Name: In Vivo Controle van de circadiane klok genexpressie in de muis Suprachiasmatic kern met behulp van fluorescentie verslaggevers (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Leer circadiane klokgenexpressie in de suprachiasmatische kern van muizen monitoren met fluorescentieverslaggevers. Deze methode werkt in licht-donker en donker-donker omstandigheden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken de leden in het lab Zhang voor het verstrekken van discussies en leden in het lab Zhan te stimuleren om technische bijstand te verlenen. Dit onderzoek werd gesteund door subsidies 31500860 (met C.Z.) van het NSFC, 2012CB837700 (om E.E.Z. en C.Z.) van het 973 programma van de M.O.S.T. van China, en door financiële middelen van de gemeentelijke overheid van Peking. E.E.Z. werd gesteund door de Chinezen "Recruitment programma van Global Youth deskundigen".

Alle procedures in dit protocol werden uitgevoerd met de goedkeuring van de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van het National Institute of Biological Sciences, Peking, overeenkomstig de bepalingen van de gouvernementele van China.
1. bouw van de Cry1 fluorescentie verslaggever
Opmerking: Vorige circadiane studies met behulp van de12van bioluminescentie systeem2,,13 zekering een circadiane promotor met een gedestabiliseerd luciferase (dLuc) voor het opwekken van ritmische dLuc expressie. Ontwikkeling van een verslaggever van de fluorescentie, werd gedestabiliseerd luciferase vervangen door gedestabiliseerd fluorescentie eiwit (dVenus) voor het opwekken van ritmische dVenus expressie. De generatie van de P (Cry1)-dVenus verslaggever is hieronder beschreven, de constructie waarvan momenteel wordt voorgelegd aan de Addgene en zal beschikbaar spoedig voor academisch gebruik.
<ol><li>Versterken van de functionele muis Cry1 promotor (+328 voor-1208 bp regio van het Cry1 gen, transcriptie start site uitgeroepen tot-'' 1 ''). Gebruik van het PCR-enzym (KOD Plus Neo), inleidingen F1 en R1 (Zie tabel 2), genoom muis als een sjabloon en van de fabrikant PCR protocol om te versterken van het Cry1 promotor DNA fragment.</li>
	<li>Intron 336 van het Cry1 -gen, dat belangrijk voor het functioneren van de circadiane klok van Cry114 iste versterken. Gebruik het enzym PCR inleidingen F2 en R2, muis genoom als een sjabloon en van de fabrikant PCR protocol om de intron 336 DNA fragment te vergroten.</li>
	<li>Versterken van Venus. Gebruik het enzym PCR inleidingen F3 en R3, pVENUS-N1 plasmide als een sjabloon en van de fabrikant PCR protocol om de Venus DNA fragment te vergroten.</li>
	<li>Versterken de NLS-D2 DNA-fragment. Gebruik het enzym PCR inleidingen F4 en R4, pcDNA3.3-d2eGFP plasmide als een sjabloon en van de fabrikant PCR protocol om de NLS-D2 DNA-fragment te vergroten.</li>
	<li>Synthetiseren DNA fragment 1 als exon 1.</li>
	<li>Synthetiseren fragment van DNA 2 als de linker tussen intron 336 en het Venus DNA fragment.</li>
	<li>Snijd de pAAV-EF1a-double floxed-hChR2 (H134R) - mCherry - WPRE-HGHpA vector plasmide met de MluI en EcoRI enzymen. Gebruik de Gel extractie Kit voor het zuiveren van de grotere fragment van DNA. Van de fabrikant-protocol gebruiken.</li>
	<li>Met behulp van een mix van de vergadering Gibson en haar standaardprotocol, monteren alle van de DNA-fragmenten samen te produceren van de pAAV-P (Cry1)-intron336-Venus-NLS-D2-WPRE-HGHpA verslaggever. Van de fabrikant-protocol gebruiken.</li>
</ol>2. productie van Adeno-associated Virus15
<ol><li>Voorbereiding van de volgende plasmide DNA voorraden: 31.25 µg voor pRV1, 31.25 µg pH21 125 µg voor pFdelta6 en 62,5 µg pAAV-P (Cry1) - intron336 - Venus-NLS - D2-WPRE-HGHpA.</li>
	<li>Vijf 15 cm schotels van 293T cellen voor te bereiden en wacht totdat de cellen 90% heuvels worden.</li>
	<li>Transfect de plasmiden in de cellen van de 297T na het protocol van de reagens van de transfectie. Gebruik voor elk gerecht, 6,25 µg pRV1, 6,25 µg van 25 µg voor pFdelta6, pH21, 12,5 µg pAAV-P (Cry1)-intron336-Venus-NLS-D2-WPRE-HGHpA, en 120 µL van transfectiereagens.</li>
	<li>72 uur na de transfectie, Los de cellen van elke plaat met behulp van een pipet pistool; het oogsten van de cellen in twee buizen van 50 mL.</li>
