Een eenvoudige en goedkope Assay voor het meten van Ambulation in muismodellen van spierdystrofie
29 december 2017
Dit protocol beschrijft een flexibele, voordelige systeem voor het meten van de muis ambulation in een open veld activiteit assay. We laten zien dat een bepaling van de 6 minuten durende ambulation op basis van dit systeem een afname van de vrijwillige beweging in mdx muizen detecteert en nauwkeurig verbetering in een spier-specifieke redding van deze dieren onderscheidt.
Het algemene doel van deze test is het meten van vrijwillige beweging bij muismodellen van spierdystrofie. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van spierdystrofie te beantwoorden over de progressie van spierzwakte in muismodellen van spierdystrofie, en de effectiviteit van mogelijke therapieën. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een niet-invasieve en reproduceerbare meting van dieractiviteit biedt die gemakkelijk kan worden aangepast aan vele verschillende onderzoekssituaties.
Plaats in een rustige, temperatuur gecontroleerde ruimte op een vast tijdstip van de dag een camera op een gaas boven de activiteitskamer om opname van de volledige arena mogelijk te maken en maak de kamer schoon met ontsmettingsmiddel. Laat de muis direct voorafgaand aan de activiteitsregistratie de poolbalk van een digitaal krachtmeter vastgrijpen en trek voorzichtig terug totdat de poolbalk loslaat. Registreer de piekspanning in Newtons voor elke proef.
Met een minuut rust tussen de proeven. Plaats de muis onmiddellijk na de grijfkrachttest in de kamer en start de video-opname, waardoor de muis vrij kan verkennen. Stop na zes minuten de opname en breng de muis terug naar zijn eigen kooi.
Voor het tracken van de analyse van de videogegevens, open eerst de opname in de juiste videobewerkingssoftware en stel de snelheid in op twee keer. Exporteer de verminderde video in mp4-bestandsformaat voor tracking-analyse en open de video in het juiste videoanalyseprogramma. Om de kalibratie voor de video-opname in te stellen, gebruikt u het lijngereedschap om een lijn langs één zijde van de kamer te trekken.
Klik met de rechtermuisknop op de lijn, selecteer kalibreer meten en voer de werkelijke grootte van de kamerzijde in centimeters in. Om het semi-geautomatiseerde volgen van de muispositie te starten, klikt u op de cursor bewegen. Begin bij het beginframe in de video en klik met de rechtermuisknop op het punt dat moet worden gevolgd.
Het volgpunt wordt gemarkeerd met een blauwe cirkel. Gebruik de rechterpijl op het toetsenbord om het frame te laten voortschrijden. Het volgpunt zou automatisch moeten bewegen op basis van de positie van de staartbasis.
Als de volgpositie niet is uitgelijnd met het interessepunt in een bepaald frame, lijnt u de blauwe cirkel handmatig uit op de volgpositie. Wanneer de volledige video is gevolgd, slaat u de video en de tracing-overlay op en selecteert u exporteren naar spreadsheet om de positionele gegevens van de tracing te exporteren. In overeenstemming met de resultaten gerapporteerd uit vergelijkbare tests, tonen dystrofine-null mdx muizen uitgedaagd met een oefeningprotocol onmiddellijk voorafgaand aan de test, significant minder vrijwillige beweging in een zes minuten durende open veldtest, dan wilde type-dieren.
Inderdaad, na de milde inspanning van een grijfkrachtuitdaging, bleven de mdx-muizen typisch stil gedurende de eerste paar minuten van het ambulatorische protocol, met een bescheiden toename in beweging van minuten vier tot vijf. Bij vergelijking van wild type- en mdx-dieren zonder oefeningsuitdaging worden echter geen verschillen in de afgelegde afstand gedetecteerd. Mdx-muizen transgeen voor utrophine-expressie zijn onderscheidbaar van wild type-dieren met geen significante verschillen in de totale afgelegde afstand, of op elk van de cumulatieve tijdstippen die worden waargenomen.
Om het effect van het verminderen van de bemonsteringssnelheid te bepalen, werd de totale afgelegde afstand van een minuut van volledige frame-rate video gemeten en vergeleken met de afstandsmetingen afgeleid van down-sampled versies van de dataset. Het verlagen van de framesnelheid met de helft verlaagde de gemeten afstand met 5% van de oorspronkelijke berekende afstand. De nauwkeurigheid van de gemeten afstand daalt scherp na dit punt, hoewel zelfs hoog gedecimeerde datasets de pad van het dier nog steeds nauw benaderen, wat de belangrijkheid benadrukt van het overwegen van de framesnelheid en signaalverwerking bij het beoordelen van dieractiviteit, en aantoont dat hoge ruimtelijke resolutie kan worden behouden in down-sampled videogegevens.
Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u muizenambulatie in een open veld kunt opnemen en analyseren. Eenmaal onder de knie, kan deze analyse in 15 tot 30 minuten worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd. Deze goedkope en niet-invasieve test stelt onderzoekers in staat om motorische activiteit bij muismodellen van spierdystrofie te onderzoeken en kan dienen als een informatieve eerste stap voor verdere functionele metingen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een flexibel, kostenefficiënt systeem voor het meten van de voortbeweging van muizen in een open field activiteitstest. De methode biedt een niet-invasieve en reproduceerbare meting van de dierlijke activiteit, die kan worden aangepast aan diverse onderzoeksettings.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Onderzoek naar spierdystrofie
- Gedragsanalyse
Achtergrond
- De assay meet de vrijwillige voortbeweging in muismodellen voor spierdistrofie.
