Generatie van gestandaardiseerde en reproduceerbaar reukkolf-type cerebrale Organoids van mens geïnduceerde pluripotente stamcellen

Het algemene doel van deze procedure is om hoogstandjes gestandaardiseerde en reproduceerbare voorhersen-type organoïden te genereren uit humane pluripotente stamcellen. Deze methode is een krachtig hulpmiddel voor het modelleren van mechanismen van nieuwe ontwikkeling NTZ's. In het bijzonder kan het helpen om sleutelvraagstukken te beantwoorden die verband houden met de vroege menselijke corticale genese.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de gestandaardiseerde en tijdefficiënte generatie van menselijk corticaal weefsel mogelijk maakt met weinig variaties tussen individuele organoïden en organoïde batches. Organoïdetechnologie kan inzicht bieden in de ontwikkeling, structuur en functie van de menselijke hersenen, vooral voor die aspecten die niet worden gevonden in hersenmodellen van lagere soorten. Om pluripotente stamcelaggregaten te genereren, wanneer de stamcelculturen 70 tot 90%confluency bereiken, voegt u 500 microliter celdissociatiereagens toe aan één put van de zeswelcultuurplaat om de cellen los te maken.

Geïnduceerde pluripotente stamcellen, die zijn aangepast aan monolaagcultuuromstandigheden, zijn een goed celtype om aggregaten te genereren, omdat ze minder vatbaar zijn voor stress-geïnduceerde celdood tijdens de dissociatie- en aggregatieprocedure. Na vijf tot tien minuten bij 37 graden Celsius tikt u zachtjes op de plaat en gebruikt u twee milliliter DMEM/F-12 om de cellen van de bodem van de put te wassen. Breng de resulterende celsuspensie over in een 15 milliliter conische buis en breng het volume van de celoplossing op 10 milliliter met meer DMEM/F-12-medium.

Na het tellen, brengt u 4,5 keer 10 tot de derde cellen per pluripotente stamcelaggregat in een nieuwe 15 milliliterbuis over en verzamel de cellen door centrifugatie. We suspenderen het pellet in het juiste volume pluripotente stamcelmedium, aangevuld met 50 micromolar rock-remmer om een concentratie van 4,5 keer 10 tot de derde cellen per 150 microliter medium te bereiken. Voeg vervolgens 150 microliter cellen toe aan individuele putten van een 96-puts lage aanhechting U-bodemplaat en plaats de plaat in een 37 graden Celsius en 5%koolstofdioxide-incubator.

Voor het bewaken van de inductie van de voorste neuro-ectoderm, gebruikt u een weefselkweekmicroscoop om de morfologische veranderingen van de pluripotente stamcelaggregaten elke dag onder lage vergroting nauwgezet waar te nemen. Op dag één moeten celaggregaten met duidelijke randen worden waargenomen. Op dag twee zuigen u voorzichtig ongeveer tweederde van het medium af, zonder de celaggregaten op de bodem van elke put te verstoren, en vervangt u het weggegooide medium met 100 microliter vers pluripotent stamcelmedium.

Tussen vier en zes dagen later, wanneer de celaggregaten 350 tot 450 micrometer in diameter bereiken en gladde randen vertonen, gebruikt u een gemodificeerde 100 microliter pipettepunt om maximaal 20 aggregaten over te brengen naar een enkele zes centimeter lage aanhechting kweekplaat die vijf milliliter corticaal inductiemedium bevat. Vervang het corticaal inductiemedium eenmaal per drie dagen met vers medium en bewaakt u de morfologie van de aggregaten dagelijks onder de 4X objectief. Na vier tot vijf dagen in het corticaal inductiemedium, moeten de randen van de celaggregaten aan het oppervlak beginnen op te helderen, wat neuro-ectodermdifferentiatie aangeeft en de radiale organisatie van een pseudostratificeerd epitheel zou moeten ontstaan.

Om de neuro-ectodermische aggregaten in een matrixscaffold in te bedden, ontdooit u basementmembraanextract gedurende twee tot drie uur op ijs. Terwijl het extract ontdooit, gebruikt u steriele scharen om plastic paraffinefilm in één vier bij vier centimeter vierkant per 16 organoïden te snijden en plaatst u elk stuk film over een lege 100 microliter micropipettipbak. Druk met een behandschoende vingertop op de paraffinefilm zodat er kleine kuiltjes verschijnen en reinig het film met 70%ethanol.

Na UV-bestraling in een gesloten, steriele bioveiligheidskast gedurende 30 minuten, gebruikt u een gemodificeerde 100 microliter pipettepunt met een opening van anderhalve tot twee millimeter om elk celaggregaat over te brengen naar een kuiltje in de film. Wanneer alle aggregaten zijn overgebracht, gebruikt u een ongesneden 100 microliter pipettepunt om voorzichtig het medium uit elk kuiltje te aspireren en voegt u 40 microliter onverdund basementmembraanextract toe aan elk celaggregaat. Wees voorzichtig om de organoïden niet te beschadigen door ruwe manipulatie of aspiratie in de pipettepunt, aangezien dit het zich ontwikkelende neuro-epitheel zou kunnen beschadigen.

Gebruik de pipettepunt om de aggregaten in het midden van elke druppel te positioneren en gebruik steriele pincetten om voorzichtig het plastic paraffinefilmblad in een 10 centimeter petrischaal te brengen. Plaats de schaal in de incubator gedurende 15 tot 20 minuten. Terwijl het extract aan het stollen is, voegt u vijf millimeter vers corticaal inductiemedium toe aan één zes centimeter lage aanhechting kweekschaal.

Aan het einde van de incubatie keert u het paraffinefilmblad om en gebruikt u steriele pincetten om voorzichtig maximaal 16 gepolymeriseerde druppels in elke zes centimeter schaal te persen. Breng vervolgens de aggregaten terug naar de celkweekincubator. De volgende dag brengt u de organoïdcultuurschalen over op een schuddende celkweekschuddelaar, gekanteld onder een hoek van vijf graden bij 14 rpm binnen een celkweekincubator, met dagelijkse lichtmicroscoopbewaking, totdat de aggregaten de gewenste differentiatiefase bereiken.

Op dag 20 gebruikt u een gemodificeerde één milliliter pipettepunt met een opening van drie tot drie en een halve milliliter om zes organoïden uit de aggregaatculturen te verzamelen. Plaats drie van de organoïden in één put van een 24-puts plaat bevattende 500 microliter PBS en gebruik een vijf milliliter pipettepunt om de organoïden twee keer te wassen met 500 microliter vers PBS per wasbeurt. Na de tweede wasbeurt fixeert u de organoïden in koude 4%paraformaldehyde gedurende 15 minuten, gevolgd door