	<li>Pellet de cellen bij 800 x g gedurende 10 minuten en verwijder het supernatant. Wassen van de cellen door het plaatsen van 20 mL-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in elke buis; pellet de cellen bij 800 x g gedurende 10 minuten en verwijder het supernatant.</li>
	<li>Resuspendeer pellets in 150 mM NaCl en 20 mM Tris oplossing, pH 8.0; gebruik 25 mL van oplossing/buis. Voeg 1,25 mL vers bereide 10% natrium deoxycholate (in dH2O) aan elke buis. Benzonase nuclease toevoegen om een eindconcentratie van 50 eenheden per mL en meng. Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur.</li>
	<li>Cellulaire puin verwijderen door centrifugatie bij 3000 x g gedurende 15 minuten. Verder garanderen dat alle puin heeft zijn verwijderd door het indrukken van het mengsel door een filter van de spuit 0,45 μm; deze stap zal helpen voorkomen blokkering van heparine kolommen.</li>
	<li>De kolommen van de heparine gebruik een peristaltische pomp; instellen Stel het debiet op 1 mL/min, ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen in de kolommen worden binnengebracht.</li>
	<li>De kolommen met 10 mL van een 150 mM NaCl, 20 mM Tris oplossing, pH 8,0 equilibreer. De oplossing die met het virus aan elke kolom toevoegen. Was de kolommen met 20 mL van een 100 mM NaCl, 20 mM Tris oplossing, pH 8,0. Vervolgens met behulp van een spuit 5 mL, was de kolommen met 1 mL van een 200 mM NaCl en 20 mM Tris oplossing pH 8.0, gevolgd door 1 mL van een 300 mM NaCl en 20 mM Tris oplossing, pH 8,0.</li>
	<li>Gebruik een 5 mL-spuit om Elueer van het virus met 3 mL van een 400 mM NaCl, 20 mM Tris oplossing, pH 8.0, gevolgd door 4 mL van een 450 mM NaCl, 20 mM Tris oplossing, pH 8.0, en ten slotte door een 3 mL van een 500 mM NaCl , 20 mM Tris oplossing, pH 8.0. De uitgepakte materialen verzamelen.</li>
	<li>Voor recombinante adeno-associated virus (rAAV) de concentratie, de uitgepakte materialen, 4 mL tegelijk, in centrifugaal filter eenheden met een 100.000 moleculair gewicht cutoff te laden. Centrifugeer elk 4-mL monster bij 2000 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, teruggooi de doorstroming.</li>
	<li>Wanneer alle uitgepakte materialen zijn uitgevoerd door de centrifugale filter eenheden, Voeg 4 mL PBS en Centrifugeer het mengsel tot ongeveer 250 μL. Verwijderen van rAAVs (virale titer moet over 2-8 x 1012 virale deeltjes per mL) van de centrifugaal filter eenheden, aliquot en winkel bij-80 ° C tot gebruik. In dit stadium kan het virus worden opgeslagen voor enkele maanden.</li>
</ol>3. rAAV injectie en Optic Fiber invoegen in de volwassen muis SCN
<ol><li>Injectie van verslaggever-uitvoering rAAVs van circadiane fluorescentie in de SCN<ol>
<li>Laden van 5 µL van rAAV (de titer van het virus is over 2-8 x 1012 virusdeeltjes per mL) in een micro-spuit.</li>
		<li>Anesthetize een volwassen muis (2 tot 5-maand-oude, C57BL/6 achtergrond) met Nembutal (80 mg/kg) via intraperitoneale injectie. Controleren op voldoende diepte van verdoving door het ontbreken van een teen-snuifje reactie.</li>
		<li>Gebruik schaar te verwijderen bont uit de kop van de muis en dan mount de muis op een stereotaxic apparaat. Een warmtebron geven narcose dieren via een circulerende warm water deken of een ander verwarmingstoestel. Opmerking: Gebruik als alternatief, ontharende room of elektrische tondeuses voor het verwijderen van de vacht.</li>
		<li>Reinig de chirurgische site met de juiste ontsmetting agenten. Bijvoorbeeld, kon dit omvatten steriel water of alcohol en jodium, betadine, of verdund chloorhexidine afwisselend scrubs. Herhaal dit minstens 3 keer. Drape de chirurgische site.</li>
		<li>De schaar gebruik te maken van een incisie in de hoofdhuid en bloot de schedel.</li>
		<li>Aanpassen van het stereotaxic apparaat zodat bregma en lambda in hetzelfde horizontale vlak; Maak twee symmetrische punten van bregma in hetzelfde horizontale vlak.</li>
		<li>Gebruik een steriel katoenen doekje gedrenkt in 4% H2O2/H2O te corroderen de hersenen beenvlies. Gebruik dan een schoon, steriel katoenen doekje te wissen en droog het oppervlak van de schedel.</li>
		<li>Met behulp van een micro boor, maken een gat van ongeveer 1 mm in diameter 0.46 mm posterior en 0,25 mm laterale bregma.</li>
		<li>
fi Gebruik een schone katoenen steriel doekje met fysiologische zoutoplossing oplossing om te wissen van botfragmenten van het blootgestelde oppervlak van de hersenen.</li>
