Name: Optimale voorbereiding van formaline vaste monsters voor Peptide Matrix gebaseerde bijgestaan Laser desorptie/ionisatie massaspectrometrie Imaging Workflows (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Leer een reproduceerbare methode voor de voorbereiding van formaline vaste weefselmonsters voor peptide massaspectrometrie imaging. Deze techniek helpt beginnende onderzoekers om betrouwbare workflows te ontwikkelen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs wil erkennen de Sydney Medical School Foundation en de Blues en de Stichting voor financiering deel van dit werk door middel van hun PhD scholarship programma voor onderzoek van de ziekte van Alzheimer en een ARC Discovery subsidie (DP160102063) tot PKW.

Let op: Alle toepasselijke veiligheidsmaatregelen moeten worden gevolgd bij het uitvoeren van deze procedure, met inbegrip van het gebruik van passende persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) (bijvoorbeeld Labjassen, nitril handschoenen, veiligheidsbril, enz.)
1. bereiding van reagentia en apparatuur
<ol><li>
Bereiding van de oplossingen
	<ol>
<li>Ter voorbereiding Carnoy van fluid 500 mL, meng 100% ethanol (EtOH), chloroform en ijsazijn in een 6:3:1 v/v/v-verhouding in een schone fles Schott.</li>
		<li>Los te maken van vloeibare nitrocellulose (NC), NC membraan (gewoonlijk gebruikt in het westelijke bevlekken) in nette aceton, door zachte agitatie, om een eindconcentratie van 40 mg/mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Voorbereiding van NC bedekt dia 's
	<ol>
<li>Gebruik een soortgelijk aan die wordt gebruikt voor de bereiding van bloed techniek uitstrijkjes voor histopathologisch onderzoek20 te bereiden NC bedekt dia's.</li>
		<li>Pipetteer 40 µL van vloeibare NC op een van de randen van een geleidende indium tin oxide (ITO) microscoopglaasje. Met behulp van een regelmatige glasplaatje Microscoop, Sleep de NC onder oppervlaktespanning over de dia maken een gelijkmatige, dunne film-coating.</li>
		<li>Laat de NC te drogen bij kamertemperatuur voor 20 s en vervolgens winkel totdat het nodig is bij kamertemperatuur. Opslag van de monsters onder deze omstandigheden kan onbeperkt zijn, mits de weefsels worden onderhouden en vrij van stof. Opmerking: Deze methode van voorbereiding is beter bekend als "thin film" en een uniforme coating die is afhankelijk van de viscositeit van de NC, evenals haar gebrek aan oppervlaktespanning tot zelf niveau op de dia zal produceren. De enige zorg die moet worden gehouden bij het voorbereiden van de dia's is niet bewegen te snel, die tot strepen van NC in plaats van een volledige dekking leiden zal. Let op: Zoals vloeibare NC zeer snel droogt, is het essentieel om te snel te werken om te voorkomen dat de oplossing drogen voordat het goed verspreid. Bij behandeling van NC in zijn vloeibare toestand, als het is een zeer energieke verbinding en moet geen contact op met een bron van ontsteking om te voorkomen dat brandbommen explosie moet ook zorg worden gehouden. NC ondergaat ook endotherme overgangen wanneer drogen en koude brandwonden veroorzaken kan als toegestaan om in langdurig contact met de huid of gehandschoende handen te komen. Te minimaliseren alle bijbehorende risico's, alleen kleine hoeveelheden moeten worden voorbereid op elk tijdstip (< 1 mL wordt aanbevolen). Eenmaal droog is het stabiel bij kamertemperatuur. NC kan blijven echter Ontploffingsgevaar bij in grote hoeveelheden aanwezig.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Creatie van aangepaste damp kamers
	<ol>
<li>Knip een stukje van dikke vloeipapier met een schaar groot genoeg voor de onderste helft van een standaard plastic petrischaal (94 mm in diameter en 3 mm dik).</li>
		<li>Snijdt u het papier, verlaten van een rechthoekig strip in het midden, dezelfde grootte als een microscoopglaasje, genoeg overtollige verlaten zodat het papier haar positie in de petrischaal (aanvullende figuur 1 blijft).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. voorbereiding van weefselsecties
<ol><li>
FFPE weefsel21.
	<ol>
<li>Selecteer de gewenste weefsel blok en de sectie op 12 µm-dikte in een standaard Bank gemonteerde microtoom en float mount op de NC vooraf gecoat ITO dia's.</li>
		<li>Onderdompelen van de dia's in verse xyleen te verwijderen van de resterende paraffine gedurende 2 minuten, en herhaal de handeling een tweede keer. Opmerking: Als het blok van paraffine vooral alomtegenwoordig is of het weefsel relatief klein vergeleken met het blok van paraffine is, de monsters kunnen worden verwarmd bij 60 ° C te smelten weg de meerderheid vóór wassen in xyleen.</li>
		<li>Wassen van de deparaffinized monsters door dompelen de dia's in een gesorteerde reeks van oplosmiddel: 70% v/v EtOH/water, 100% EtOH, Carnoy van vloeistof, 100% EtOH, ultra pure water en 100% EtOH. De duur van elke onderdompeling moet 30 s, met uitzondering van Carnoy van vloeistof, die 2 min duren moet. Let op: Carnoy van vloeistof en xyleen moeten worden opgeslagen en gebruikt in een zuurkast, zoals ze zeer giftig zijn inademing.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Formaline-vaste bevroren (FFF) weefsel Opmerking: Monsters moeten reeds worden bevroren, op de juiste wijze afhankelijk van het type van de steekproef.<ol>
<li>Het blok van de weefsel op de bedrijfstemperatuur van de microtoom voor 20 min22equilibreer. Opmerking: Evenwichtsinstelling temperatuur is afhankelijk van het soort weefsel.</li>
		<li>Sectie het weefsel gebruikend microtome op 12 µm en dooi mount de secties op een vooraf bereid NC gecoat ITO schuif.</li>
		<li>De dia's opslaan in een vacuüm exsiccator op de Bank in het donker. Opmerking: Monsters kunnen worden opgeslagen voor enkele weken onder deze omstandigheden.</li>
