Optimale voorbereiding van formaline vaste monsters voor Peptide Matrix gebaseerde bijgestaan Laser desorptie/ionisatie massaspectrometrie Imaging Workflows
January 16th, 2018
Dit protocol beschrijft een reproduceerbare en betrouwbare methode voor de sublimatie gebaseerde voorbereiding van formaline vaste weefsels die bestemd zijn voor imaging Spectrometrie van de massa.
Het algemene doel van deze procedure is om op reproduceerbare wijze een weefselmonster voor peptide massaspectrometrie beeldvorming voor te bereiden. Deze methode stelt beginnende massaspectrometrie gebruikers in staat om hun eigen beeldvorming massaspectrometrie workflows te ontwikkelen zonder langdurige empirische bepalingen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze zeer reproduceerbaar, eenvoudig te implementeren is en kosteneffectieve methodologieën gebruikt.
Om de met nitrocellulose gecoate slides voor te bereiden, pipet 40 microliter vloeibare nitrocellulose op een rand van de geleidende indium tin oxide microscoopslide. Gebruik een gewone glazen microscoopslide om de nitrocellulose onder oppervlaktespanning over de slide te trekken om een gelijkmatige dunne laag coating te creëren. Laat de nitrocellulose 20 seconden drogen bij kamertemperatuur en bewaar vervolgens bij kamertemperatuur totdat ze nodig zijn.
Maak vervolgens aangepaste dampkamers door een stuk dik blotting papier te snijden dat groot genoeg is om in de onderste helft van een standaard plastic petrischaal te passen. Snijd het papier om een rechthoekige strook in het midden over te laten die even groot is als een microscoopslide. Laat voldoende overtollig papier over zodat het papier zijn positie in de petrischaal zal behouden.
Voor FFPE weefsel, monteer de secties drijvend op de met nitrocellulose voorgecoate ITO slides zoals beschreven in het tekstprotocol. Dompel de slides in vers xyleen om resterend paraffine gedurende twee minuten te verwijderen. Was de gedeparaffiniseerde monsters door de slides gedurende 30 seconden onder te dompelen in een gegradueerde oplosmiddelreeks bestaande uit een 70% volume voor volume ethanol water oplossing, gevolgd door 100% ethanol.
Dompel vervolgens de slides gedurende twee minuten in Carnoy's vloeistof. Dompel ten slotte de slides gedurende 30 seconden in een reeks 100% ethanol, ultrapuur water en opnieuw 100% ethanol. Laad de monsterslips in een plastic slides box die tot de bovenkant gevuld is met 20 millimolair tris HCO.
Versluit de box en plaats deze in een waterbad met 500 milliliter water, waarbij de box de bodem van het bad raakt. Verwarm vervolgens de box gedurende 15 minuten op 120 graden Celsius in een snelkookpan, die een werkdruk van 70 kilopascal kan bereiken. Verwijder de slides, laat ze afkoelen en laat ze 15 minuten drogen bij kamertemperatuur.
Na hydrolyse, bedek de monsters met 10 microliter trypsinoplossing in ultrapuur water door eerst 10 microliter van de oplossing op de rand van de weefselsectie te pipetten. Trek vervolgens met dezelfde pipettip de druppel over het hele oppervlak van het weefsel onder oppervlaktespanning. Laat de monsters drogen bij kamertemperatuur en monteer ze bovenaan de eerder geconstrueerde dampkamer met autoclaaf tape aan beide randen van de slide.
Pipet zorgvuldig 600 microliter van een oplossing die een een-op-een volume voor volume mix van 100% acetonitril en 50 millimolair ammoniumbicarbonaat bevat op de blotting papier vinger in het onderste deel van de petrischaal, totdat de vinger er gelijkmatig nat uitziet. Pipetten is van cruciaal belang omdat onjuist pipetten zal resulteren in de delocalisatie van uw matrix en oppervlakte analoïden die de ruimtelijke informatie in uw monster zullen vernietigen. Plaats de bovenste helft van de dampkamer op de onderste helft, zorg ervoor dat de papiervinger en monsterslip perfect uitlijnen, en verzegel de kamer rond de evenaar met paraffinefilm.
Laat het monster een nacht in een 37 graden Celsius incubator om volledige vertering toe te laten. Laat de monsterslip eenmaal verteerd op een vijf-cijferige microanalytische weegschaal liggen. Monteer de slide op de koelvinger van het sublimeerapparaat en bevestig deze met koperen tape op dezelfde manier als beschreven voor de dampkamer.
Hang het geassembleerde apparaat 15 tot 20 centimeter boven een zandbad, voorverwarmd tot 220 graden Celsius, door het in een metalen ring te plaatsen die verbonden is met een retortstatief. Verbind de kamer met de vacuümbron, schakel de vacuüm in en laat deze gedurende vijf minuten stabiliseren tot ongeveer 25 milliTorr. Vul de koelvinger tot de bovenkant met ijs en voeg 50 milliliter water toe.
Laat het apparaat nog vijf minuten rusten voordat u verder gaat. Laat de kamer op het oppervlak van het statief zakken, waarbij u ervoor zorgt dat het zand volledig contact maakt met de bodem van de kamer. Laat het 45 minuten staan om een ideale coating van 0,22 milligram per vierkante centimeter te creëren.
Na 45 minuten, verwijder de kamer uit het zandbad door de metalen ring omhoog te brengen en de kamer te ontluchten. Zodra gesublimeerd, monteer de monsterslip bovenaan de eerder geconstrueerde dampkamer, zoals eerder. Pipet zorgvuldig 600 microliter van een oplossing die een een-op-een volume voor volume mix van acetonitril en trifluorazijnzuur in water bevat op de blotting papier in het onderste deel van de petrischaal om een gelijkmatige coating te garanderen.