		<li>Plaats een micro-spuit in de hersenen, ervoor te zorgen dat het uiteinde van de micro-spuit 0.46 mm posterior en 0,25 mm laterale bregma en 5.7 mm diepe van de oppervlakte van de schedel.</li>
		<li>Injecteren van 500 nL van rAAV (50 nL min-1) in de SCN, verlaten van de micro-spuit in plaats gedurende 10 minuten na de injectie om ervoor te zorgen volledige verspreiding van rAAV.</li>
		<li>Langzaam trekt de micro-spuit.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Steek de optische vezel in de SCN-gebied.<ol>
<li>Met behulp van een optische vezel mes, snijd een vezel 17-mm in lengte, ervoor te zorgen dat elke zijde van de optische vezel glad is.</li>
		<li>Plaats van de optische vezel in de keramische verlengstuk en monteren van de optische vezel naar een keramische verlengstuk met methylethylketon peroxide (AB lijm), ervoor te zorgen dat het oppervlak van de glasvezel en keramische verlengstuk flush.</li>
		<li>Reinig de vezel met een koude sterilant oplossing of ethyleen oxide.</li>
		<li>Na rAAV injectie (stap 3.1.11), plaatst u de keramische verlengstuk-bevattende optische vezel in de SCN.</li>
		<li>De keramische verlengstuk en optische vezel op de schedel met behulp van tandheelkundige hars vast te stellen en laten drogen.</li>
		<li>Het oppervlak van de tandheelkundige hars smeren met terug nagellak. Herhaal de procedures die worden beschreven in 3.1.2 te 3.2.5, het weglaten van de werkelijke injectie van rAAV voor controle.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Post chirurgische zorg<ol>
<li>Voorzien van muizen postoperatieve pijnstillers, zoals buprenorfine 2 mg/kg lichaamsgewicht, subcutaan, twee keer per dag.</li>
		<li>Muizen in een kooi herstel plaatsen terwijl ze uit de narcose komen.</li>
		<li>Huis muizen individueel onder een 12u licht/donker voorwaarde (lichtintensiteit ~ 100 lux op de bodem van de kooi) met voedsel/water beschikbaar ad libitum. Acht dagen dient te worden toegekend vóór verdere experimenten om te voorzien in voldoende hersteltijd en om optimale fluorescentie verslaggever expressie.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. in vivo Fluorescence signaal bewaking en gegevensverzameling
<ol><li>Acht dagen na de operatie, eventueel gecombineerd met de vezel op de kop van de muis de fluorescentie signaal monitor (bv., Gene Observer). Controleer het signaal van de fluorescentie in de SCN van controle muizen om het signaal van de achtergrond. Het uitvoeren van de observatie en meting van dit signaal met behulp van fluorescentie signaal monitor.</li>
	<li>Het signaal van de fluorescentie van experimentele muis met dezelfde bewerking van de controle muis te evalueren. Uitsluiten muizen die hebben ontvangen de virale vector maar die het signaal van de achtergrond van analyse, worden alleen weergegeven als dit waarschijnlijk geeft aan dat het uiteinde van de optische vezel de SCN heeft gemist. Na deze eerste maatregelen door muizen te keren naar hun huis kooien voor nog 3 weken om het signaal van de fluorescentie te stabiliseren.</li>
	<li>Na 3 weken, sluit u de muizen met de fluorescentie signaal monitor. Meten van de fluorescentie voor 15 s elke 10 min, met een frequentie van 100 Hz. Tijdens deze metingen zijn de muizen vrij bewegen in hun kooien met voedsel/water beschikbaar ad libitum. Gebruik een lichtintensiteit aan de onderkant van de kooi van ~ 100 lux, en de kracht van de laser op het puntje van de optische vezel tussen 15-20 μW.</li>
	<li>Na de voltooiing van alle opnamen, muizen met 4% paraformaldehyde, perfuse en verwijderen en snijd de hersenen om te controleren van de plaatsing van de optische vezel. Uitsluiten muizen analyse als het uiteinde van de optische vezel is niet correct geïmplanteerd in de SCN.</li>
</ol>5. de gegevensanalyse en presentaties
<ol><li>Maatregel fluorescentie signaal elke 10 min voor 15 s, met een frequentie van 100 Hz, aan opbrengst 1500 gegevenspunten. Het gemiddelde van deze 1500 punten vertaalt naar het signaal van de fluorescentie op elk gegeven moment punt. Uitzetten van meerdere gemiddelden na verloop van tijd produceert een signaal-aan-tijd curve, die overeenkomt met het transcriptionele ritme van Cry1 onder een lichte voorwaarde van de controle in de SCN van vrij bewegende muizen.</li>
</ol>