		<li>Wassen van de monsters in een gesorteerde reeks van oplosmiddelen zoals voor FFPE weefsel (2.1.3). Opmerking: Er is geen behoefte een xyleen deparaffinisation stap als het monster is niet ingesloten.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. methyleen dwarslijn hydrolyse
<ol><li>Laad de voorbeelddia's (FFF of FFPE) in een plastic dia doos die naar de top is gevuld met 20 mmol tris-HCl (pH 8,8). Verzegel de doos en plaats deze in een waterbad, met 500 mL water, waardoor het vak aan de onderkant raken. Verwarm het vervolgens gedurende 15 minuten op 120 ° C in een snelkookpan die een bedrijfsdruk van 70 kPa bereiken kan.</li>
	<li>De dia's te verwijderen, laten afkoelen en laat ze drogen bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.</li>
</ol>4. de weefsels spijsvertering
<ol><li>Zodra gehydrolyseerd, jas van de monsters met 10 µL van trypsine oplossing (1 mg/mL) in ultra pure water, door pipetting 10 µL van de oplossing op de rand van de weefselsectie, gebruik van de dezelfde Pipetteer tip, en sleep vervolgens de druppel over het hele oppervlak van het weefsel onder oppervlakte spanning. Opmerking: Vermijd krassen op het oppervlak van het weefsel met de pipet tip en over de verspreiding van het enzym buiten de grenzen van de randen van het weefsel.</li>
	<li>Toestaan dat de monsters te drogen bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Eenmaal droog, mount de monsters binnen de bovenkant van de eerder gebouwde damp kamer (weefsel naar beneden) met autoclaaf tape op een rand van de dia (aanvullende figuur 2).</li>
	<li>Pipetteer 600 µL van een oplossing met een mengeling van 1:1 v/v van 100% acetonitril en 50 mM Ammoniumbicarbonaat zorgvuldig op het vloeipapier vinger in het onderste gedeelte van de petrischaal totdat de vinger lijkt te zijn gelijkmatig natte.</li>
	<li>Plaats de bovenste helft van de zaal van de damp op de onderste helft, zorgen voor de papier-vinger en monster-dia perfect uitgelijnd, en verzegel de kamer rond de evenaar met paraffine film.</li>
	<li>Laat het monster 's nachts in een incubator 37 ° C om volledige spijsvertering.</li>
</ol>5. matrix Coating via sublimatie
<ol><li>Zodra de verteerde, wegen de voorbeelddia op een 5-cijferige microanalytical evenwicht.</li>
	<li>Monteren van de dia op de koeling vinger van de sublimatie apparatuur en veilig met koperen tape, op dezelfde manier als beschreven voor de damp kamer (aanvullende figuur 3). Opmerking: Om ervoor te zorgen dat de dia gelijkmatig is benaderd door de koeling vinger, een laag van koper tape is geplaatst op de bodem van de koeling vinger naar het niveau van het oppervlak. Dit zorgt ervoor dat de dia wordt gelijkmatig gekoeld die leidt tot zelfs afzetting van matrix.</li>
	<li>300 mg van α-cyano-4-hydroxycinnamic zuur (CHCA) matrix in een glazen petrischaaltje aan de onderkant van de kamer en verspreiding gelijkmatig voor een dunne laag van matrix kristallen plaatsen.</li>
	<li>Monteren van de sublimator en het veiligstellen van de twee helften met de hoefijzer klem. Opschorten van de geassembleerde unit 15-20 cm boven een zand bad, voorverwarmd op 220 ° C, door deze te plaatsen in een metalen ring verbonden met de stand van een retort.</li>
	<li>De zaal verbinden met de vacuüm bron, gaan het vacuüm, en laat ze stabiliseren tot ~ 25 mTorr voor 5 min.</li>
	<li>Pak de koeling vinger naar de top met ijs en voeg 50 mL water. Laat het apparaat te regelen voor een verdere 5 min voordat u verdergaat.</li>
	<li>Verlagen van de kamer op het oppervlak van het zand, ervoor te zorgen dat het zand volledig contact met de bodem van de kamer, en laat het gedurende 45 minuten te creëren een ideale coating voor 0,22 mg/cm2 Let op: Zorg moet worden gehouden wanneer de behandeling van glaswerk op hoog vacuüm, zoals schade aan het apparaat, terwijl geëvacueerd, in katastrofisch mislukking van de glazen kamer resulteren kan.</li>
	<li>Na 45 min, verwijder de zaal uit het zand bad door het verhogen van de metalen ring en luchten van de kamer. Opmerking: Zodra de zaal heeft zijn geventileerd, de dia moet worden verwijderd zeer snel als water in de lucht beginnen zal te condenseren op de bevriezing vinger en monster dia.</li>
	<li>Verwijderen van de dia en wegen ervoor te zorgen dat de gewenste coating is bereikt. Opmerking: Als onvoldoende coating is bereikt, gewoon herhalen de sublimatie proces voor de dia totdat de gewenste laagdikte is bereikt.</li>
</ol>6. herkristallisatie
<ol><li>Zodra gesublimeerd, mount de voorbeelddia binnen de bovenkant van de eerder gebouwde damp kamer, als beschreven eerdere (weefsel naar beneden).</li>
	<li>Pipetteer 600 µL van een oplossing met een mengeling van 1:1 (v/v) van 100% acetonitril en 0,1% v/v trifluorazijnzuur in water zorgvuldig op het vloeipapier in het onderste gedeelte van de petrischaal om een gelijke deklaag.</li>
	<li>Monteren van de zaal, ervoor te zorgen de papier tabblad en Microscoop dia perfect uitgelijnd, en laat in een incubator 37 ° C gedurende 1 uur. Let op: Niet het zegel van de kamer. Opmerking: Zodra recrystallized, de normaal gesproken gele tint van de matrix moet wijzigen in wit, kijken minder glanzend en zeer zelfs verschijnen. Dit geeft aan dat herkristallisatie correct is uitgevoerd.</li>
	<li>Het monster is nu klaar voor analyse.</li>
</ol>7. instrumentation
<ol><li>Scan de dia in een flatbed-scanner om te maken van een digitaal beeld.</li>
	<li>Het monster in de massaspectrometer laden en vervolgens analyseren met behulp van de juiste softwareplatform.</li>
	<li>Analyseer de monsters in de positieve ion reflectron modus met een massale aantal 750-3500 Da, met een plek resolutie die geldt voor het gewenste resultaat. In de meeste gevallen, 20-50 µm raster breedte is voldoende, maar zo weinig als 10 µm kunnen gebruikte15. Let op: MALDI UV lasers zijn een bron van ioniserende straling en niet direct moeten worden beschouwd. Zorg ervoor dat de laser uitmaakt instrument afscherming vóór bewerking.</li>
</ol>