- Het beantwoordt kernvragen over de progressie van spierzwakte.
- De techniek is ontworpen om de effectiviteit van potentiële therapeutische middelen te evalueren.
- De registratie vindt plaats in een gecontroleerde omgeving om consistentie te waarborgen.
Doel van de studie
- Om vrijwillige beweging bij mdx-muizen te meten.
- Om de impact van spierspecifieke interventies te beoordelen.
- Om inzicht te verschaffen in de progressie van spierdystrofie.
Gebruikte methoden
- Gebruik van een camera boven de activiteitskamer voor registratie.
- Het reinigen van de kamer met desinfectiemiddel voor de proeven.
- Het toestaan dat de muis zich aan een staaf vastklampte om de piekspanning te meten.
- Het registreren van de activiteit tijdens een ambulatie-assay van 6 minuten.
Belangrijkste resultaten
- Het systeem detecteert afnames in de vrijwillige beweging bij mdx-muizen.
- Het maakt nauwkeurig onderscheid tussen verbeteringen als gevolg van spierspecifieke redding.
- De resultaten zijn reproduceerbaar over verschillende proeven heen.
- De methode is aanpasbaar aan diverse onderzoekssituaties.
Conclusies
- Deze assay is effectief voor het bestuderen van spierdystrofie bij muizen.
- Het biedt waardevolle gegevens over de effectiviteit van potentiële behandelingen.
- De aanpak is flexibel en kan in diverse onderzoeksomgevingen worden toegepast.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Het meten van vrijwillige ambulatie in muismodellen biedt een translationele uitkomstmaat voor de motorische functie bij spierdystrofie, wat direct analoog is aan klinische eindpunten zoals de 6-minutenwandeltest. Deze kostenefficiënte, videogebaseerde assay maakt een reproduceerbare, niet-invasieve beoordeling van de ziekteprogressie en therapeutische respons in preklinische studies mogelijk. Door activiteitsdeficiënties in dystrophine-deficiënte mdx-muizen en herstel via utrophine-expressie te detecteren, ondersteunt deze methode doelwitvalidatie en mechanistische risicoreductie bij de ontdekking van neuromusculaire geneesmiddelen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door vrijwillige ambulatie te kwantificeren als een functionele readout van spierkracht in dystrofische modellen.
- Operationele waarde: Maakt biologische risicoreductie mogelijk door middel van reproduceerbare genotype-fenotypecorrelatie in mdx-muizen versus wild-type en gerescued cohorten.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door effectieve interventies te onderscheiden (bijv. utrofine-transgeen) die activiteitsniveaus normaliseren tot wild-type.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream compound-screening met behulp van gestandaardiseerde open-field ambulatiemetrieken.
- Reproduceerbaarheid: Levert kwantitatieve resultaten op basis van afstand en tijd die zich lenen voor assay-standaardisatie tussen laboratoria.
- Schaalbaarheid: Maakt gebruik van gratis open-source software en toegankelijke hardware om hergebruik van het platform in diverse onderzoeksomgevingen mogelijk te maken zonder gespecialiseerde apparatuur.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ziekterelatie: Modelleert patiëntrelevante loopdeficiënties, waardoor translationele continuïteit wordt geboden van ontdekking tot preklinische validatie.
- Mechanische risicoreductie: Verduidelijkt of waargenomen effecten voortkomen uit spierspecifiek herstel versus aspecifieke veranderingen in de activiteit.
- Risico-gecorrigeerde beslissingen: Informeert go/no-go-criteria door het herstel van het loopvermogen te correleren met target-engagement en pathway-modulatie.
Integratie van Pipeline & Workflow
De assay past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot lead-identificatie en biedt een functionele brug tussen moleculaire mechanismen en fenotypische uitkomsten in modellen voor spierdystrofie.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door genetische of farmacologische interventies te koppelen aan meetbare veranderingen in vrijwillige beweging.
- Screening: Maakt assay-gereedheid mogelijk via reproduceerbare, videogebaseerde tracking die kwantificeerbare loop-eindpunten genereert voor de evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Genereert positionele en temporele datastromen waarmee teams de locomotorische activiteit kunnen vergelijken tussen genotypen, behandelingen en tijdspunten.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan bij preklinische continuïteit door klinische beoordelingen van de loopfunctie te spiegelen, wat de afstemming van biomarkers en voorspellende modellering faciliteert.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbare, kosteneffectieve capaciteit voor looptesten die de afhankelijkheid van gespecialiseerde kernfaciliteiten vermindert.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit in assays voor motorische functies te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en reproduceerbaarheid via open-source tracking en gecontroleerde omgevingscondities.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door de behoefte aan dure motion-tracking systemen te elimineren, terwijl de datakwaliteit behouden blijft.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling mogelijk op basis van functioneel herstel van ambulatie-fenotypes in preklinische modellen.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist basisexpertise in videopresentatie en opensource trackingsoftware (bijv. handmatige uitlijning frame voor frame).
- Is afhankelijk van standaard beeldvormingsapparatuur en consistente omgevingscontroles (verlichting, temperatuur, tijdstip van de dag).
- Vereist strikte naleving van het protocol door alle teams om reproduceerbaarheid tussen locaties en operators te waarborgen.
- Omvat overwegingen voor aanpassingen aan verschillende kamergroottes, muizenstammen en activiteitsniveaus.
- Houdt rekening met compromissen tussen framerate en meetnauwkeurigheid, aangezien downsampling de precisie van de afstandsberekening vermindert.