<ol><li>Welsh, D. K., Takahashi, J. S., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suprachiasmatic+nucleus%3A+cell+autonomy+and+network+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Suprachiasmatic nucleus: cell autonomy and network properties.</a> Annual Review of Physiology. 72, 551-577 (2010).</li>
<li>Zhang, E. E., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clocks+not+winding+down%3A+unravelling+circadian+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Clocks not winding down: unravelling circadian networks.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 764-776 (2010).</li>
<li>Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+architecture+of+the+mammalian+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock.</a> Nature Reviews Genetics. 18, 164-179 (2017).</li>
<li>Yoo, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PERIOD2%3A%3ALUCIFERASE+real-time+reporting+of+circadian+dynamics+reveals+persistent+circadian+oscillations+in+mouse+peripheral+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 101, 5339-5346 (2004).</li>
<li>Davidson, A. J., Castanon-Cervantes, O., Leise, T. L., Molyneux, P. C., Harrington, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+jet+lag+in+the+mouse+suprachiasmatic+nucleus+and+peripheral+circadian+timing+system%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Visualizing jet lag in the mouse suprachiasmatic nucleus and peripheral circadian timing system.</a> European Journal of Neuroscience. 29, 171-180 (2009).</li>
<li>Savelyev, S. A., Larsson, K. C., Johansson, A. S., Lundkvist, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slice+preparation%2C+organotypic+tissue+culturing+and+luciferase+recording+of+clock+gene+activity+in+the+suprachiasmatic+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Slice preparation, organotypic tissue culturing and luciferase recording of clock gene activity in the suprachiasmatic nucleus.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).</li>
<li>Yamaguchi, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/35055628">Gene expression: View of a mouse clock gene ticking.</a> Nature. 409, 684-684 (2001).</li>
<li>Ono, D., Honma, K. I., Honma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+and+ultradian+rhythms+of+clock+gene+expression+in+the+suprachiasmatic+nucleus+of+freely+moving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Circadian and ultradian rhythms of clock gene expression in the suprachiasmatic nucleus of freely moving mice.</a> Science Reports. 5, 12310(2015).</li>
<li>Ono, D., Honma, S., Honma, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+PER2%3A%3ALUC+rhythms+in+the+olfactory+bulb+of+freely+moving+mice+depend+on+the+suprachiasmatic+nucleus+but+not+on+behaviour+rhythms%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Circadian PER2::LUC rhythms in the olfactory bulb of freely moving mice depend on the suprachiasmatic nucleus but not on behaviour rhythms.</a> European Journal of Neuroscience. 42, 3128-3137 (2015).</li>
<li>Ono, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+Per1+and+Bmal1+circadian+rhythms+in+the+suprachiasmatic+nucleus+in+parallel+with+behavioral+outputs%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dissociation of Per1 and Bmal1 circadian rhythms in the suprachiasmatic nucleus in parallel with behavioral outputs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 114, E3699-E3708 (2017).</li>
<li>Reppert, S. M., Weaver, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+circadian+timing+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coordination of circadian timing in mammals.</a> Nature. 418, 935-941 (2002).</li>
<li>Liu, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redundant+function+of+REV-ERBalpha+and+beta+and+non-essential+role+for+Bmal1+cycling+in+transcriptional+regulation+of+intracellular+circadian+rhythms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Redundant function of REV-ERBalpha and beta and non-essential role for Bmal1 cycling in transcriptional regulation of intracellular circadian rhythms.</a> PLoS Genetics. 4, e1000023(2008).</li>
<li>Maywood, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+core+circadian+feedback+loop+in+suprachiasmatic+nucleus+of+mCry1-luc+transgenic+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Analysis of core circadian feedback loop in suprachiasmatic nucleus of mCry1-luc transgenic reporter mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110, 9547-9552 (2013).</li>
<li>Ukai-Tadenuma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delay+in+feedback+repression+by+cryptochrome+1+is+required+for+circadian+clock+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Delay in feedback repression by cryptochrome 1 is required for circadian clock function.</a> Cell. 144, 268-281 (2011).</li>
<li>McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+titering+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Journal of Visualized Experiments. 57, e3348(2011).</li>
<li>Yamaguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+genetically+deficient+in+vasopressin+V1a+and+V1b+receptors+are+resistant+to+jet+lag%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mice genetically deficient in vasopressin V1a and V1b receptors are resistant to jet lag.</a> Science. 342, 85-90 (2013).</li>
<li>Nagano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+abrupt+shift+in+the+day%2Fnight+cycle+causes+desynchrony+in+the+mammalian+circadian+center%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">An abrupt shift in the day/night cycle causes desynchrony in the mammalian circadian center.</a> Journal of Neuroscience. 23, 6141-6151 (2003).</li>
<li>Golombek, D. A., Rosenstein, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+of+Circadian+Entrainment%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Physiology of Circadian Entrainment.</a> Physiological Reviews. 90, 1063-1102 (2010).</li>
<li>Mei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+recording+of+circadian+rhythms+in+brains+of+freely+moving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo recording of circadian rhythms in brains of freely moving mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, 4276-4281 (2018).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen conflicten van belang om te vermelden.