<ol><li>Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+tissue+analysis+using+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+mass+spectrometry%3A+practical+aspects+of+sample+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: practical aspects of sample preparation.</a> J Mass Spectrom. 38 (7), 699-708 (2003).</li>
<li>Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Imaging+of+Biological+Samples%3A+Localization+of+Peptides+and+Proteins+Using+MALDI-TOF+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular Imaging of Biological Samples: Localization of Peptides and Proteins Using MALDI-TOF MS.</a> Anal Chem. 69 (23), 4751-4760 (1997).</li>
<li>Jackson, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI-Ion+Mobility+Mass+Spectrometry+of+Lipids+in+Negative+Ion+Mode%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+methods+%3A+advancing+methods+and+applications%22%5BJournal%5D)">MALDI-Ion Mobility Mass Spectrometry of Lipids in Negative Ion Mode.</a> Analytical methods : advancing methods and applications. 6 (14), 5001-5007 (2014).</li>
<li>O'Rourke, M. B., Djordjevic, S. P., Padula, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-instrument-based+method+for+the+analysis+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+human+spinal+cord+via+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionisation+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">A non-instrument-based method for the analysis of formalin-fixed paraffin-embedded human spinal cord via matrix-assisted laser desorption/ionisation imaging mass spectrometry.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (19), 1836-1840 (2015).</li>
<li>O'Rourke, M. B., Raymond, B. B. A., Djordjevic, S. P., Padula, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+cost-effective+method+for+the+analysis+of+fresh+frozen+tissue+sections+via+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionisation+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">A versatile cost-effective method for the analysis of fresh frozen tissue sections via matrix-assisted laser desorption/ionisation imaging mass spectrometry.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (7), 637-644 (2015).</li>
<li>Chughtai, K., Heeren, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+imaging+for+biomedical+tissue+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric imaging for biomedical tissue analysis.</a> Chem Rev. 110 (5), 3237-3277 (2010).</li>
<li>Ye, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI+mass+spectrometry-assisted+molecular+imaging+of+metabolites+during+nitrogen+fixation+in+the+Medicago+truncatula-Sinorhizobium+meliloti+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">MALDI mass spectrometry-assisted molecular imaging of metabolites during nitrogen fixation in the Medicago truncatula-Sinorhizobium meliloti symbiosis.</a> Plant J. 75 (1), 130-145 (2013).</li>
<li>Powers, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI+imaging+mass+spectrometry+profiling+of+N-glycans+in+formalin-fixed+paraffin+embedded+clinical+tissue+blocks+and+tissue+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">MALDI imaging mass spectrometry profiling of N-glycans in formalin-fixed paraffin embedded clinical tissue blocks and tissue microarrays.</a> PLoS One. 9 (9), 10655(2014).</li>
<li>Rompp, A., Spengler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging+with+high+resolution+in+mass+and+space%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging with high resolution in mass and space.</a> Histochem Cell Biol. 139 (6), 759-783 (2013).</li>
<li>Shariatgorji, M., Svenningsson, P., Andren, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging%2C+an+emerging+technology+in+neuropsychopharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging, an emerging technology in neuropsychopharmacology.</a> Neuropsychopharmacology. 39 (1), 34-49 (2014).</li>
<li>Alexandrov, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI+imaging+mass+spectrometry%3A+statistical+data+analysis+and+current+computational+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MALDI imaging mass spectrometry: statistical data analysis and current computational challenges.</a> BMC Bioinformatics. 13, Suppl 16 11(2012).</li>
<li>Weaver, E. M., Hummon, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+mass+spectrometry%3A+From+tissue+sections+to+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Imaging mass spectrometry: From tissue sections to cell cultures.</a> Adv Drug Deliv Rev. 65 (8), 1039-1055 (2013).</li>
<li>Watrous, J. D., Dorrestein, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+mass+spectrometry+in+microbiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Imaging mass spectrometry in microbiology.</a> Nat Rev Microbiol. 9 (9), 683-694 (2011).</li>
<li>O'Rourke, M., Padula, M. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/protocolexchange/protocols/5695">The Non-Instrument Based Preparation of Tissue Samples Destined for Imaging Mass Spectrometry (IMS) Analysis.</a> Protocol Exchange. , (2017).</li>
<li>O'Rourke, M. B., Padula, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+standard+of+visual+data+representation+for+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin+Appl%22%5BJournal%5D)">A new standard of visual data representation for imaging mass spectrometry.</a> Proteomics Clin Appl. 11 (3-4), (2017).</li>
