (4), 622-634 (2011).</li>
<li>Dolken, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+gene+expression+profiling+for+simultaneous+kinetic+parameter+analysis+of+RNA+synthesis+and+decay%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay.</a> RNA. 14 (9), 1959-1972 (2008).</li>
<li>Paulsen, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Bru-Seq+and+BruChase-Seq+for+genome-wide+assessment+of+the+synthesis+and+stability+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Use of Bru-Seq and BruChase-Seq for genome-wide assessment of the synthesis and stability of RNA.</a> Methods. 67 (1), 45-54 (2014).</li>
<li>Davari, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Genome-wide+Recruitment+of+RNA+Polymerase+II+Drives+Transcription%2C+Splicing%2C+and+Translation+Events+during+T+Cell+Responses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Rapid Genome-wide Recruitment of RNA Polymerase II Drives Transcription, Splicing, and Translation Events during T Cell Responses.</a> Cell Rep. 19 (3), 643-654 (2017).</li>
<li>Windhager, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrashort+and+progressive+4sU-tagging+reveals+key+characteristics+of+RNA+processing+at+nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Ultrashort and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution.</a> Genome Res. 22 (10), 2031-2042 (2012).</li>
<li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq%3A+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).</li>
<li>Blecher-Gonen, R., Barnett-Itzhaki, Z., Jaitin, D., Amann-Zalcenstein, D., Lara-Astiaso, D., Amit, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+chromatin+immunoprecipitation+for+genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions+and+epigenomic+states%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-throughput chromatin immunoprecipitation for genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions and epigenomic states.</a> Nat Protoc. 8 (3), 539-554 (2013).</li>
<li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li>
<li>Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+genome-wide+landscape+of+translational+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Toward a genome-wide landscape of translational control.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (1), a012302(2013).</li>
<li>Brar, G. A., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling+reveals+the+what%2C+when%2C+where+and+how+of+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 651-664 (2015).</li>
<li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+identification+of+RNA-binding+protein+and+microRNA+target+sites+by+PAR-CLIP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP.</a> Cell. 141 (1), 129-141 (2010).</li>
<li>Radle, B., Rutkowski, A. J., Ruzsics, Z., Friedel, C. C., Koszinowski, U. H., Dolken, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+labeling+of+newly+transcribed+RNA+for+high+resolution+gene+expression+profiling+of+RNA+synthesis%2C+processing+and+decay+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Metabolic labeling of newly transcribed RNA for high resolution gene expression profiling of RNA synthesis, processing and decay in cell culture.</a> J Vis Exp. (78), (2013).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads%5BTitle%5D)+AND+%22EMBnet.journal%22%5BJournal%5D)">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li>
<li>Bonfert, T., Kirner, E., Csaba, G., Zimmer, R., Friedel, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ContextMap+2%3A+fast+and+accurate+context-based+RNA-seq+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ContextMap 2: fast and accurate context-based RNA-seq mapping.</a> BMC Bioinformatics. 16, 122(2015).</li>
<li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+accurate+long-read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).</li>
<li>Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((featureCounts%3A+an+efficient+general+purpose+program+for+assigning+sequence+reads+to+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">featureCounts: an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features.</a> Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model-based+analysis+of+ChIP-Seq+%28MACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biol. 9 (9), R137(2008).</li>
<li>Guo, Y., Mahony, S., Gifford, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+genome+wide+binding+event+finding+and+motif+discovery+reveals+transcription+factor+spatial+binding+constraints%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">High resolution genome wide binding event finding and motif discovery reveals transcription factor spatial binding constraints.</a> PLoS Comput Biol. 8 (8), e1002638(2012).</li>
<li>Team, R. D. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTeam%2C+RDC+%22R%3A+A+Language+and+Environment+for+Statistical+Computing%22">R: A Language and Environment for Statistical Computing</a>. , the R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2016).</li>
<li>Huber, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orchestrating+high-throughput+genomic+analysis+with+Bioconductor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Orchestrating high-throughput genomic analysis with Bioconductor.</a> Nature Methods. 12 (2), 115-121 (2015).</li>
<li>Eisenberg, E., Levanon, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+housekeeping+genes%2C+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Human housekeeping genes, revisited.</a> Trends Genet. 29 (10), 569-574 (2013).</li>
<li>Friedel, C. C., Dolken, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+tagging+and+purification+of+nascent+RNA%3A+implications+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Metabolic tagging and purification of nascent RNA: implications for transcriptomics.</a> Mol Biosyst. 5 (11), 1271-1278 (2009).</li>
<li>Burger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-thiouridine+inhibits+rRNA+synthesis+and+causes+a+nucleolar+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">4-thiouridine inhibits rRNA synthesis and causes a nucleolar stress response.</a> RNA Biol. 10 (10), 1623-1630 (2013).</li>
<li>Duffy, E. E., Rutenberg-Schoenberg, M., Stark, C. D., Kitchen, R. R., Gerstein, M. B., Simon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+Distinct+RNA+Populations+Using+Efficient+and+Reversible+Covalent+Chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Tracking Distinct RNA Populations Using Efficient and Reversible Covalent Chemistry.</a> Mol Cell. 59 (5), 858-866 (2015).</li>
<li>Parekh, S., Ziegenhain, C., Vieth, B., Enard, W., Hellmann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+amplification+on+differential+expression+analyses+by+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The impact of amplification on differential expression analyses by RNA-seq.</a> Sci Rep. 6, 25533(2016).</li>
<li>Baudrimont, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+gene+control+reveals+rapid+mRNA+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Multiplexed gene control reveals rapid mRNA turnover.</a> Sci Adv. 3 (7), e1700006(2017).</li>
<li>Rabani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+labeling+of+RNA+uncovers+principles+of+RNA+production+and+degradation+dynamics+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells.</a> Nat Biotechnol. 29 (5), 436-442 (2011).</li>
<li>Schlackow, M., Nojima, T., Gomes, T., Dhir, A., Carmo-Fonseca, M., Proudfoot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinctive+Patterns+of+Transcription+and+RNA+Processing+for+Human+lincRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinctive Patterns of Transcription and RNA Processing for Human lincRNAs.</a> Mol Cell. 65 (1), 25-38 (2017).</li>
<li>Mukherjee, N., Calviello, L., Hirsekorn, A., de Pretis, S., Pelizzola, M., Ohler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+classification+of+human+coding+and+noncoding+genes+through+RNA+metabolism+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrative classification of human coding and noncoding genes through RNA metabolism profiles.</a> Nat Struct Mol Biol. 24 (1), 86-96 (2017).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Analyseren van het hele proces van genexpressie is noodzakelijk om cellulaire aanpassingen in reactie op een bepaalde prikkel of behandeling volledig te begrijpen. Het combineren van totaal RNA-seq, leidt 4sU-seq, ribosoom profilering en ChIP-seq op verschillende tijdstippen tot een uitgebreide analyse van de belangrijkste processen van genregulatie na verloop van tijd. Een diep inzicht in biologische processen zal moeten vaststellen van de experimentele opstelling, alsmede optimale tijd punten.
Omdat methoden om te studeren genregulatie snel verbeteren, kunnen deze protocollen aangepast worden aan snelle veranderingen. Toch bieden ze de belangrijkste methoden voor de studie van fundamentele gene regulerende mechanismen in elk type cel. Hier bespreken we een aantal van de valkuilen en de feiten die men overwegen moet bij het gebruik van deze methoden.
Cellen: Cellen moeten zeer levensvatbaar en als primaire geïsoleerde cuvetten, zuiverheid van cel populaties (bijvFACS analyse voor primaire T-cellen) moet worden gegarandeerd. Zelfs enigszins gestresst cellen kunnen invloed hebben op de resultaten van deze zeer gevoelige sequencing methoden verlagen de hoeveelheid nieuw getranscribeerde of vertaalde RNA en leiden tot ongewenste uitlezingen van de stressrespons bij de sequencing-resultaten. De snelheid van centrifugeren vermeld in dit protocol naar pellet cellen is geoptimaliseerd voor primaire T-cellen. Dus, het aanpassen van de snelheid afhankelijk van het celtype.
4 sU effecten op celfysiologie: Naast de bovengenoemde opties voor het controleren van de minimale verstoring aan cellulaire fysiologie op 4sU toevoeging, kan verdere en/of aanvullende analyse worden uitgevoerd, vooral wanneer cel nummers beperkt worden. Effecten op celproliferatie kunnen worden getest door te controleren of de verdubbeling tijd van cellen door cellen met labels en labelloze gewoon te tellen. Nucleolar stress inductie kon ook worden getest door het analyseren van de morfologie van de cel via immunofluorescentie kleuring van nucleolin en kernen. Verder controleren het effect van 4sU, gewijzigde mondiale genexpressie prestaties kan worden gemeten door het correleren graven van gelabelde totaal RNA naar labelloze totaal RNA te lezen.