In tegenstelling tot ex vivo methoden, zoals segment cultuur4,5, RT-PCR16en in situ hybridisatie17, die vereisen dat de dieren worden gedood, de in vivo methode opnemen kunt onderzoekers bestuderen circadiane genexpressie in een levend dier. Als zodanig is deze technologie biedt de mogelijkheid om te evalueren van het effect van verschillende fysieke verstoringen (b.v., slaaptekor...

Bij zoogdieren regelt de suprachiasmatic kern (SCN) van het hele lichaam circadiane ritme te coördineren van iemands reactie op exogene veranderingen in het milieu (bijvoorbeeld, licht, temperatuur, stress, etc.)1. De componenten van de klok van de kern bestaat uit Per1-3, Cry1-2, kloken Bmal1, en een centrale rol bij het reguleren van de circadiane klok van elke cel. Elke cel in de SCN bevat de transcriptionele activator, klok/BMAL1, die als een heterodimer fungeert voor het opwekken van de expressie van PER en huilen. De PER / CRY complex dan remt de functie van klok/BMAL1 om te vormen van een transcriptie-vertaling feedback lus waarmee ongeveer 24 h naar complete2,3.
Eerdere studies over de SCN hebben voornamelijk werkzaam voor de ex vivo SCN segment cultuur methode4,5,6 en, terwijl deze aanpak waardevolle informatie heeft verstrekt, zijn beperkingen ons vermogen om te hebben geremd het verkrijgen van gegevens betreffende de invloed van andere kernen van de hersenen op de SCN, evenals het effect van exogene stimuli (zoalslicht) op cellen die woonachtig zijn in deze belangrijke regio. In 2001 was Hitoshi Okamura de groep de eerste die de Bioluminescentie systeem in vivo monitor circadiane klok genexpressie gebruiken in de SCN in muizen7vrij te verplaatsen. Ken-ichi Honma de groep heeft doorgebracht de afgelopen jaren verdere ontwikkeling van de Bioluminescentie in vivo opname-systeem in de SCN8,9,10. Samen, hebben deze studies voorzien van onderzoekers de mogelijkheid om te controleren van de circadiane klok in constante duisternis of na een lichte puls. Echter omdat bioluminescentie ook dim te voorzien in continue monitoring tijdens de licht/donker cyclus, in combinatie met het feit dat licht het overheersende signaal nodig zijn voor de SCN-gemedieerde meevoeren van circadiane klokken11 is, is er toenemende vraag naar de ontwikkeling van experimentele methoden die overwinnen van de beperkingen die zijn gekoppeld aan bioluminescentie opname. Het huidige verslag beschrijft een fluorescentie-gebaseerd systeem dat werd gebouwd om te controleren van de circadiane klok van de SCN in vivo in vrij bewegende muizen. Deze easy-to-use methode toelaat continue monitoring tijdens de licht/donker cyclus en zorgt voor de lange termijn waarneming van de transcriptie van de circadiane klok genen in de SCN in real-time en hoge temporele resolutie.