<li>O'Rourke, M. B., Padula, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+%28FFPE%29+tissue+via+proteomic+techniques+and+misconceptions+of+antigen+retrieval%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue via proteomic techniques and misconceptions of antigen retrieval.</a> Biotechniques. 60 (5), 229-238 (2016).</li>
<li>Casadonte, R., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+by+MALDI+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of formalin-fixed paraffin-embedded tissue by MALDI imaging mass spectrometry.</a> Nat. Protocols. 6 (11), 1695-1709 (2011).</li>
<li>Ong, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Spectrometry+Imaging+and+Identification+of+Peptides+Associated+with+Cephalic+Ganglia+Regeneration+in+Schmidtea+mediterranea%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass Spectrometry Imaging and Identification of Peptides Associated with Cephalic Ganglia Regeneration in Schmidtea mediterranea.</a> J Biol Chem. 291 (15), 8109-8120 (2016).</li>
<li>Seeley, E. H., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+of+proteins+in+tissues+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging of proteins in tissues by mass spectrometry.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18126-18131 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-smear+showing+Experimental+Infection+with+Herpetomonas%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+R+Soc+Med%22%5BJournal%5D)">Blood-smear showing Experimental Infection with Herpetomonas.</a> Proc R Soc Med. 18, Sect Trop Dis Parasitol 55(1925).</li>
<li>Gorrie, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+human+OEC-derived+cell+transplants+in+rodent+spinal+cord+contusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of human OEC-derived cell transplants in rodent spinal cord contusion injury.</a> Brain Res. 1337, 8-20 (2010).</li>
<li>Wu, Q., Comi, T. J., Li, B., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-Tissue+Derivatization+via+Electrospray+Deposition+for+Matrix-Assisted+Laser+Desorption%2FIonization+Mass+Spectrometry+Imaging+of+Endogenous+Fatty+Acids+in+Rat+Brain+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">On-Tissue Derivatization via Electrospray Deposition for Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging of Endogenous Fatty Acids in Rat Brain Tissues.</a> Anal Chem. 88 (11), 5988-5995 (2016).</li>
<li>Sturm, R. M., Greer, T., Chen, R., Hensen, B., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+NIMS+and+MALDI+platforms+for+neuropeptide+and+lipid+mass+spectrometric+imaging+in+C.+borealis+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of NIMS and MALDI platforms for neuropeptide and lipid mass spectrometric imaging in C. borealis brain tissue.</a> Anal Methods. 5 (6), 1623-1628 (2013).</li>
<li>Kompauer, M., Heiles, S., Spengler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atmospheric+pressure+MALDI+mass+spectrometry+imaging+of+tissues+and+cells+at+1.4-mum+lateral+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Atmospheric pressure MALDI mass spectrometry imaging of tissues and cells at 1.4-mum lateral resolution.</a> Nat Methods. 14 (1), 90-96 (2017).</li>
<li>Yang, J., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+sublimation%2Frecrystallization+for+imaging+proteins+by+mass+spectrometry+at+high+spatial+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Matrix sublimation/recrystallization for imaging proteins by mass spectrometry at high spatial resolution.</a> Anal Chem. 83 (14), 5728-5734 (2011).</li>
<li>Rohner, T. C., Staab, D., Stoeckli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI+mass+spectrometric+imaging+of+biological+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">MALDI mass spectrometric imaging of biological tissue sections.</a> Mech Ageing Dev. 126 (1), 177-185 (2005).</li>
<li>Li, B., Bhandari, D. R., Rompp, A., Spengler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+MALDI+mass+spectrometry+imaging+of+gallotannins+and+monoterpene+glucosides+in+the+root+of+Paeonia+lactiflora%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">High-resolution MALDI mass spectrometry imaging of gallotannins and monoterpene glucosides in the root of Paeonia lactiflora.</a> Sci Rep. 6, 36074(2016).</li>
<li>Spengler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging+of+biomolecular+information%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging of biomolecular information.</a> Anal Chem. 87 (1), 64-82 (2015).</li>
<li>Widlak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+molecular+signatures+of+oral+squamous+cell+carcinoma+and+normal+epithelium+-+application+of+a+novel+methodology+for+unsupervised+segmentation+of+imaging+mass+spectrometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Detection of molecular signatures of oral squamous cell carcinoma and normal epithelium - application of a novel methodology for unsupervised segmentation of imaging mass spectrometry data.</a> Proteomics. 16 (11-12), 1613-1621 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflict of commercieel belang vrij te geven

