Real-time analyse van transcriptiefactor bindend, transcriptie, vertaling en omzet globale u gebeurtenissen wilt weergeven tijdens de activatie van de cellulaire
7 maart 2018
Dit protocol beschrijft het combinatorische gebruik van ChIP-seq, 4sU-seq en totaal RNA-seq ribosoom profilering voor cellijnen en primaire cellen. Hierdoor wijzigingen bijhouden in transcriptiefactor bindend, DOVO transcriptie, RNA-verwerking, omzet en vertaling na verloop van tijd, en de algemene gang van zaken in geactiveerd en/of snel veranderende cellen weer te geven.
Het algemene doel van deze experimentele opstelling is om de belangrijkste lagen van RNA- en DNA-regulatie te omlijnen om de belangrijkste moleculaire mechanismen die optreden als reactie op een stimulus of behandeling te onthullen. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen te beantwoorden in vele verschillende biologische vakgebieden, zoals immuunresponsen in het algemeen, maar ook moleculaire reacties op medicamenteuze behandeling. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het je in staat stelt om meerdere lagen van genexpressieregulatie tegelijkertijd over tijd weer te geven.
Daarom is het belangrijk om voor elke methode dezelfde pool van cellen te gebruiken. In het algemeen omvatten deze drie protocollen eerst het manipuleren van cellen van belang op verschillende tijdstippen. Na elke manipulatie worden de cellen gepoold en verdeeld in drie groepen, één voor elke test.
Dit gedeelte van de video beschrijft het labelen en zuiveren van de meest recent geproduceerde transcripten met behulp van 4sU-labeling. Elk protocol produceert uiteindelijk monsters die klaar zijn voor sequencing. Zoek eerst de vereiste 4sU-concentratie en incubatietijd op die nodig zijn voor de cellijn van belang.
Bijvoorbeeld, 200 micromolar 4sU wordt gebruikt op T-cellen gedurende één uur. Scheid de pool van cellen na de behandeling in één aparte schotel voor elke methode en tijdstip. Ontdooi vervolgens het vereiste aantal 4sU-aliquots volledig en voeg de 4sU direct toe aan het celmedium en incubeer de culturen zoals aangegeven.
Verzamel vervolgens de 4sU-gelabelde cellen in polypropyleen buisjes. Centrifugeer vervolgens de cellen. Resuspendeer het pellet in TRIzol op ongeveer drie miljoen cellen per milliliter en incubeer de cellen in TRIzol op kamertemperatuur gedurende vijf minuten.
Bereid nu 30 tot 80 microgram RNA, of meer, voor volgens de methode van Radle en bedrijf. Meng vervolgens de thiol-specifieke biotinyleringsreactie in deze volgorde. Begin met nuclease-vrij water, vervolgens 10-voudig buffer, vervolgens RNA en als laatste biotin-HPDP.
Meng vervolgens met pipetteren en incubeer. Ga verder met de opruimstap om monsters van nieuw getranscribeerd biotinyleerd RNA gemengd met ongelabeld, reeds bestaand RNA te produceren. Verwarm vervolgens de monsters gedurende 10 minuten tot 65 graden Celsius.
Plaats ze vervolgens onmiddellijk op ijs. Zodra elk monster is afgekoeld, voeg 100 microliter streptavidin-kralen toe en incubeer ze gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur met rotatie. Isoleerd nu de kralen die zijn versierd met nieuw getranscribeerd RNA met behulp van een magnetische kolom en eluteer vervolgens het RNA in 11 microliter nuclease-vrij water voor sequenering.
Dit gedeelte beschrijft hoe RNA te isoleren die actief wordt vertaald. Het sequenceren van deze transcripten onderzoekt het dynamische translatosoom. In combinatie met RNA-sequencinggegevens maakt deze test het mogelijk om de RNA-omzet en translatiesnelheden te berekenen.
Begin met het toevoegen van cycloheximide aan de suspensie en meng het met behulp van inversies. Na één minuut bij kamertemperatuur, centrifugeer de cellen, verwijder het medium en was de cellen met ten minste 10 milliliter PBS aangevuld met cycloheximide. Aspirier vervolgens het medium en vervang het met 100 microliters zoogdiercel lysisbuffer per 10 miljoen cellen.