<table><tbody><tr><td>KOD Plus Neo</td><td>TOYOBO</td><td>KOD-401</td><td>Reagens</td></tr><tr><td>pVENUS-N1</td><td>addgene</td><td>#61854</td><td>Plasmid</td></tr><tr><td>pcDNA3.3_d2eGFP</td><td>addgene</td><td>#26821</td><td>Plasmid</td></tr><tr><td>pAAV-EF1a-double floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE-HGHpA</td><td>addgene</td><td>#20297</td><td>Plasmid</td></tr><tr><td>MluI</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD0564</td><td>Reagens</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD0274</td><td>Reagens</td></tr><tr><td>Gibson Assembly Mix</td><td>NEB</td><td>E2611s</td><td>Reagens</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>12566014</td><td>Reagens</td></tr><tr><td>Spuitfilter</td><td>EMD Millipore</td><td>SLHV033RS</td><td>0.45&nbsp;&micro;m&nbsp;</td></tr><tr><td>HiTrap heparin kolommen</td><td>gelifesciences</td><td>17-0406-01</td><td>1 mL&nbsp;</td></tr><tr><td>Amicon ultra-4 centrifugale filter</td><td>EMD Millipore</td><td>&nbsp;UFC810024</td><td>100.000 MWCO</td></tr><tr><td>Benzonase nuclease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1014</td><td>Reagens</td></tr><tr><td>Natriumdeoxycholaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5670</td><td>Maak voor elke batch een verse oplossing</td></tr><tr><td>muis stereotaxische apparaat</td><td>B&amp;E TEKSYSTEMS LTD</td><td>#SR-5M/6M</td><td>Apparatuur</td></tr><tr><td>pentobarbital</td><td>SigmaAldrich</td><td>#1507002</td><td>Reagens</td></tr><tr><td>muis stereotaxische apparaat</td><td>B&amp;E TEKSYSTEMS LTD</td><td>#SR-5M/6M</td><td>Apparatuur</td></tr><tr><td>Waterstofperoxide oplossing</td><td>SigmaAldrich</td><td>#216763</td><td>Reagens</td></tr><tr><td>Optische glasvezel</td><td>Thorlabs</td><td>FT200EMT</td><td>0.39 NA, &Oslash;200 &micro;m</td></tr><tr><td>microsyringe pomp</td><td>Nanoliter 2000 Injector, WPI</td><td></td><td>Apparatuur</td></tr><tr><td>keramische ferrule</td><td>Shanghai Fiblaser</td><td></td><td>230&thinsp;&mu;m I.D., 2.5 mm O.D.</td></tr><tr><td>Gene Observer</td><td>BiolinkOptics</td><td></td><td>Apparatuur</td></tr></tbody></table>

in vivo controle van de circadiane klok genexpressie in de muis suprachiasmatic kern met behulp van fluorescentie verslaggevers

