De oprichting van een Long kolonisatie Assay voor het circulerende Tumor visualisatie van de cel in de weefsels van de longen

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van kankermetastase over de rol van kolonisatie van de longen bij het bereiken van kankermetastase. Het grote voordeel van deze techniek is dat vroeg extravaseerde kankercellen in de longen tijdens kankermetastase kunnen worden gevisualiseerd. De procedure zal worden gedemonstreerd door Cheng-Han Yang, een doctoraatsstudent uit mijn laboratorium.

Wanneer de tumorcelcultuur 70 tot 80 procent confluëntie heeft bereikt, was de cultuur twee keer in twee milliliter steriele PBS per wasbeurt en voeg een milliliter van 0,5% Trypsin-EDTA toe aan de kweekschaal. Verwijder onmiddellijk 800 microliter van de supernatant en plaats de kweekschaal gedurende 30 tot 60 seconden op 37 graden Celsius totdat de meeste cellen zich hebben losgemaakt van de plaat. Voeg een milliliter vers medium toe, aangevuld met 10% FBS om de reactie te stoppen en gebruik een 1000 microliter pipette om de celoplossing krachtig te mengen.

Breng de resulterende enkele cel suspensie over in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en verzamel de cellen door centrifugatie. Herstel vervolgens de tumorcel pellet in 1,5 milliliter medium aangevuld met 20% FBS en roteren de cellen gedurende twee uur, bij 37 graden Celsius, van einde tot einde. Aan het einde van de incubatie, tel de levensvatbare cellen door trypanblauwe exclusie en verzamel ze door centrifugatie.

Herstel de pellet in een milliliter steriele PBS voor een tweede centrifugatie en herstel de pellet in 500 microliter PBS aangevuld met 10% FBS en 20 micro milliliter CFSE. Na tien minuten bij 37 graden Celsius in het donker, centrifugeer de cellen en herstel de pellet in vier milliliter medium aangevuld met één procent FBS voor een andere centrifugatie. Na de laatste wasbeurt, herstel de cellen tot een vijf maal tien tot de zesde tumorcellen per milliliter vers medium zonder FBS-concentratie, en plaats de cellen op ijs.

Verwarm vervolgens de staart van een vier tot zes weken oude mannelijke C570 Black Six muis gedurende vijf tot tien minuten om de staartaders te verwijden en gebruik een spuit van een milliliter uitgerust met een 26 en een halve gauge naald om de cellen grondig te mengen tot een enkele cel suspensie is bereikt. Laad voorzichtig de spuit met 200 microliter cellen en plaats de muis in een begrenzer. Injecteer vervolgens het gehele volume cellen in het lumen van een verwijde staartader.

Op het juiste tijdstip na injectie, maak een longitudinale incisie van de huid en onderhuids weefsel van de buik tot de borstkas en open de borstholte om het hart en de longen bloot te leggen. Gebruik steriele chirurgische hechtingen om de superieure en inferieure vena cava te binden om de terugstroom van de perfusieoplossing te voorkomen en gebruik een schaar om een spleet van twee tot vier millimeter in het linker ventrikel te maken om het afvoeren van de perfusie van de longen te vergemakkelijken. Gebruik vervolgens een spuit van drie milliliter om PBS in het rechter ventrikel te injecteren en gebruik continue zuiging om de afgevoerde oplossing te verwijderen tot de longen van roodachtige kleur volledig bleek worden.

Zorg ervoor dat de superieure en inferieure vena cava goed vastzitten voor een succesvolle longperfusie. Na het oogsten van de longen, plaats de lobben in een op maat gemaakte longhouder in een schaal van zes centimeter en bevestig de longen aan het geribbelde oppervlak van de houder. Bedek en bevochtig de lobben met PBS en plaats de kweekschaal op de beeldvormingsfase van een confocale microscoop.

Selecteer het 5x objectief en draai het filterwiel naar NIBA. Gebruik een 488 nanometer laser om de CFSE te exciteren om een duidelijke visualisatie van de fluoresceine blauw gelabelde tumorcellen binnen de longlobben mogelijk te maken. Draai het filterwiel naar R690 om te scannen met een snelheid van twee microseconden per pixel en optimaliseer de hoogspanningsversterking en offsetniveaus.

Vervolgens worden vijf 12 bij 5 12 pixel fluorescente beelden vastgelegd met een snelheid van 10 microseconden per pixel. Met behulp van de zojuist gedemonstreerde kleuringsmethode worden de tumorcellen effectief gelabeld met CFSE op een dosisafhankelijke manier. Met de fluorescentie-intensiteit van de kleuring, die bijna een plateau bereikt in zes keer 10 tot de vijfde Lewis longcarcinoomcellen per milliliter bij de 20 micromolar concentratie.

Longperfusie vóór het oogsten zoals zojuist gedemonstreerd, reinigt het longvaatbed van niet-specifiek gehakte circulerende tumorcellen vóór beeldvormingsanalyse. Fluorescerende confocale microscopie onthult de aanwezigheid van de koloniserende CFSE-gelabelde tumorcellen binnen de geoogste en geperfuseerde longlobben. Het gebruik van een geschikt beeldanalysesoftwareprogramma om de fluorescente beelden om te zetten in zwart-wit, vergemakkelijkt de kwantificering van de longkolonisatie.

Intraveneuze toediening van fibronectine-expresserende of scrambled fibronectine-expresserende Lewis longcarcinoomcellen toont een significant lager aantal fibronectine-expresserende cellen in longweefsel dat 38 en 45 uur na injectie is geoogst, wat de rol van fibronectine bij kolonisatie van longlobben en tumorontwikkeling benadrukt. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de longen zorgvuldig te perfunderen zodat de niet-bevestigde cellen kunnen worden weggespoeld. Na de ontwikkeling ervan, heeft deze techniek de weg geëffend voor onderzoekers op het gebied van kankermetastase om longkolonisatie door circulerende tumorcellen in een muis nul gram model te onderzoeken.

Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u tumorcelsuspensies fluorescent kunt labelen, tumorcellen intraveneus kunt inoculeren en muislongen kunt perfunderen, en confocale fluorescentiemicroscopie kunt gebruiken om de gemetastaseerde tumorcellen te beeldvormen.