Cel nummers: Voor in vitro gegenereerd T-cellen, is het aan te raden te beginnen met ten minste het bedrag van de cellen aangegeven in tabel 2. Kies adequate nummers per methode volgens het type van cellen. Aangezien T-cellen hebben minder cytoplasma en RNA ten opzichte van andere cellen, zou waarschijnlijk lagere hoeveelheden andere cellen toereikend zal zijn. Voor ChIP-seq afhangen cel nummers hoogst het antilichaam gebruikt en het niveau van de expressie van de proteïne van belang binnen de cellen. Voor Histon of RNAPII ChIP, kunnen fewe cellen worden gebruikt, dat cel nummers dienen te worden verhoogd wanneer transcriptiefactoren worden gebruikt, vooral als ze zijn uitgedrukt op een laag niveau.
4 sU-labeling en RNA-biotinylation: Bij het gebruik van Adherente cellen, kan 4sU labeling worden gericht zoals beschreven door Rädle et al. 19 sinds cellen zeer snel nemen 4sU, kan worden toegevoegd direct naar het medium van de schorsing, aanhanger of semi-Adherente cellen.
Het is raadzaam om te beginnen met de biotinylation met 60-80 µg van RNA. Niettemin, lagere bedragen van RNA kunnen worden gebruikt, hoewel we did niet toets voor minder dan 30 µg. Voeg een coprecipitant (b.v.GlycoBlue) toen Precipiterend RNA als de pellet moeilijk is te zien. Duffy et al. hebben ook aangetoond dat methylthiosulfonate-geactiveerde Biotine (MTS-Biotine) efficiënter reageert met 4sU-geëtiketteerden RNA dan HPDP-Biotine31. Vandaar, het misschien wel overwegen over te schakelen naar MTS-biotine, in het bijzonder voor het herstel van kleine RNAs, die de neiging om minder uridine residuen (verwijzen naar het biotinylation-protocol genoemd door Duffy et al.; Zie zuivering van 4sU-label RNA, waard Experimentele Procedures).
Voor het herstel van nieuw getranscribeerde RNA is het mogelijk om paramagnetisch kralen of RNA Cleanup kralen van uw keuze te gebruiken. Altijd rekening mee dat deze kits kunnen of kunnen niet voor specifieke RNAs zuiveren. Als u geïnteresseerd in miRNAs bent, bijvoorbeeld met behulp van specifieke uitrustingen voor miRNA vastleggen en sequencing.
Kwantificering van nieuw getranscribeerde RNA: Om te nauwkeurig kwantificeren nieuw getranscribeerde RNA, meting moet worden verricht door een geschikt Fluorimeter (Zie Tabel van materialen). Binnen 1 uur van de 4sU, blootstelling vertegenwoordigt nieuw getranscribeerde RNA ongeveer 1 tot 4% van de totale RNA. Nieuw getranscribeerde RNA van 1 h met het label, geactiveerde T-cellen bestaat uit ~ 90-94% van rRNA11.
Ribosoom Profiling: Bij de vaststelling van de methode, vastbesloten wij dat met behulp van 1,5 x het bedrag van de nuclease dan voorgesteld in het oorspronkelijke protocol staat garant voor goede spijsvertering. Ook geen bijwerkingen gemeld voor verhoogde hoeveelheid nuclease. Omdat het heel moeilijk om de overdigest van de RPFs terwijl ze deel van het RNA ribosomal eiwitten gebonden uitmaken, kunt u nog steeds een beetje verhoging van het bedrag om Titreer optimale nuclease spijsvertering.
Als minder dan 500 ng van RPF RNA werden teruggevonden in stap 4.4.2, herhaal rRNA uitputting en zwembad gezuiverd RPFs met RNA Clean & Concentrator-5 kolommen. Als alternatief, laad twee identieke monsters naast elkaar op de gel (stap 4.5.3) en zwembad gel segmenten tijdens RNA elutie van de gel (stap 4.5.6).
Het is raadzaam de RPFs snijden op een gel zo dicht mogelijk naar de 28 en 30 nt-bands. Dit helpt bij het elimineren van ongewenste fragmenten uit rRNAs en tRNAs, die later zal deel uitmaken van uw bibliotheek en verminderen van sequencing leest voor uw RPFs.
Het is ook aanbevolen om te voorkomen dat UV-licht tijdens het zuiveringsproces ongehinderd de gel. Dit kunt nicks maken in de fragmenten van RNA, evenals de pyrimidine-Dimeren, die uiteindelijk kunnen ernstig beïnvloeden de bibliotheek voorbereiding en rangschikkend resultaten.
Bibliotheek voorbereiding en rangschikken van gegevens: Ribosoom profilering protocol kan genereren een cDNA Bibliotheek geschikt voor het rangschikken. Monsters die worden gegenereerd door het 4sU-labeling kunnen direct gebruikt worden voor de voorbereiding van de bibliotheek met elke passende RNA sequencing kit. Sinds nieuw getranscribeerde RNA, vooral wanneer met behulp van korte labeling van tijden, nog mogelijk niet polyadenylated, moet geen poly-A-selectie worden uitgevoerd. In plaats daarvan raden we rRNA uitputting om te voorkomen dat vermindering van de sequencing diepte voor de werkelijke steekproef. Met behulp van T-cellen, we begonnen met 400 ng nieuw getranscribeerde en totaal RNA (afhankelijk van de kit, zie materialen), uitgevoerd rRNA uitputting en verminderd cycli voor PCR versterking om te minimaliseren van PCR bias. Voorbereiding van de bibliotheek kan worden uitgevoerd met minder grondstof. Ter verantwoording voor PCR cycli aantallen bibliotheek complexiteit moeten worden geoptimaliseerd.
Voor ChIP-seq zijn er ook veel kits beschikbaar voor de voorbereiding van de bibliotheek. In onze handen bibliotheek voorbereiding werkte goed vanaf 2 ng van ChIP DNA (Zie materialen voor een suggestie op welke kit te gebruiken). Zorg ervoor dat te controleren van de indices voor de kleurbalans tijdens het rangschikken. Het is raadzaam een diepte van de sequencing van ≥40 x 106 leest elke voor 4sU-seq, totaal RNA-seq, en ChIP-seq monsters, en ≥80 x 106 leest voor ribosoom profilering van monsters. De diepte van de sequencing hangt af van het monster en de stroomafwaartse bioinformatics analyse en goed moet worden overwogen. Voor het analyseren van intronic leest voor cotranscriptional splicing, 100 moet bp gekoppeld-einde sequencing worden gekozen.
Sequencing bias: Sequencing is de gouden standaard geworden bij de vaststelling van mondiale veranderingen in transcriptie, vertaling of transcriptie factor bindend. In de afgelopen jaren bestaande methoden werden geduwd voor hun plafond of nieuwe technieken werden ontwikkeld voor steeds meer kleine startende bedragen van RNA sequencing. Dit vereist versterking van cDNA, die ruis of vooringenomenheid introduceert. Onlangs, unieke moleculaire identificatoren (UMIs) werden ontwikkeld om duplicaten geïntroduceerd door PCR experimenteel te identificeren. Onlangs, werd aangetoond dat UMIs net mild rangschikkend macht en valse ontdekking tarief voor differentiële gen expressie32 verbeteren. Niettemin overwegen gebruik te maken van unieke moleculaire identificatiemiddelen (UMIs) voor alle sequencing bibliotheken te controleren voor de complexiteit van de bibliotheek, met name bij het starten met een lage hoeveelheid RNA en wanneer vele cycli van PCR nodig zijn.
Buffer en voorraadoplossingen: Alle buffers voor 4sU-seq en ribosoom profiling moeten bereid onder strikte RNase-vrij voorwaarden met behulp van de nuclease-gratis water. Het is aanbevolen om het kopen van pre-en-klare nuclease-vrije NaCl, Tris-HCl, EDTA, Natriumcitraat en water. Om ervoor te zorgen nuclease-vrij voorwaarden, kan een RNase decontaminating oplossing worden aangewend om pipetten of oppervlakken schoon te maken. Alle buffers voor ChIP-seq moeten ten minste DNase-vrij en kan bij kamertemperatuur worden opgeslagen. Altijd toevoegen proteaseinhibitors en, optioneel, phosphatase inhibitors vlak voor gebruik en houd op ijs.
Bio-informatica: Analyses op alle gegevens van de sequentie (d.w.z., ChIP-seq, RNA-seq en ribsosome profilering) omvat kwaliteitscontrole (bijvoorbeeldmet behulp van FastQC, http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/), adapter trimmen (bijvoorbeeldmet cutadapt20) gevolgd door toewijzing aan het genoom van de referentie voor de cellen onder studie. Voor RNA-seq gegevens (zowel totaal en 4sU-seq), evenals ribosoom profilering van gegevens, is een afgesplitste RNA-seq mapper vereist, zoals ContextMap 221. ChIP-seq gegevens unspliced aanpassingen is met behulp van de BWA-MEM22 voldoende. Genexpressie kan worden berekend aan de hand van het RPKM model (leest per Kilobase van Exon per miljoen fragmenten toegewezen)1, nadat u hebt bepaald tellingen per gen met behulp van een programma, bijvoorbeeld featureCounts23te lezen. Piek bellen van ChIP-seq gegevens, een aantal programma's beschikbaar zijn, bijvoorbeeld, MACS24 of GEM25. Verder kunnen stroomafwaarts analyses worden uitgevoerd in R26, in het bijzonder het gebruik van hulpmiddelen die door de Bioconductor project27.
Hier is een grote uitdaging bij de integratie van 4sU- en totaal RNA-niveaus en translationeel activiteit van het ribosoom profilering normalisatie. Een klassieke benadering van dit probleem aan te pakken is om te normaliseren tot een niveau van huis-keeping genen. Verklein geluid ontstaat door willekeurige schommelingen voor individuele house-keeping genen en het wordt aanbevolen om niet alleen een paar huis-keeping genen te gebruiken maar mediaan niveaus voor een grotere reeks, bijvoorbeeld de > 3000 genen van de house-keeping samengestelddoor Eisenberg en Levanon28 . Tarieven voor de berekening van RNA omzet vanaf ratio's van 4sU-totale RNA, normalisatie is gebaseerd op gemiddelde omzet (bijvoorbeeld, ervan uitgaande dat een RNA halfwaardetijd van 5 h)29. Echter, aangezien dit geen algemene wijzigingen voor house-keeping genen veronderstelt, raden we analyse benaderingen onafhankelijk van normalisatie, zoalscorrelatie gebaseerde clustering van een tijd-serie van de verschillende gegevenstypen om groepen genen te identificeren met verschillende gedrag in de transcriptie en vertaling tijdens de activering. Voor een gedetailleerde beschrijving op bioinformatical integratie van de verschillende gegevenstypen verwijzen we naar de oorspronkelijke publicatie11.
Analyse van omzet tarieven en data integratie: Een onlangs gepubliceerd papier-33 , helft-leven bepaald door een multiplexed gene besturingselement (MGC) vergelijken met globale methoden kon tonen dat halfwaardetijd beste gecorreleerd met die welke verkregen door metabole labeling methoden vergeleken met andere methoden (bv algemene remming van de transcriptie door drugs). Echter, opgemerkt dat de verschillen tussen half-life berekeningen kunnen ontstaan en beschreven 15,34 zijn. We zijn goed voor de meeste van de problemen en de verschillen die zijn geïntroduceerd door de stressrespons als gevolg van langdurige 4sU blootstelling. Daarom is het onontbeerlijk om uit te sluiten van de stressrespons geïntroduceerd door de 4sU-labeling. Als u wilt verder valideren omzet tarieven, raden we het gebruik van MGCs.
Een gegevensset zoals die hier worden gegenereerd kunnen daarnaast ook worden gebruikt voor een meer integratieve data analyse (bijvoorbeeld, regulering van lang niet-coderende RNAs)35,36.