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

Deze techniek combineert optische vezel gemedieerde fluorescentie opnamen met de nauwkeurige levering van recombinante adeno-associated virus gebaseerd gene verslaggevers. Dit nieuwe en makkelijk te gebruiken in vivo fluorescence bewakingssysteem is ontwikkeld om het opnemen van het transcriptionele ritme van het klok gen, Cry1, in de suprachiasmatic kern (SCN) van vrij bewegende muizen. Om dit te doen, is een Cry1 transcriptie fluorescentie verslaggever ontworpen en verpakt in Adeno-associated virus. Gezuiverde en geconcentreerde virus werd geïnjecteerd in de muis SCN gevolgd door het inbrengen van een optische vezel, die vervolgens werd vastgesteld op het oppervlak van de hersenen. De dieren waren keerde terug naar hun huis kooien en een 1-maand postoperatief herstel periode om voldoende verslaggever expressie. Fluorescentie werd vervolgens opgenomen in vrij verplaatsen van muizen via een in vivo monitoringsysteem dat werd gebouwd op onze instelling. Voor de in vivo opname-systeem, ging een 488 nm laser gepaard met een 1 × 4 beam-splitter die het licht in de vier uitgangen van de excitatie van de laser van gelijke macht verdeeld. Deze instelling ingeschakeld ons tegelijk opnemen van vier dieren. Elk van de signalen uitgezonden fluorescentie werd verzameld via een fotomultiplicator en een data-acquisitie kaart. In tegenstelling tot de vorige bioluminescentie in vivo circadiane klok opname techniek, deze fluorescentie in vivo opname-systeem mag de opname van de circadiane klok genexpressie tijdens de lichte cyclus.

Fluorescentie verslaggever ontwerp van Cry1 was Toon in figuur 1A. Met behulp van de aanpak hierboven, 500 nL van rAAV-P (Cry1) - intron336 - Venus-NLS-D2 met succes werd geïnjecteerd in de SCN van een volwassen muis en robuuste Venus expressie (figuur 1B, 1 C) tentoongesteld. Fluorescentie signalen opgenomen onder 12h / 12h licht/donker (LD) (DD) donker/donker (Figuur 2</st...

Deze nieuw ontwikkelde fluorescentie gebaseerde technologie kan op lange termijn van de transcriptie van de circadiane klok genen in de suprachiasmatic kern (SCN) vrij bewegen muizen in real time en met een hoge temporele resolutie.

In Vivo Controle van de circadiane klok genexpressie in de muis Suprachiasmatic kern met behulp van fluorescentie verslaggevers

This technique combines optical fiber mediated fluorescence recordings with the precise delivery of recombinant adeno-associated virus based gene ...

Deze methode biedt een manier om de expressie van circadiane klokgenen in real time te monitoren met hoge tijdsresolutie bij vrij bewegende muizen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het werkt in zowel licht-donker- als donker-donkercondities, wat van cruciaal belang is voor onderzoek naar circadiane klokken. Gebruik een glasvezelmes om een glasvezel van 17 millimeter lang te snijden.Zorg ervoor dat beide zijden van de glasvezel glad zijn. Plaats de glasvezel in de keramische ferrule en bevestig de glasvezel aan een keramische ferrule met methylethylketonperoxide. Zorg ervoor dat de oppervlakken van de glasvezel en de keramische ferrule vlak zijn.Reinig de glasvezel met een wattenstaafje gedrenkt in 75% ethanol. Houd het schoon totdat het klaar is voor inbrenging. Begin de injectieprocedure door eerst vijf microliter recombinant AAV in een microsyringe te laden.Nadat een volwassen muis is verdoofd volgens een institutioneel goedgekeurd protocol, controleer dan op voldoende verdovingsdiepte door het ontbreken van een teenprikreactie. Gebruik vervolgens een schaar om de vacht van de kop van de muis te verwijderen. Monteer vervolgens de kop van de muis in een stereota

in-vivo-monitoring-circadian-clock-gene-expression-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

De procedure van de voorbereiding plakjes met de volwassen muis hypothalamus suprachiasmatische nucleus (SCN), en een snelle manier om de cultuur van de SCN weefsel in organotypische cultuur staat, worden gerapporteerd. Verder is de meting van oscillerende klok gen-eiwitexpressie het gebruik van dynamische luciferase reporter-technologie beschreven.

Slice Voorbereiding, organotypische Tissue kweken en Luciferase Opname van Klok gen-activiteit in de suprachiasmatische kern

Circadiane klokken functioneren binnen de individuele cellen, dat wil zeggen, ze zijn cel-autonoom. We beschrijven werkwijzen voor het genereren van cel-autonome klok modellen niet-invasieve, luciferase-gebaseerde real-time bioluminescentie technologie. Reporter cellen handelbaar, functionele modelsystemen voor het bestuderen van circadiane biologie.