Dit protocol werd ontworpen om te maximaliseren van de generatie van ioniseerbare moleculaire soorten terwijl het elimineren van de verplaatsing van de analyten. De belangrijkste factoren betrekken met behulp van hetzelfde overkoepelende principe bij de toepassing van de matrix, het verteren van het monster, of recrystallizing na sublimatie24; namelijk, dat een zelfs afzetting van damp, matrix of anders moet worden gemaakt en onderhouden. Pipetteren oplosmiddel wast voor herkristallisatie en spijs...

Laser matrix-bijgewoonde desorptie/ionisatie massaspectrometrie imaging (MALDI MSI) heeft gewerkt als een beeld gebaseerde techniek voor twee decennia1,2, analyseren van een aantal biomoleculen inclusief: lipiden3, peptiden2 ,4, eiwitten2,5, metabolieten6,7, N-glycanen8en synthetische moleculen zoals therapeutische drugs9,10. Het aantal publicaties aan te tonen het nut van deze techniek zijn de afgelopen tien jaar6,11,12,13aanzienlijk toegenomen. Bepaalde moleculen, zoals lipiden, zijn relatief eenvoudig te analyseren via MALDI MSI, zoals zij gemakkelijk te als gevolg van de chemische aard ioniseren en dus weinig voorafgaande voorbereiding3 vereisen. Voor moeilijker doelen zoals peptiden zijn de stappen die nodig zijn om effectief deze moleculen ioniseren echter uitgebreid en over het algemeen ingewikkeld14. Momenteel zijn er weinig publicaties die gericht zijn op adres of aantonen van reproduceerbaarheid in de methodologieën die werkzaam zijn voor te bereiden op weefsel deze unieke visuele techniek15. Om deze reden hebben we samengesteld van opmerkingen en geïmplementeerd optimalisaties in één eenvoudig te implementeren, methodologie die weinig tot geen wijziging, voor de analyse van peptides van een formaldehyde moet kruiselings gekoppelde weefsel bron14.
In dit manuscript, hebben we een gevalideerde, low-cost reproduceerbare methodologie voor de detectie en ruimtelijke toewijzing van peptides, gegenereerd op basis van formaline-vaste bevroren (FFF) en formaline-vaste paraffine-ingebedde (FFPE) weefselsecties beschreven. Deze methodologie niet vereisen of vertrouwen op een gespecialiseerde instrumentatie-3. Specifiek, ingaan we op de vele aspecten van gespecialiseerde monstervoorbereiding noodzakelijk om te analyseren van peptiden; stappen zoals antigeen ophalen16 en matrix coating. Ons protocol maakt ook gebruik van goedkope apparatuur en reagentia, waardoor deze methode toegankelijk te maken voor een bredere gemeenschap die anders zouden kunnen veroorloven de alternatieve robotic apparaat17.
De redenering achter de ontwikkeling van een handmatige monster voorbereiding methode was tweeledig: ten eerste, het gebruik van een sublimator maakt een coherente en homogene deklaag van kristallen van de matrix die ~ 1 µm in lengte18, iets niet haalbaar met de gemeenschappelijkere spuiten technieken. Ten tweede, de relatief kleine set-up kosten: de totale kosten van de aangepaste apparatuur was <$ 1500 AUD. Wij stellen vast, in termen van kosteneffectiviteit, dat de prijs per monster is veel goedkoper als er geen robotachtige machines betrokken. Het gebruik van sublimatie is gemeld eerder, echter tot de beste van onze kennis, stapsgewijze methodologieën die dit proces beschrijven en proef de voorbereiding hebben niet gemeld noch in de literatuur beschreven.
Dit protocol is bedoeld om te helpen van onderzoekers die beschikken over een MALDI-massaspectrometer en wie zijn bedoeling op het genereren van ruimtelijke informatie met betrekking tot een bio-molecule van belang19. In wezen, is MALDI MSI een vorm van histologische screening die niet afhankelijk is van antilichamen of vlekken2.