Tritureer het mengsel om de cellen te lysen met behulp van een 20 tot 25-gauge naald. Breng vervolgens het cellysaat over naar een voorgekoelde 1,50-milliliter buis en incubeer het lysaat gedurende 10 minuten op ijs met periodieke inversies. Na 10 minuten centrifugeer het lysaat en breng het supernatant over in een koele 1,5-milliliter buis.
Bereid vervolgens een 1 tot 10 verdunning van het lysaat in nuclease-vrij water en meet de absorptie bij 260 nanometer. Maak vervolgens 200-microliter aliquots van het onverdunde lysaat en behandel elk met 7,5 eenheden nuclease voor elke eenheid absorptie. Laat de nuclease 45 minuten reageren en beëindig vervolgens de reactie met 15 microliter RNase-remmer, of bewaar op negatief 80 graden Celsius.
Zuiver vervolgens het RPF RNA met behulp van een commercieel kit en volg met een rRNA-depletie, ook met behulp van een kit. Voer vervolgens een PAGE-zuivering uit op 500 nanogram geïsoleerd RPF RNA. Na het voorbereiden van de monsters om in de gel te laden, denatureer ze, de laatste en controles, met een vijf minuten incubatie bij 95 graden Celsius.
Voer vervolgens de monsters uit bij 180 volt gedurende ongeveer 75 minuten en beoordeel de resultaten. Voor het verzamelen van gelslices, prik gaten in de bodem van een 0,5-milliliter buis met behulp van een steriele 20-gauge naald. Snijd vervolgens gelslices uit die overeenkomen met de 28 tot 30 base nucleotide regio en breng ze over naar de voorbereide 0,5-milliliter buisjes.
Neem een monster van de RNA-controle en een monster van de negatieve controle op om te controleren op besmetting. Laad vervolgens de kleine, afgesloten monsters in grotere microcentrifugebuisjes. Centrifugeer vervolgens de assemblages om de gel te vernietigen en breng het monster over naar de 1,5-milliliter buis.
Voeg vervolgens water, ammoniumacetaat en SDS toe aan de monsters om het RNA te elueren in een overnachtelijke reactie bij vier graden Celsius. Gebruik vervolgens een commercieel kit om een cDNA-bibliotheek te maken van de kleine RNA en ga verder met het sequencen van de cDNA-bibliotheek. ChIP-seq wordt gebruikt om de binding van een transcriptiefactor van belang doorheen een genoom in kaart te brengen.
Gecombineerd met gegevens van ribosoomprofilering en de enquête van alle nieuwe transcripten, onthult ChIP-seq de daadwerkelijke impact van transcriptiefactorbinding. Om te beginnen, kruislink de celmonsters met behulp van formaldehyde tot een eindconcentratie van 1%. Stop de reactie na 10 minuten bij kamertemperatuur met zacht schudden door de glycineconcentratie te verhogen tot 0,125 molair. Verzamel vervolgens de cellen en was ze drie
Overzicht
Dit protocol beschrijft het combinatorische gebruik van ChIP-seq, 4sU-seq, totale RNA-seq en ribosoomprofilering voor cellijnen en primaire cellen. Hiermee kunnen veranderingen in transcriptiefactorbinding, de novo transcriptie, RNA-verwerking, turnover en translatie in de loop van de tijd worden gevolgd, en kan het algemene verloop van gebeurtenissen in geactiveerde en/of snel veranderende cellen worden weergegeven.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Moleculaire biologie
Achtergrond
- Deze methode helpt bij het beantwoorden van kernvragen in diverse biologische vakgebieden.
- Het maakt de gelijktijdige weergave van meerdere lagen van genregulatie over een tijdsverloop mogelijk.
- Het gebruik van dezelfde pool cellen voor elke methode is cruciaal voor nauwkeurige resultaten.
- De protocollen behelzen het manipuleren van cellen op verschillende tijdstippen.
Doel van de studie
- Om de belangrijkste lagen van RNA- en DNA-regulatie af te bakenen.
- Om de belangrijkste moleculaire mechanismen als reactie op stimuli of behandelingen te ontsluieren.
- Om immuunresponsen en moleculaire reacties op medicamenteuze behandelingen te analyseren.
Gebruikte methoden
- 4sU-labeling voor het isoleren van nieuw getranscribeerd RNA.
- Ribosoomprofilering om het dynamische translatosoom te analyseren.