Monitoring Cell-autonome circadiane klok Rhythms of genexpressie met behulp van Luciferase Bioluminescentie Reporters

De circadiane klok regelt ongeveer een derde van de Arabidopsis transcriptoom, maar het percentage van genen die te gebruiken bij tijdwaarneming blijft onbekend. Hier visualiseren we een methode om circadiane fenotypes snel te beoordelen in welke mutant lijn van Arabidopsis met behulp van lichtgevende beeldvorming van een circadiaan reporter tijdelijk tot expressie gebracht in protoplasten.

Snelle analyse van het circadiaans fenotypes in Arabidopsis protoplasten getransfecteerd met een Lichtgevende klok Reporter

Hier beschrijven we instellingen om parallel de circadiane bioluminescentie en de secretoire activiteit van humane eilandcellen en primaire myotubes te monitoren. Hiervoor gebruikten we lentivirale genoverdracht van een luciferase kernklok reporter, gevolgd door in vitro synchronisatie en het verzamelen van uitstroommedium door continue celperfusie.

Parallel Meting van de circadiane klok genexpressie en hormoon in Human primaire celculturen

Een in vitro bioluminescentie test om te bepalen van cellulaire circadiane ritme in de borstklier epitheliale cellen wordt gepresenteerd. Deze methode maakt gebruik van zoogdiercellen verslaggever plasmiden gedestabiliseerd luciferase onder de controle van de periode 2 gen promotor uitdrukken. Het kan worden aangepast aan andere celtypes te evalueren orgel-specifieke effecten op de circadiane ritme.

In Vitro Bioluminescentie Assay te karakteriseren Circadian Rhythm in borstklier epitheliale cellen

Genetisch gecodeerde luciferase is een populaire niet-invasieve verslaggever van genexpressie. Gebruik van een geautomatiseerde longitudinale luciferase imaging gas - en temperatuur-geoptimaliseerde recorder (ALLIGATOR) staat longitudinale opname van bioluminescente cellen onder een brede waaier van voorwaarden stelt. Hier laten we zien hoe ALLIGATOR kan worden gebruikt in het kader van circadiane ritmen onderzoek.

Flexibele meting van bioluminescente verslaggevers met behulp van een geautomatiseerde longitudinale Luciferase Imaging Gas - en temperatuur-geoptimaliseerde Recorder (ALLIGATOR)

Het doel van dit protocol is om de ex vivo Drosophila larvale hersenen cultuur, geoptimaliseerd voor het controleren van de circadiane moleculaire ritmes met langdurige fluorescentie time-lapse beeldvorming. De toepassing van deze methode op farmacologische testen wordt ook besproken.

Eencellige resolutie fluorescentie leven beeldvorming van Drosophila circadiane klokken in larvale hersenen cultuur

Neurale stam/voorlopercellen vertonen verschillende expressie dynamiek van Inkeping signalering componenten die leiden tot verschillende uitkomsten van cellulaire gebeurtenissen. Een dergelijke dynamische uitdrukking kan worden onthuld door real-time monitoring, niet door statische analyse, met behulp van een zeer gevoelig bioluminescentie beeldvormings systeem dat visualisatie van snelle veranderingen in genexpressies mogelijk maakt.

Real-time bioluminescentie beeldvorming van Inkeping signalering dynamiek tijdens Murine neurogenese

Circadiane ritmes, die in de meeste organismen voorkomen, reguleren de tijdelijke organisatie van biologische processen. 3D-organoïden zijn onlangs naar voren gekomen als een fysiologisch relevant in vitromodel . Dit protocol beschrijft het gebruik van bioluminescente reporters om circadiane ritmes in organoïden te observeren, waardoor in vitro onderzoek naar circadiane ritmes in meercellige systemen mogelijk wordt.

Circadiane oscillaties monitoren met een bioluminescentiereporter in organoïden

Deze studie introduceert chemogenetische en op violet licht gebaseerde strategieën om betrouwbare circadiane fasenverschuiving overdag mogelijk te maken.

Het induceren van circadiane faseverschuivingen overdag met behulp van chemogenetische en spectrale benaderingen

Leer circadiane klokgenexpressie in de suprachiasmatische kern van muizen monitoren met fluorescentieverslaggevers. Deze methode werkt in licht-donker en donker-donker omstandigheden.

In Vivo Controle van de circadiane klok genexpressie in de muis Suprachiasmatic kern met behulp van fluorescentie verslaggevers

Meer video's verkennen