<table><tbody><tr><td>Cryo Microtome</td><td>Leica</td><td>CM3050</td><td>Voor de voorbereiding en doorsnede van weefsel.</td></tr><tr><td>Indium Tin Oxide Microscope slides</td><td>Bruker</td><td>8237001</td><td>Voor de voorbereiding en doorsnede van weefsel.</td></tr><tr><td>Coplin Jars</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5516</td><td>Voor de voorbereiding en doorsnede van weefsel.</td></tr><tr><td>Pressure Cooker</td><td>Kambrook</td><td>KPR620BSS</td><td>Voor de voorbereiding en doorsnede van weefsel.</td></tr><tr><td>Sublimator</td><td>Chem Glass</td><td>NA</td><td>Voor sublimatieprocedure. Vergelijkbaar in ontwerp met de CG-3038, maar werd op maat gemaakt&nbsp;</td></tr><tr><td>Sand bath</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Voor sublimatieprocedure. Fijne rivierzand in gevouwen aluminiumfolie, afkomstig van buiten, niet van een specifiek bedrijf</td></tr><tr><td>Glass Petri Dish</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS70165100</td><td>Voor sublimatieprocedure.</td></tr><tr><td>Vacuum Pump</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Voor sublimatieprocedure. Aangeschaft als reserveonderdeel van een oude massaspectrometer&nbsp;</td></tr><tr><td>Cold trap</td><td>Chem Glass</td><td>CG-4510-02</td><td>Voor sublimatieprocedure.</td></tr><tr><td>Hot Plate</td><td>John Morris</td><td>EW-15956-32.&nbsp;</td><td>Voor sublimatieprocedure.</td></tr><tr><td>Plastic petri dish</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z717223</td><td>Voor sublimatieprocedure.</td></tr><tr><td>37 &deg;C incubator</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Voor sublimatieprocedure. Niet van toepassing, incubator is niet steriel en meer dan 30 jaar oud&nbsp;</td></tr><tr><td>Blotting paper</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7796</td><td>Voor sublimatieprocedure.</td></tr><tr><td>Nitrocellulose&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N8395</td><td>Voor het wassen van slides.</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>650501</td><td>Voor het wassen van slides.</td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>214736</td><td>Voor het wassen van slides.</td></tr><tr><td>100% EtOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1.02428</td><td>Voor het wassen van slides.</td></tr><tr><td>70% EtOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>NA</td><td>Voor het wassen van slides. Gemaakt in lab vanuit 95% stock ethanol&nbsp;</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2432</td><td>Voor het wassen van slides.</td></tr><tr><td>Glacial Acetic Acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>ARK2183</td><td>Voor het wassen van slides.</td></tr><tr><td>Tris HCL pH 8.8</td><td>Sigma Aldrich</td><td>TRIS-RO</td><td>Voor proteolytische splitsing. Poeder gemaakt tot 1M gevolgd door evenwichtstelling met 32% HCl tot PH 8.8</td></tr><tr><td>Milli Q Ultra-Pure Water</td><td>Sigma Aldrich</td><td>NA</td><td>Voor proteolytische splitsing. Zuivering uitgevoerd in huis door sartorious waterzuiveringssysteem</td></tr><tr><td>Ammonium Bircarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6141</td><td>Voor proteolytische splitsing.&nbsp;</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0303</td><td>Voor proteolytische splitsing.&nbsp;</td></tr><tr><td>CHCA Matrix</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2020</td><td>Voor rekristallisatie.</td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1.00029</td><td>Voor rekristallisatie.</td></tr><tr><td>Trifluoroacetic Acid (TFA)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>302031</td><td>Voor rekristallisatie.</td></tr></tbody></table>