In de afgelopen jaren is de RNA-sequencing (RNA-seq) de standaard tool voor het analyseren van alle geuite RNAs binnen een cel of een organisme1geworden. Om te begrijpen het hele proces van cellen aan te passen in reactie op een bepaalde prikkel/drug, is het echter nodig om volledig alle onderliggende processen, variërend van de transcriptie van mRNA tot verwerking, omzet en vertaling. Op korte termijn wijzigingen in RNA transcriptie kunnen nauwelijks worden gemeten door de totale RNAseq, aangezien veranderingen van totale RNA is afhankelijk van factoren zoals RNA halfwaardetijd en transcriptionele activiteit, die een slechte sjabloon voor als gevolg van de aanpassing van de cellen om te zijn milieu-effecten2,3. Inderdaad, een verscheidenheid van nieuwe sequencing technieken zijn ontwikkeld waarmee een analyse van de verschillende stappen in het proces van gen voorschrift4 wanneer op de juiste wijze worden gecombineerd. Dit protocol wordt beschreven hoe sommige nogal gemakkelijk toepasbare sequencing technieken waarmee het bijhouden van de regulering van de essentiële lagen van mRNA in een vergelijkende wijze combineren. Voor het analyseren van transcriptionele activiteit, een verscheidenheid van methoden zijn beschreven, zoals Cap-analyse van gen expressie (kooi)5, inheemse rek transcript sequencing (NET-seq)6en genoom-brede nucleaire looppas (GRO-seq)7 , 8, evenals bromouridine-sequentie (Bru-seq) en 4-thiouridine-sequencing (4sU-seq), die gebruik maken van metabolieten die zijn opgenomen in nieuw Getranscribeerd RNA9,10, gewoon om er een paar noemen. Terwijl kooi de exacte transcriptie start site identificeert, NET-seq en GRO-seq meer accurate informatie leveren over het lezen van de richtingen en 4sU-seq (dat is de hier beschreven methode) alleen nieuw detecteert Getranscribeerd RNA. 4sU-seq is echter uiterst gevoelige en kan worden toegepast in verschillende time frames voor het meten van kwantitatieve transcriptionele activiteit in actief veranderende cellen, alsook kwantitatieve veranderingen in mRNA-verwerking (die gebeurt binnen minuten)9, 11,12. 4sU-seq is bovendien ideaal om te combineren met RNA-seq voor het berekenen van RNA omzet tarieven voor genen9. De transcriptie van mRNA wordt uitgevoerd door RNA Polymerase II (RNAPII), die op zijn beurt wordt beïnvloed door een veelheid van factoren, zoals transcriptiefactoren, histone modificaties en algemene activators/repressors dat kan zelfs deel uitmaken van de transcriptionele complex. Om te testen hoeveel gen/promotor/versterker-regio's zijn gebonden aan één factor, heeft ChIP-seq ontwikkeld, die is nu de standaardmethode voor dit doel, als gevolg van de vele verkrijgbare antilichamen13. Echter, hoewel ChIPseq duidelijke informatie geeft over waar regulering bind factoren, het weerspiegelt niet als het inderdaad tot veranderingen in de transcriptie14 leidt. ChIP-seq uitvoeren met 4sU-seq is daarom de ideale combinatie voor een dergelijke biologische vragen. Regulering van de expressie van genen kan ook optreden in een later stadium, aangezien15,16, met vermelding van potentieel belangrijke verordening betreffende de translationeel of posttranslationele doen niet noodzakelijkerwijs correleren van mRNA en proteïne niveaus niveau, afhankelijk van de context. In het jaar 2011, ribosoom profilering had zijn eerste gecombineerd met RNA-seq en is nu de methode van keuze te kwantificeren van wijzigingen die snel in eiwit, optreden aangezien er nog enkele gevoeligheid grenzen met massaspectrometrie17. Inderdaad, vertaaltarieven verkregen van dergelijke methoden is gebleken te leveren een relatief goede schatting van veranderingen in eiwitniveaus (ten minste gemeten voor veranderingen op lange termijn) en een nog meer gedetailleerde kijk op het proces van het vertalen, bijvoorbeeld de bepaling van begin-kant en alternatieve vertaling frames17. De combinatorische gebruik van alle vier methoden kunnen worden gebruikt in stabiele toestand, tussen verschillende celtypes, of in een tijd-serial experimenteren van een snel veranderende cel11. Dit gebruik is een genoom-brede overzicht van wijzigingen in transcription factor binding beïnvloeden RNA transcriptie, verwerking en vertaling.