Monteer vervolgens de kamer en zorg ervoor dat de papier tab en microscoopslide perfect uitlijnen. Laat de kamer een uur in een 37 graden Celsius incubator. Scan de slide in een flatbed scanner om een digitaal beeld te creëren.
Laad het monster in de massaspectrometer en analyseer vervolgens met behulp van het juiste softwareplatform. Analyseer ten slotte de monsters zoals beschreven in het tekstprotocol. Hier getoond is een correct verwerkt weefselspecimen dat is afgebeeld op 50 micron en vertoont een goede macrostructuur en duidelijk verschil tussen witte en grijze stof.
Succesvol vergeleken monsters zullen duidelijke differentiatie op verschillende weefsellocatie tonen. Hier is er een duidelijke regio van upregulatie van het peptide weergegeven door een massa-ladingsverhouding van 1.085 in het witte stof gebied, zoals weergegeven door witte regio's. Ter vergelijking, dit onjuist voorbereide monster vertoont een grootschalige delocalisatie.
De patronen van de moleculen die over de drie panelen aanwezig zijn, tonen duidelijk dat er geen duidelijke definitie is tussen biologische regio's of verschillen in de abundantie van de weergegeven moleculen. Na het bekijken van deze
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol beschrijft een reproduceerbare en betrouwbare methode voor de sublimatie-gebaseerde voorbereiding van formeel gefixeerd weefsel bestemd voor beeldvorming massaspectrometrie. De techniek is ontworpen om beginnende gebruikers te helpen hun eigen workflows efficiënt te ontwikkelen.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Massaspectrometrie
- Weefselvoorbereiding
- Beeldvormingstechnieken
Achtergrond
- Beeldvorming massaspectrometrie is een krachtig hulpmiddel voor het analyseren van weefselmonsters.
- Formaline fixatie is een veelgebruikte methode voor het conserveren van biologische weefsels.
- Reproduceerbaarheid is cruciaal voor betrouwbare wetenschappelijke resultaten.
- Kosteneffectieve methodologieën zijn belangrijk voor wijdverbreide adoptie.
Doel van studie
- Om een eenvoudige en reproduceerbare methode te bieden voor weefselmonstervoorbereiding.
- Om beginnende gebruikers in staat te stellen hun eigen beeldvormingsworkflows te creëren.
- Om het proces van het voorbereiden van monsters voor peptide massaspectrometrie beeldvorming te stroomlijnen.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van nitrocellulose gecoate slides.
- Applicatie van vloeibare nitrocellulose op geleidende slides.
- Creatie van een gelijkmatige dunne-film coating met behulp van oppervlaktespanning.
- Drooien en opslaan van de slides op kamertemperatuur.
Belangrijkste resultaten
- De methode is zeer reproduceerbaar en eenvoudig te implementeren.
- Kosteneffectieve methodologieën werden met succes gebruikt.
- Beginnende gebruikers kunnen efficiënt monsters voorbereiden zonder uitgebreide empirische proeven.
Conclusies
- Dit protocol vergemakkelijkt de voorbereiding van weefselmonsters voor beeldvorming massaspectrometrie.
- Het biedt een betrouwbare aanpak voor onderzoekers in het veld.
- De methode verbetert de toegankelijkheid voor beginnende massaspectrometrie gebruikers.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Peptide-based MALDI MSI workflows face significant challenges in detecting analytes from formalin-fixed tissues due to cross-linking and spatial delocalization risks. This protocol provides a reproducible, cost-effective method to preserve spatial information while maximizing peptide ionization, directly supporting target validation and assay development in discovery pipelines. By enabling reliable peptide detection from archival FFPE samples, it enhances mechanistic de-risking and predictive confidence in early-stage therapeutic hypothesis testing.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by detecting spatially resolved peptides from FFPE archives.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity through reproducible sample preparation that maintains tissue integrity.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by generating quantitative peptide maps for target engagement assessment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening with preserved spatial context.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility via simple, manual coating steps.
- Scalability: Facilitates platform reuse across peptide, lipid, and small molecule screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery findings to preclinical validation through consistent FFPE sample handling.
- Biomarker Alignment: Enables correlation of MSI peptide signals with histopathological references like H&E staining.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by providing reliable molecular localization data from archival cohorts.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target hypothesis testing through lead identification and preclinical validation, specifically enabling peptide analysis from formalin-fixed samples that would otherwise be inaccessible to MALDI MSI.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by detecting endogenous peptides with spatial resolution.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible matrix coating and analyte localization without delocalization.
- Analytics: Generates quantitative ion intensity readouts that allow comparison of peptide abundance across tissue regions.
- Translational Research: Connects to preclinical workflows by enabling H&E and immunofluorescence co-registration for biomarker validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, low-cost capability for peptide MSI applicable across multiple therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through spatially resolved peptide detection from FFPE tissue.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via simple, manual steps requiring no automated instrumentation.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by reducing false negatives in peptide detection from archival samples.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization by unlocking historical tissue collections for target validation studies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in histology and mass spectrometry sample preparation.
- Depends on standard laboratory equipment including vacuum sublimation apparatus and incubators.
- Necessitates cross-team standardization of FFPE handling and reagent preparation between pathology and analytics teams.
- Involves adaptation considerations for different tissue types and fixation durations.
- Practical limitations include careful handling of explosive liquid nitrocellulose and precise volume control to prevent analyte delocalization.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:29
Preparation of Reagents and Equipment
1:21
Preparation of Tissue Sections and Methylene Crosslink Hydrolysis
2:40
Tissue Digestion
3:57
Matrix Coating via Sublimation
5:26
Recrystallization and Instrumentation
6:20
Results: Correctly and Incorrectly Prepared Human Brain Tissue
7:07
Conclusion