optimale voorbereiding van formaline vaste monsters voor peptide matrix gebaseerde bijgestaan laser desorptie/ionisatie massaspectrometrie imaging workflows

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

Het gebruik van laser matrix-bijgewoonde desorptie/ionisatie, Spectrometrie van de massa (MALDI MSI) imaging is snel uitgebreid, aangezien deze techniek een schare van biomoleculen van drugs en lipiden aan N-glycanen analyseert. Hoewel verschillende monster voorbereiding technieken bestaan, blijft opsporen van peptiden van formaldehyde weefsels bewaard een van de moeilijkste uitdagingen voor dit soort massaspectrometrische analyse. Om deze reden hebben we gemaakt en geoptimaliseerd een robuuste methodologie, die de ruimtelijke gegevens die deel uitmaakt van het monster, terwijl het opwekken van het grootste aantal ioniseerbare peptiden behouden blijven. We hebben er ook op gericht om dit te bereiken in een voordelige en eenvoudige manier, zodat er geen potentiële bias of het preparaat fout, die zich voordoen kan wanneer met behulp van instrumentatie geautomatiseerde. Het eindresultaat is een reproduceerbare en goedkope protocol.

Als correct gevolgd, produceert dit protocol beelden die duidelijk de bruto morfologie van het weefsel zonder krassen of andere vervormingen (Figuur 1 vertegenwoordigen). De ideale validatie voor een correct uitgevoerde monstervoorbereiding, is de mogelijkheid om het onderscheid maken tussen verschillende fysieke structuren door het veranderen van het molecuul wordt bekeken (Figuur 2).
<p class="jove_content" fo:keep-together...

Dit protocol beschrijft een reproduceerbare en betrouwbare methode voor de sublimatie gebaseerde voorbereiding van formaline vaste weefsels die bestemd zijn voor imaging Spectrometrie van de massa.

Optimale voorbereiding van formaline vaste monsters voor Peptide Matrix gebaseerde bijgestaan Laser desorptie/ionisatie massaspectrometrie Imaging Workflows

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Het algemene doel van deze procedure is om op reproduceerbare wijze een weefselmonster voor peptide massaspectrometrie beeldvorming voor te bereiden. Deze methode stelt beginnende massaspectrometrie gebruikers in staat om hun eigen beeldvorming massaspectrometrie workflows te ontwikkelen zonder langdurige empirische bepalingen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze zeer reproduceerbaar, eenvoudig te implementeren is en kosteneffectieve methodologieën gebruikt.Om de met nitrocellulose gecoate slides voor te bereiden, pipet 40 microliter vloeibare nitrocellulose op een rand van de geleidende indium tin oxide microscoopslide. Gebruik een gewone glazen microscoopslide om de nitrocellulose onder oppervlaktespanning over de slide te trekken om een gelijkmatige dunne laag coating te creëren. Laat de nitrocellulose 20 seconden drogen bij kamertemperatuur en bewaar vervolgens bij kamertemperatuur totdat ze nodig zijn.Maak vervolgens aangepaste dampkamers door een stuk dik blotting papier te snijden dat groot genoeg is om in de onderste helft van een standaard plastic petrischaal te passen. Snijd het papier om een rechthoekige strook in het midden over te laten die even gr

optimal-preparation-formalin-fixed-samples-for-peptide-based-matrix

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Archiefbeelden formaline gefixeerde en in paraffine ingebedde (FFPE) klinische monsters zijn waardevol materiaal voor onderzoek naar ziekten. Hier laten we zien een monstervoorbereiding workflow waardoor diepgaande proteomics analyse van gemicrodissecteerde FFPE weefsel.

Proteomics Monstervoorbereiding van formaline gefixeerde en in paraffine ingebed weefsel

Dithranol (DT, 1,8-dihydroxy-9 ,10-dihydroanthracen-9-on) is eerder gerapporteerd als een MALDI matrix voor weefsel beeldvorming van kleine moleculen, protocollen voor het gebruik van DT voor de MALDI beeldvorming van endogene lipiden op de oppervlak van het weefsel secties door positieve-ion MALDI-MS op een ultrahoge resolutie quadrupool-FTICR instrument worden hier gegeven.