<table><tbody><tr><td>4sU-labeling</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-thiouridine (100 mg)</td><td>Carbosynth</td><td>13957-31-8</td><td>Prepare 50 mM stock in steriele H2O/PBS; store at &ndash;20&deg;C in aliquots of 50-500 &micro;l; do not refreeze.</td></tr><tr><td>1.5 ml safe-lock tubes</td><td>Eppendorf</td><td>30121589</td><td>Optioneel</td></tr><tr><td>1.5 ml screw-top polypropyleenbuizen</td><td>Sarstedt</td><td>72692005</td><td>Compatibel met Dimethylformamide</td></tr><tr><td>15 ml buizen</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td>Compatibel met Dimethylformamide</td></tr><tr><td>2.0 ml screw-top polypropyleenbuizen</td><td>Sarstedt</td><td>72694005</td><td>Compatibel met Dimethylformamide</td></tr><tr><td>50 ml buizen</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>Compatibel met Dimethylformamide</td></tr><tr><td>Agencourt RNAClean XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63987</td><td>We bevelen het gebruik van deze paramagnetische kralen aan. Deel in aliquoten en bewaar bij 4&deg;C</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma Aldirch</td><td>372978</td><td>WAARSCHUWING &ndash; GEVAARLIJK VOOR DE GEZONDHEID</td></tr><tr><td>Dimethylformamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Roth</td><td>6908.1</td><td>Bereid als 100 mM DTT in nuclease-vrij H2O; bereid altijd vers</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck</td><td>1.00983.1000</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Biotin-HPDP (50 mg)</td><td>Pierce</td><td>21341</td><td>Bereid 1 mg/ml stockoplossing door 50 mg Biotin-HPDP op te lossen in 50 ml DMF. Zachte verwarming verbetert de oplossing. Bewaar bij 4&deg;C in aliquoten van 1 ml. DMF lost sommige plastic materialen op. We bevelen aan om glazen pipetten te gebruiken om DMF over te brengen van de stock glazen fles naar 50 ml Falcon buizen.</td></tr><tr><td>High Sensitivity DNA Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Merck</td><td>1.09634.1011</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (5M)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71386</td><td>Stockoplossing</td></tr><tr><td>nuclease-vrij EDTA (500 mM), pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td>Stockoplossing</td></tr><tr><td>Nuclease-vrij H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W4502</td><td>Stockoplossing</td></tr><tr><td>nuclease-vrij Tris Cl (1M), pH 7,4</td><td>Lonza</td><td>51237</td><td>Stockoplossing</td></tr><tr><td>Phase Lock Gel Heavy buizen (2,0 ml)</td><td>5Prime</td><td>2302830</td><td>Gebruik in stap 1.3.4.</td></tr><tr><td>Polypropyleen 15 ml centrifugebuizen</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td>Of gelijkwaardig; ze moeten tot 15.000 × g verdragen</td></tr><tr><td>QIAzol Lysis Reagent (200 ml)</td><td>Qiagen</td><td>79306</td><td>Gebruik deze of gelijkwaardige TRI reagent voor RNA isolatie, WAARSCHUWING &ndash; CORROSIEF en GEVAARLIJK VOOR DE GEZONDHEID! Zorg voor onmiddellijke toegang tot Fenol tegengif (PEG-Methanol)</td></tr><tr><td>Qubit RNA HS assay kit</td><td>Life Technologies</td><td>Q32852</td><td>Gebruik deze kit voor het kwantificeren van RNA hoeveelheid in stap 1.4.11</td></tr><tr><td>RNeasy MinElute Kit</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td>Optioneel; inclusief Buffer RLT</td></tr><tr><td>Natriumcitraat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8532</td><td>Bereid 1,6 M stockoplossing met nuclease-vrij water</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>&micro;Macs Streptavidin Kit</td><td>Miltenyi</td><td>130-074-101</td><td>Bewaar bij 4&deg;C, inclusief &micro;Macs kolommen gebruikt in stap 1.4.6. (bewaar bij RT)</td></tr><tr><td>Celviabiliteit en stress assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I</td><td>BD Biosciences</td><td>559763</td><td>Optioneel</td></tr><tr><td>Thapsigargin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9033</td><td>Optioneel</td></tr><tr><td>p53</td><td>abcam</td><td>ab26</td><td>Optioneel</td></tr><tr><td>p-EIF2a (Ser51)</td><td>Cell Signaling</td><td>9721</td><td>Optioneel</td></tr><tr><td>BH3I-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B 8809</td><td>Optioneel</td></tr><tr><td>Buffers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4sU Wasbuffer</td><td></td><td>bewaar bij RT</td><td>100 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,1% Tween 20 in nuclease-vrij H2O</td></tr><tr><td>Biotinylering Buffer (10x)</td><td></td><td>bewaar bij 4 &deg;C</td><td>100 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA in nuclease-vrij water; maak aliquoten van 1 ml; bewaar bij 4&deg;C</td></tr><tr><td>RNA precipitatie buffer</td><td></td><td>bewaar bij RT</td><td>1,2 M NaCl, 0,8 M natriumcitraat in nuclease-vrij water. Bereid vooraf onder nuclease-vrije omstandigheden. Bewaar bij kamertemperatuur in 50 ml falcon buizen.</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer instrument</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>RNA 6000 Nano Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1511</td><td>Gebruik deze kit om RNA integriteit te verifiëren in stap 1.3.10</td></tr><tr><td>RNA 6000 Pico Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td>Optioneel</td></tr><tr><td>UV/VIS spectrofotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 1000</td><td>Of gelijkwaardig. Gebruik in stap 1.2.2/3.1.8/3.3.3/3.4.3</td></tr><tr><td>High-speed centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>Heraeus Multifuge X3R</td><td>Of gelijkwaardige apparatuur die in staat is om 13.000 &times;&nbsp;g te bereiken</td></tr><tr><td>High-speed rotor</td><td>Thermo Scientific</td><td>Fiberlite F15-6 x 100y</td><td></td></tr><tr><td>Adapters voor 15 ml buizen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gekoelde tafelcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5430 R</td><td>Of gelijkwaard