- ChIP-seq voor het in kaart brengen van de binding van transcriptiefactoren over het gehele genoom.
- Sequencing van RNA-monsters om genregulatie te analyseren.
Belangrijkste resultaten
- Simultane analyse van transcriptiefactorbinding en RNA-dynamiek.
- Inzichten in RNA-omzetting en translatiesnelheden.
- Onthulde de impact van transcriptiefactorbinding op genexpressie.
- Bood een uitgebreid overzicht van cellulaire responsen op stimuli.
Conclusies
- De gecombineerde aanpak vergroot het begrip van genregulatie.
- Het biedt een krachtig instrument voor het bestuderen van cellulaire responsen in diverse contexten.
- Toekomstige toepassingen kunnen worden uitgebreid naar andere biologische vakgebieden.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Gelijktijdige real-time analyse van transcriptiefactorbinding, transcriptie, translatie en RNA-omzetting biedt een uitgebreid overzicht van de dynamiek van genregulatie tijdens cellulaire activatie. Deze geïntegreerde aanpak verhoogt het voorspellende vertrouwen bij doelwitvalidatie en mechanische risicobeperking op kritieke beslismomenten tijdens de ontdekking. De methode ondersteunt zakelijke R&D door robuuste, meerlaagse moleculaire profilering mogelijk te maken als reactie op stimuli of blootstelling aan geneesmiddelen.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt directe analyse van transcriptiefactorbinding en downstream genregulatie-events mogelijk.
- Ondersteunt mechanistische risicoreductie door transcriptionele veranderingen te koppelen aan functionele eiwitsynthese.
- Faciliteert functionele targetvalidatie via genoombrede, tijdsopgeloste moleculaire profilering.
- Verbetert het voorspellende vertrouwen voor portfoliotriage door meerdere regulatielagen te integreren.
Screening & Assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream compound-screening door transcriptionele en translationele responsen te kwantificeren.
- Standaardiseert assay-outputs met reproduceerbare, kwantitatieve sequencinggegevens over verschillende regulatoire lagen.
- Maakt schaalbare high-throughput analyse van genexpressie en translatie mogelijk voor screening-gereedheid.
- Ondersteunt een betrouwbare evaluatie van compound-effecten op genregulatie en eiwitsynthese.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt moleculaire read-outs uit met ziekte-relevante cellulaire activatiemodellen en modellen voor drugrespons.
- Waarborgt continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door genregulatie-events in de tijd te volgen.
- Ondersteunt risicogebaseerde beslissingen over voortgang door uitgebreide moleculaire data te verschaffen.
- Verbetert voorspellende risicoreductie voor de ontwikkeling van translationele biomarkers wanneer dit door de data wordt ondersteund.
Integratie van Pijplijn & Workflow
Deze combinatorische sequentieworkflow slaat een brug tussen vroege ontdekking, lead-identificatie en preklinisch onderzoek door real-time, meerlaagse moleculaire analyse mogelijk te maken in één enkel experimenteel continuüm.
- Ontdekkingsbiologie: Integreert hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door de binding van transcriptiefactoren en downstream-effecten in kaart te brengen.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten voor assay-ontwikkeling en evaluatie van verbindingen.
- Analytica: Biedt hoge-resolutiemetingen van transcriptie, translatie en RNA-turnover voor comparatieve analyse.
- Translationeel onderzoek: Verbindt moleculaire gebeurtenissen met ziekterelateerde cellulaire responsen en drugmechanismen.
- Enterprise hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor multi-omische profilering over diverse celtypen en stimuli.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij targetvalidatie.
- Operationele waarde: Standaardiseert meerlaagse moleculaire assays voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Maakt geïnformeerde go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiënt portfoliomanagement mogelijk.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risicogebaseerde prioritering en de verdere ontwikkeling van ontdekkingsprogramma's.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist expertise in moleculaire biologie, sequencing en bioinformatische analyse.
- Vraagt om toegang tot high-throughput sequencing-platforms en analytische infrastructuur.
- Noodzaak van strikte standaardisatie tussen teams voor monstervoorbereiding en gegevensverwerking.
- Aanpasbaar aan diverse modelsystemen, waaronder primaire cellen en verschillende organismen.
- Potentiële beperkingen omvatten celstress door labeling en de noodzaak van zorgvuldige levensvatbaarheids- en kwaliteitscontroles.