Dithranol als een matrix voor Matrix Assisted Laser desorptie / ionisatie Imaging op een Fourier transform ion cyclotron resonantie spectrometrie

Onsterfelijk kankercellijnen kunnen worden gekweekt als 3D celculturen, een waardevol model voor biologisch onderzoek. Dit protocol beschrijft massaspectrometrie beeldvorming van de 3D celculturen, waaronder verbeteringen in de monstervoorbereiding platform. Het doel van dit protocol is om gebruikers te instrueren om 3D celculturen voor te bereiden op massaspectrometrie imaging-analyse.

Monstervoorbereiding Strategieën voor massaspectrometrie Imaging van 3D celkweekmodellen

Gecombineerd voorloper isotopische labeling en isobare tagging (cPILOT) is een kwantitatieve proteomics strategie die steekproef multiplexing mogelijkheden van isobarisch labels verbetert. Dit protocol beschrijft de toepassing van cPILOT op weefsels van de ziekte van Alzheimer muismodel en wildtype controles.

Verbeterde Sample Multiplexing Weefsels gebruik van Gecombineerd Precursor isotopische labeling en Isobaric Tagging (cPILOT)

Een protocol voor het verbeteren van koolhydraten ion signalen in de Spectrometrie van de massa van de MALDI door hervorming kristallijnen structuren tijdens preparatietechnieken voor monster wordt aangetoond.

Een efficiënte Sample voorbereiding methode om koolhydraten Ion signalen in Laser Matrix-bijgewoonde desorptie/ionisatie massaspectrometrie

Proteoom karakterisering van oogbeschadigingen en/of microvasculaire bedden is cruciaal voor diepgaand inzicht in de vele oogbeschadigingen en/of pathologieën bij de mens. Deze studie toont aan dat een doeltreffende, snelle en robuuste methode voor eiwit extractie en bereiding van de monsters van kleine bloedvaten met de varkens korte posterieure Ciliaire slagaders als model vaartuigen voor proteomics massa spectrometrie-gebaseerde analyses.

Bereiding van de monsters voor Proteomics-analyse op basis van massa-spectrometrie van oogbeschadigingen en/of Microvessels

Het beschreven protocol biedt een geoptimaliseerde kwantitatieve proteomics-analyse van weefselmonsters met behulp van twee benaderingen: labelgebaseerde en labelvrije kwantificering. Labelgebaseerde benaderingen hebben het voordeel van een nauwkeurigere kwantificering van eiwitten, terwijl een labelvrije aanpak kosteneffectiever is en wordt gebruikt om honderden monsters van een cohort te analyseren.

Uitgebreide workflow van op massaspectrometrie gebaseerde Shotgun Proteomics van weefselmonsters

Het doel van dit protocol is om gedetailleerde richtlijnen te geven over de monstervoorbereiding bij het plannen van experimenten met MALDI MSI om metabole en moleculaire detectie in biologische monsters te maximaliseren.

Monstervoorbereiding voor metabole profilering met behulp van MALDI massaspectrometrie beeldvorming

Dit artikel beschrijft een monstervoorbereidingsmethode op basis van warmte-inactivatie om endogene peptiden te behouden die post-mortem degradatie voorkomen, gevolgd door relatieve kwantificering met behulp van isotopische etikettering plus LC-MS.

Monstervoorbereiding en relatieve kwantificering met behulp van reductieve methylering van amines voor peptidomics-studies

Dit protocol was bedoeld om gedetailleerde richtlijnen te beschrijven voor de voorbereiding van secties van harde zaadmonsters met een laag watergehalte voor MALDI-IMS-analyse, waarbij de oorspronkelijke verdeling en overvloed van analyten behouden blijft en signaal- en ruimtelijke resolutie van hoge kwaliteit wordt geboden.

Bereiding van harde palmzaden voor matrix-geassisteerde laserdesorptie/ionisatie-beeldvorming massaspectrometrie-analyse

Leer een reproduceerbare methode voor de voorbereiding van formaline vaste weefselmonsters voor peptide massaspectrometrie imaging. Deze techniek helpt beginnende onderzoekers om betrouwbare workflows te ontwikkelen.

Optimale voorbereiding van formaline vaste monsters voor Peptide Matrix gebaseerde bijgestaan Laser desorptie/ionisatie massaspectrometrie Imaging Workflows (Video) | JoVE Journal

Optimale voorbereiding van formaline vaste monsters voor Peptide Matrix gebaseerde bijgestaan Laser desorptie/ionisatie massaspectrometrie Imaging Workflows

Meer video's verkennen