real-time analyse van transcriptiefactor bindend, transcriptie, vertaling en omzet globale u gebeurtenissen wilt weergeven tijdens de activatie van de cellulaire

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Na activatie, cellen snel veranderen hun functionele programma's en daarmee hun genexpressie profiel. Massieve veranderingen in genexpressie optreden, bijvoorbeeld tijdens celdifferentiatie, genuitdrukking en functionele stimulatie (zoals activering van immune cellen), of na blootstelling aan drugs en andere factoren van de lokale omgeving. Afhankelijk van de stimulus en cel type, deze wijzigingen worden snel en op elk mogelijk niveau van de genexpressie. Weergave van alle moleculaire processen van een reagerende cel naar een bepaald soort prikkel/drugs is een van de moeilijkste taken in moleculaire biologie. Hier beschrijven we een protocol waarmee de gelijktijdige analyse van meerdere lagen van genexpressie. Wij vergelijken, in het bijzonder transcriptiefactor bindende (chromatine-immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq)), DOVO transcriptie (4-thiouridine-sequencing (4sU-seq)), mRNA de verwerking, en omzet, alsmede vertaling (ribosoom profilering). Door de combinatie van deze methoden, is het mogelijk om een gedetailleerde en genoom-brede cursus van actie weer te geven.
Nieuw getranscribeerde RNA sequencing wordt vooral aanbevolen bij het analyseren van de snel aan te passen of veranderende systemen, omdat dit de transcriptionele activiteit van alle genen in de tijd van blootstelling van de 4sU toont (ongeacht of ze up- of werden). De combinatorische gebruik van totale RNA-seq en ribosoom profiling kan bovendien de berekening van de omzet en vertaling tarieven RNA. Bioinformatic analyse van high-throughput rangschikkend resultaten zorgt voor vele instrumenten voor analyse en interpretatie van de gegevens. De gegenereerde gegevens kunt ook bijhouden van co-transcriptional en alternatieve splicing, gewoon om te noemen een paar mogelijke uitkomsten.
De gecombineerde aanpak hier beschreven kan worden toegepast voor verschillende modelorganismen of celtypen, met inbegrip van primaire cellen. Bovendien, wij bieden gedetailleerde protocollen voor elke methode gebruikt, met inbegrip van kwaliteitscontroles, en bespreken van potentiële problemen en valkuilen.

4 sU labeling: Controleer of optimale 4 sU-labeling voorwaarden (apoptosis, nucleaire stress, cytoplasmatische stress), tijd en concentratie: Hoge niveaus van 4sU kunnen remming van de productie en verwerking van rRNA en cytoplasmatische evenals nucleaire stress30veroorzaken. Daarom moeten de cellen van belang voor 4sU-geïnduceerde stress evenals apoptosis worden getest. Westelijke vlekkenanalyse wordt aanbevolen voor het visualiseren van p53 accumulatie, die aangeeft dat de nucleaire stress, verhoging van de niveaus van de phospho-EIF2a welke cytoplasmatische stress en fluorescentie-activated cell sorting (FACS) analyse voor apoptosis worden weergegeven. Hoge en langdurige blootstelling aan 4sU of drugs zoals thapsigargin of arsenite kunnen worden gebruikt voor het opwekken van cellulaire spanning. Als u wilt het induceren van apoptose of cel dood, cellen werden behandeld met BH3I-1 (500 ng/µL) of bebroede gedurende 5 minuten bij 95 ° C (heat shock). Annexine V/7-AAD kleuring werd gebruikt om te bepalen van apoptotic (Annexine V) en doden (7-AAD) cellen. Etikettering van in vitro gegenereerd primaire Th1 cellen voor 0.5 h met 500 µM 4sU (eindconcentratie) of 1 h met 200 µM 4sU induceert evenmin tekenen van cellulaire stress noch apoptosis (Figuur 1) maar leiden tot een voldoende opname van de 4sU.
RNA labeling tijd kan ook worden ingekort (≤5 min) die leidt tot een toename van kortstondige intronic sequenties in vergelijking met langer labeling tijden. Om te visualiseren co-transcriptional splicing tarieven, 4sU-labeling tijden moeten niet groter is dan 30 min. Raadpleeg voor meer informatie over 4sUlabeling, Rädle et al. 19
Kwaliteitscontrole: RNA integriteit is van groot belang bij het verwerken van RNA. Is het meest handig om de kwaliteit van de RNA van 4sU-label RNA te controleren na biotinylation door electrophoretical analyse (Zie Tabel van materialen). Overwegen verifiëren van geïsoleerde RNA vanaf stap 2.2.2, vooral bij het gebruik ervan voor het rangschikken van totale RNA. RNA integrity nummer (RIN) moet ≥8 om RNA integriteit voor verdere verwerking (Figuur 3).
Electrophoretical analyse kan ook worden gebruikt om te controleren of nieuw getranscribeerde RNA. Wees ervan bewust dat nieuw getranscribeerde RNA bevat aanzienlijk minder volwassen rRNAs in vergelijking met de totale RNA met de typische rRNA bands wordt veel minder prominent.
Ribosoom profiling: PCR versterking van de cDNA Bibliotheek: versterking van cDNA (stap 4.9.1) is een cruciale stap om een goed rangschikkend resultaten. Versterkte bibliotheken analyseren door electrophoretical analyse. Een goed voorbeeld van versterkte bibliotheken toont een piek rond 140-160 bp (figuur 4A). Grote hoeveelheden van adapter Dimeren moeten worden vermeden (figuur 4B) en deze monsters verder moeten worden gezuiverd met behulp van de pagina zuivering procedure volgens de fabrikant protocol (pagina zuivering van PCR producten). Teveel sjabloon of te veel cycli van PCR kunnen leiden tot over-amplificatie gekenmerkt door het verschijnen van de hoger-dan-verwachte molecuulgewicht bands, vlekkerig PCR producten en adapter dimeer producten (figuur 4C). Voor de meeste monsters levert 1-5 µL van circularized cDNA en 9 cycli van PCR voor versterking meestal voldoende hoeveelheden van het juiste PCR product.
ChIP: chromatine schuintrekken: Optimale schuintrekken omstandigheden moeten worden aangepast voor elk type cel. Schuintrekken omstandigheden (bijvoorbeeld, aantal cycli, hoge of lage macht) vooraf bepalen. Gebruik hetzelfde aantal cellen en hetzelfde volume voor testdoeleinden, omdat een lagere celdichtheid de shearing efficiency verhoogt. Probeer te vermijden over - of onder-scheren de chromatine. Grote chromatine fragmenten kunnen drastisch invloed op ChIP resultaten door verstopping, en overdreven schuintrekken epitopes op de proteïne van belang, wat leidt tot een lagere bindende efficiëntie door het antilichaam kan vernietigen. In dit experiment, de beste resultaten werden behaald wanneer het belangrijkste gedeelte van de sheared chromatine ongeveer 1.000 was bp of iets lager (figuur 5A).
Verifiëren ChIP door qPCR: Voordat u begint de ChIP, is het raadzaam om te testen of het gebruikte antilichaam geschikt voor de ChIP is (indien mogelijk, gebruik ChIP rang antilichamen) door ChIP-qPCR. Controleren van de ChIP voor het rangschikken door qPCR voordat de bibliotheek voorbereiding (zie stap 5.6.5). Het ontwerpen van inleidingen die zich aan een bekende doelsite van de proteïne van belang binden. Als de exacte doelsite binnen een gen onbekend is, kunnen verschillende primerparen worden gebruikt voor het scannen van het gen en de bijbehorende regelgevende elementen. Voor de RNAPII ChIP van Th1 cellen Ifng, die is transcriptionally upregulated op stimulatie en actine inleidingen kunnen als positieve controle worden gebruikt. Sox9 en insuline dienen als een negatieve controle, aangezien deze genen niet worden uitgedrukt in Th1 cellen (figuur 5B). Vergeet niet om gebruik van de exon-spanning primers, die normaal gesproken worden gebruikt voor qPCR van mRNA. Een IgG-controle kan ook worden gebruikt om aan te tonen van de specificiteit van het gebruikte antilichaam. Immunoprecipitated DNA kan worden gemeten met een geschikt Fluorimeter (Zie Tabel van materialen). Hoeveelheid nonspecifically afhankelijke DNA door de IgG-besturingselement moeten worden aanzienlijk lager in vergelijking met het bedrag van de DNA gebonden door het antilichaam van belang.
Wordt uitgevoerd, repliceert: bewijs van biologische betekenis: Het is sterk aangeraden om uit te voeren van de kinetische experiment voor alle methoden vanaf dezelfde groep cellen om cellen hebben dezelfde identiteit voor alle onbehandelde en behandelde monsters (Figuur 2). Toch is het aanbevolen om het nemen van kleine porties van de belangrijkste tijdstippen voor elke methode om te vergelijken monsters te een biologische repliceren (bijvoorbeelddoor qPCR, FACS analyse). Dit zorgt voor een ruwe schatting als de behandeling van beide replicatieonderzoeken reproduceerbaar was en je kon doorgaan met sequencing. Validatie van de replicatieonderzoeken moet worden verricht door middel van bioinformatical analyse. Reproduceerbaarheid van de resultaten kan worden beoordeeld in termen van de correlatie tussen FPKM waarden tussen wordt gerepliceerd en gevisualiseerd met behulp van scatter percelen (Figuur 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig1.jpg"> Figuur 1: Controle van de optimale 4sU-labeling omstandigheden zonder storing veroorzaakt celfysiologie (figuur van Davari et al.. 11) (A) detectie van apoptosis van de cel FACS analyse: In vitro gegenereerd Th0 cellen werden behandeld met verschillende concentraties van 4sU (aangegeven in vierkante haken) voor 0.5 h, 1 h en 2 h, respectievelijk. BH3I-1 behandeling werd gebruikt voor het opwekken van apoptosis bepaald door Annexine V, overwegende dat warmte schok (5 min bij 95 ° C) werd gebruikt voor het opwekken van de dood van de cel bepaald door 7-AAD. (B) westelijke vlekkenanalyse voor p53 van 4sU behandeld en T-cellen geactiveerd: monsters waren gelabeld met 200 µM 4sU voor de aangegeven tijd van de activering, behalve 0.5 h tijd daarover was gelabeld met 500 µM 4sU. (C) westelijke vlekkenanalyse van phospho-EIF2a en totale EIF2a in geactiveerde Th1 cellen met dezelfde labeling voorwaarden zoals in (B). Thapsigargin werd gebruikt als positieve controle. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig2.jpg"> Figuur 2: Schematisch overzicht van een kinetische setup genoom-brede wijzigingen bijhouden Dit schema illustreert de setup voor het combineren van 4sU-seq, totaal RNA-seq ribosoom Profiling en ChIP-seq te bestuderen van genoom-brede veranderingen bij de behandeling van de cel. Bundelen van cellen en zet opzij het vereiste aantal cellen voor onbehandeld controlegewas. Behandelen van de resterende cellen en split voor elk punt methode en tijd. Label onbehandeld/behandeld cellen voor 4sU-seq met 4sU zoals beschreven. Tijdstippen en monsters voor elke methode is afhankelijk van de specifieke biologische vraag onderzocht. Nemen van monsters voor elk tijdstip en elke methode en volgen het specifieke deel van het protocol. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig3.jpg"> Figuur 3: controle van de kwaliteit van 4sU-label RNA Totaal RNA en biotinyleerd RNA geactiveerde Th1 cellen verkregen werden geanalyseerd op een Bioanalyzer. 18s rRNA en 28 rRNA staan en RNA integriteit nummer (RIN) wordt gegeven door het instrument om de integriteit van het RNA. RIN moet ≥8 om RNA integriteit te garanderen. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig4.jpg"> Figuur 4: Bioanalyzer profielen van ribosoom profiling libraries (A) A goede bibliotheek: het voorbeeld toont een piek op de verwachte groottewaaier (140-160 bp) en geen verdere zuivering nodig is. (B) dit voorbeeld toont buitensporige adapter dimeer versterkte product (120 bp) ten opzichte van het gewenste product (140-160 bp). Deze bibliotheek vereist verdere zuivering. (C) een overdreven versterkte monster: hoger-dan-verwachte molecuulgewicht pieken en vlekkerig PCR waarbij zichtbaar zijn (aangegeven door de pijlen). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig5.jpg"> Figuur 5: Optimale chromatine grootte na het scheren en verificatie van de ChIP door qPCR (A) Agarose gel foto de omvang van de optimale fragment van de sheared chromatine van drie monsters die zijn geschoren voor 25 cycli op een ultrasoonapparaat en gezuiverd toont zoals beschreven in het protocol. (B) Q-PCR-resultaten van een totale RNAPII ChIP (anti-RNA Pol II, 8WG16, ab817) wordt weergegeven als een percentage van de input. Ifng en actine inleidingen werden gebruikt als een positief, terwijl Sox9 en insuline negatieve controles zijn (beide genen zijn niet uitgedrukt in geactiveerde Th1-cellen). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig6.jpg"> Figuur 6: Vergelijking van biologische repliceert (figuur van Davari et al. 11) Representatieve scatterplot expressie waarden (FPKM) te vergelijken tussen repliceert van nieuw getranscribeerde (4sU) RNA 4 h na stimulatie van geactiveerde Th1-cellen. De groene lijn geeft aan gelijke FPKM waarden en rangschikking correlatie in ieder waarnemingspunt is aangegeven.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Duur van labeling (min)</td>
			<td>Aanbevolen 4sU concentratie (µM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>120</td>
			<td>100 - 200</td>
		</tr>
<tr>
<td>60</td>
			<td>200 - 500</td>
		</tr>
<tr>
<td>15 - 30</td>
			<td>500 - 1000</td>
		</tr>
<tr>
<td>< 10</td>
			<td>500 - 2000</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Aanbevolen 4sU concentraties (uit Rädle, et al.. 19) Het bereik van de aanbevolen 4sU concentraties is geïndiceerd voor verschillende tijden van labeling.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Methode</td>
			<td>Mobiele nummer</td>
			<td>RNA bedrag</td>
		</tr>
<tr>
<td>4sU-labeling</td>
			<td>≥2 x 107
</td>
			<td>≥60µg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ribosoom profilering</td>
			<td>≥2 x107
</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>ChIP-seq</td>
			<td>≥2 x 107 - 3 x 107
</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: Benodigde hoeveelheid primaire T-cellen Minimale hoeveelheid benodigde primaire T-cellen voor elke methode. Bedragen kunnen kleiner zijn dan bij het gebruik van andere celtypes.

Dit protocol beschrijft het combinatorische gebruik van ChIP-seq, 4sU-seq en totaal RNA-seq ribosoom profilering voor cellijnen en primaire cellen. Hierdoor wijzigingen bijhouden in transcriptiefactor bindend, DOVO transcriptie, RNA-verwerking, omzet en vertaling na verloop van tijd, en de algemene gang van zaken in geactiveerd en/of snel veranderende cellen weer te geven.

Real-time analyse van transcriptiefactor bindend, transcriptie, vertaling en omzet globale u gebeurtenissen wilt weergeven tijdens de activatie van de cellulaire

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Het algemene doel van deze experimentele opstelling is om de belangrijkste lagen van RNA- en DNA-regulatie te omlijnen om de belangrijkste moleculaire mechanismen die optreden als reactie op een stimulus of behandeling te onthullen. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen te beantwoorden in vele verschillende biologische vakgebieden, zoals immuunresponsen in het algemeen, maar ook moleculaire reacties op medicamenteuze behandeling. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het je in staat stelt om meerdere lagen van genexpressieregulatie tegelijkertijd over tijd weer te geven.Daarom is het belangrijk om voor elke methode dezelfde pool van cellen te gebruiken. In het algemeen omvatten deze drie protocollen eerst het manipuleren van cellen van belang op verschillende tijdstippen. Na elke manipulatie worden de cellen gepoold en verdeeld in drie groepen, één voor elke test.Dit gedeelte van de video beschrijft het labelen en zuiveren van de meest recent geproduceerde transcripten met behulp van 4sU-labeling. Elk protocol produceert uiteindelijk monsters die klaar zijn voor sequencing. Zoek eerst de vereiste 4sU-concentratie en incubatietijd op die nodig zijn voor de cellijn van belang.Bijvoorbeeld, 200 micromolar 4sU wordt gebruikt op T-cellen gedurende één uur. Scheid de pool van cellen na de behandeling in één aparte schotel voor elke methode en tijdstip. Ontdooi vervolgens het vereiste aantal 4sU-aliquots volledig en voeg de 4sU direct toe aan het celmedium en incubeer de culturen zoals aangegeven.Verzamel vervolgens de 4sU-gelabelde cellen in polypropyleen buisjes. Centrifugeer vervolgens de cellen. Resuspendeer het pellet in TRIzol op ongeveer drie miljoen cellen per milliliter en incubeer de cellen in TRIzol op kamertemperatuur gedurende vijf minuten.Bereid nu 30 tot 80 microgram RNA, of meer, voor volgens de methode van Radle en bedrijf. Meng vervolgens de thiol-specifieke biotinyleringsreactie in deze volgorde. Begin met nuclease-vrij water, vervolgens 10-voudig buffer, vervolgens RNA en als laatste biotin-HPDP.Meng vervolgens met pipetteren en incubeer. Ga verder met de opruimstap om monsters van nieuw getranscribeerd biotinyleerd RNA gemengd met ongelabeld, reeds bestaand RNA te produceren. Verwarm vervolgens de monsters gedurende 10 minuten tot 65 graden Celsius.Plaats ze vervolgens onmiddellijk op ijs. Zodra elk monster is afgekoeld, voeg 100 microliter streptavidin-kralen toe en incubeer ze gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur met rotatie. Isoleerd nu de kralen die zijn versierd met nieuw getranscribeerd RNA met behulp van een magnetische kolom en eluteer vervolgens het RNA in 11 microliter nuclease-vrij water voor sequenering.Dit gedeelte beschrijft hoe RNA te isoleren die actief wordt vertaald. Het sequenceren van deze transcripten onderzoekt het dynamische translatosoom. In combinatie met RNA-sequencinggegevens maakt deze test het mogelijk om de RNA-omzet en translatiesnelheden te berekenen.Begin met het toevoegen van cycloheximide aan de suspensie en meng het met behulp van inversies. Na één minuut bij kamertemperatuur, centrifugeer de cellen, verwijder het medium en was de cellen met ten minste 10 milliliter PBS aangevuld met cycloheximide. Aspirier vervolgens het medium en vervang het met 100 microliters zoogdiercel lysisbuffer per 10 miljoen cellen.Tritureer het mengsel om de cellen te lysen met behulp van een 20 tot 25-gauge naald. Breng vervolgens het cellysaat over naar een voorgekoelde 1,50-milliliter buis en incubeer het lysaat gedurende 10 minuten op ijs met periodieke inversies. Na 10 minuten centrifugeer het lysaat en breng het supernatant over in een koele 1,5-milliliter buis.Bereid vervolgens een 1 tot 10 verdunning van het lysaat in nuclease-vrij water en meet de absorptie bij 260 nanometer. Maak vervolgens 200-microliter aliquots van het onverdunde lysaat en behandel elk met 7,5 eenheden nuclease voor elke eenheid absorptie. Laat de nuclease 45 minuten reageren en beëindig vervolgens de reactie met 15 microliter RNase-remmer, of bewaar op negatief 80 graden Celsius.Zuiver vervolgens het RPF RNA met behulp van een commercieel kit en volg met een rRNA-depletie, ook met behulp van een kit. Voer vervolgens een PAGE-zuivering uit op 500 nanogram geïsoleerd RPF RNA. Na het voorbereiden van de monsters om in de gel te laden, denatureer ze, de laatste en controles, met een vijf minuten incubatie bij 95 graden Celsius.Voer vervolgens de monsters uit bij 180 volt gedurende ongeveer 75 minuten en beoordeel de resultaten. Voor het verzamelen van gelslices, prik gaten in de bodem van een 0,5-milliliter buis met behulp van een steriele 20-gauge naald. Snijd vervolgens gelslices uit die overeenkomen met de 28 tot 30 base nucleotide regio en breng ze over naar de voorbereide 0,5-milliliter buisjes.Neem een ​​monster van de RNA-controle en een monster van de negatieve controle op om te controleren op besmetting. Laad vervolgens de kleine, afgesloten monsters in grotere microcentrifugebuisjes. Centrifugeer vervolgens de assemblages om de gel te vernietigen en breng het monster over naar de 1,5-milliliter buis.Voeg vervolgens water, ammoniumacetaat en SDS toe aan de monsters om het RNA te elueren in een overnachtelijke reactie bij vier graden Celsius. Gebruik vervolgens een commercieel kit om een ​​cDNA-bibliotheek te maken van de kleine RNA en ga verder met het sequencen van de cDNA-bibliotheek. ChIP-seq wordt gebruikt om de binding van een transcriptiefactor van belang doorheen een genoom in kaart te brengen.Gecombineerd met gegevens van ribosoomprofilering en de enquête van alle nieuwe transcripten, onthult ChIP-seq de daadwerkelijke impact van transcriptiefactorbinding. Om te beginnen, kruislink de celmonsters met behulp van formaldehyde tot een eindconcentratie van 1%. Stop de reactie na 10 minuten bij kamertemperatuur met zacht schudden door de glycineconcentratie te verhogen tot 0,125 molair. Verzamel vervolgens de cellen en was ze drie

real-time-analysis-transcription-factor-binding-transcription

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Dit protocol beschrijft hoe chromatine immunoprecipitatie (ChIP) wordt gebruikt om de dynamische wijzigingen studie naar de chromatine sjabloon die transcriptie veroorzaakt door een signaal transductie route te reguleren.

Chromatine Immunoprecipitatie (ChIP) om Assay Dynamic histon-eiwitten in Actieve genexpressie in menselijke cellen

RNA polymerase II transcriptionele kinetiek worden gemeten op specifieke genen in levende cellen. mRNA getranscribeerd van het gen van belang zijn fluorescent gelabeld en het gebruik van Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) de in vivo kinetiek van transcriptionele rek worden verkregen.

Het meten van de kinetiek van mRNA transcriptie in Single levende cellen

We beschrijven een werkwijze fluorescentiemicroscopie, co-translationele activering door splitsing (CoTrAC), het afbeelden van de productie van eiwitmoleculen in levende cellen met enkele molecule precisie zonder verstoren van het eiwit functionaliteit. Deze methode is gebruikt om de expressie stochastische dynamiek van een transcriptiefactor, de λ repressor CI...

Single-molecule Imaging van genregulatie<em&gt; In vivo</em&gt; Met behulp van Cotranslational Activering door splitsing (CoTrAC)

Ribosomen spelen een centrale rol in de eiwitsynthese. Polyribosome (polysome) fractionering van sucrose dichtheidsgradiëntcentrifugatie maakt een directe bepaling van de vertaling efficiëntie van de individuele mRNA's op een genoom-brede schaal. Bovendien kan deze methode worden gebruikt voor biochemische analyse van de ribosoom-en-polysome geassocieerde factoren zoals chaperonnes en signaalmoleculen.

Polysome fractionering en analyse van zoogdieren Translatomes op een genoom-brede schaal

Hier stellen we een strategie voor om het effect van een transcriptiefactor van belang op het microRNA-transcriptoom te bestuderen met behulp van openbaar beschikbare gegevens, computationele bronnen en high-throughput gegevens van microRNA-arrays na het transfecteren van cellen met kleine hairpin (sh)RNA die zich richten op een transcriptiefactor van belang.

Het beschrijven van een transcriptiefactor Afhankelijk verordening van het MicroRNA Transcriptome

Chromatin immunoprecipitatie (chip) is een krachtig hulpmiddel voor het begrijpen van de moleculaire mechanismen van genregulatie. De methode omvat echter moeilijkheden bij het verkrijgen van reproduceerbare chromatine fragmentatie door mechanische afschuiving. Hier bieden we een verbeterd protocol voor een ChIP assay met enzymatische spijsvertering.

Chromatische immunoprecipitatie test met behulp van Micrococcal nucleasen in zoogdiercellen

Neurale stam/voorlopercellen vertonen verschillende expressie dynamiek van Inkeping signalering componenten die leiden tot verschillende uitkomsten van cellulaire gebeurtenissen. Een dergelijke dynamische uitdrukking kan worden onthuld door real-time monitoring, niet door statische analyse, met behulp van een zeer gevoelig bioluminescentie beeldvormings systeem dat visualisatie van snelle veranderingen in genexpressies mogelijk maakt.

Real-time bioluminescentie beeldvorming van Inkeping signalering dynamiek tijdens Murine neurogenese

Kinetische cross-linking en analyse van cDNA is een methode die onderzoek mogelijk maakt naar de dynamiek van eiwit-RNA interacties in levende cellen met een hoge temporele resolutie. Hier wordt het protocol in detail beschreven, inclusief de groei van gistcellen, UV-crosslinking, oogsten, eiwitzuivering en voorbereidingsstappen voor de volgende generatie sequencingbibliotheek.

Monitoring van eiwit-RNA interactiedynamica in vivo bij hoge temporele resolutie met behulp van χCRAC

Intrinsiek ongeordende domeinen zijn belangrijk voor de functie van de oncogene fusietranscriptiefactor. Om deze eiwitten therapeutisch te targeten, is een meer gedetailleerd begrip van de regulerende mechanismen die door deze domeinen worden gebruikt, vereist. Hier gebruiken we transcriptomics om belangrijke structurele kenmerken van het intrinsiek ongeordende EWS-domein in Ewing-sarcoom in kaart te brengen.

Het in kaart brengen van de structuur-functierelaties van ongeordende oncogene transcriptiefactoren met behulp van transcriptomische analyse

Dit protocol presenteert een nieuw reporter-gensysteem en de experimentele opstelling om transcriptie te detecteren bij DNA-dubbelstrengsbreuken met gevoeligheid van één molecuul.

Live-Cell Imaging van transcriptionele activiteit bij DNA Double-Strand Breaks

Van veel intrinsiek ongeordende eiwitten is aangetoond dat ze deelnemen aan de vorming van zeer dynamische biomoleculaire condensaten, een gedrag dat belangrijk is voor tal van cellulaire processen. Hier presenteren we een op beeldvorming gebaseerde methode met één molecuul voor het kwantificeren van de dynamiek waarmee eiwitten met elkaar interageren in biomoleculaire condensaten in levende cellen.

Meting van de dynamiek van eiwitinteracties in biomoleculaire condensaten

Leer een gecombineerde methode voor genregulatie-analyse met ChIP-seq, 4sU-seq en ribosoomprofilering in cellijnen en primaire cellen. Deze aanpak volgt transcriptiefactorbinding, transcriptie en vertaling in tijd.

Real-time analyse van transcriptiefactor bindend, transcriptie, vertaling en omzet globale u gebeurtenissen wilt weergeven tijdens de activatie van de cellulaire (Video) | JoVE Journal

Real-time analyse van transcriptiefactor bindend, transcriptie, vertaling en omzet globale u gebeurtenissen wilt weergeven tijdens de activatie van de cellulaire

Meer video's verkennen