Een kinetische fluorescentie gebaseerde Ca2 + mobilisatie Assay te identificeren van G eiwit-gekoppelde Receptor agonisten en antagonisten Allosteric modulatoren
20 februari 2018
De beschreven cellulaire assay is ontworpen voor de identificatie van CXC chemokine receptor 4 (CXCR4)-interagerende agenten die remmen of deze te stimuleren, concurrerend of allosterically, de intracellulaire Ca2 + release geïnitieerd door CXCR4 activering.
Het algemene doel van deze cel-gebaseerde test is om moleculen te identificeren en te karakteriseren die in staat zijn om G-eiwit-gekoppelde receptor-gemedieerde intracellulaire calciummobilisatie te stimuleren of te remmen. Deze methode kan een waardevolle test zijn voor G-eiwit-gekoppelde receptor geneesmiddelontdekking omdat het kan worden gebruikt om te screenen op moleculen die de receptor-gemedieerde intracellulaire calciumlichamen wijzigen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt om moleculen met agonistische of antagonistische eigenschappen binnen dezelfde test te identificeren.
Deze test kan helpen bij de ontdekking van nieuwe kandidaat-geneesmiddelen die werken op G-eiwit-gekoppelde receptoren, veelbelovende therapeutische doelen die een rol spelen bij vele menselijke ziekten. Op de dag van celpassagering, bekleed elke put van een zwartwandige polystyreen 96-putsplaat met doorzichtige bodems met 100 microliter van een 0,1% gelatine-oplossing en incubeer de platen gedurende twee uur op kamertemperatuur. Terwijl de gelatine aan het stollen is, gebruik een trypsine EDTA-oplossing om de cellen van belang van de bodem van hun kweekfles te heffen, de cellen op te schorsen in vers kweekmedium in een 50 milliliter conische buis zodra ze zijn losgekomen.
Na het tellen, verzamel de cellen door centrifugatie en schud het pellet in vers kweekmedium tot een concentratie van een maal 10 tot de vijfde levensvatbare cellen per milliliter. Wanneer de platen klaar zijn, gooi eventuele overtollige gelatine-oplossing weg en droog de platen op een labdoek. Was vervolgens de putten met 200 microliter PBS en vervang het wasmiddel met 200 microliter cellen per put voor een overnachtelijke incubatie bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.
De volgende ochtend, tik op de plaat om het kweekmedium uit de putten te gooien en droog de plaat met de bodem omhoog op een papieren handdoek. Label vervolgens de cellen in elke put met 100 microliter ladingsverfoplossing per put en incubeer de plaat gedurende 45 minuten in het donker op kamertemperatuur. Terwijl de cellen incuberen, voeg 75 microliter van CXCL12 per put toe aan de chemokine-plaat en 50 microliter van de verbinding van belang aan elke put van de verbindingsplaat.
Schakel vervolgens de koelunit van de fluorescentieplaatlezer in, gevolgd door de plaatlezer zelf. Nadat het systeem enkele minuten heeft gehad om te starten, open de software van de plaatlezer. Om het testprotocol in te stellen, selecteert u onder het tabblad instellingen de leesmodus en de juiste excitatie- en emissiegolflengten voor de ladingsverf.
Selecteer het tabblad mix met overdrachtsvloeistof voor automatische vermenging van de verbindingen in de verbindingsplaat. In het tabblad overdrachtsvloeistof, stel 20 microliter van elk put van de verbindingsplaat in om te worden overgebracht naar de meetplaat en plaats de pipettentips op 20 microliter onder het vloeistofvlak. Stel de zuigsnelheid in op 50 microliter per seconde en de uitdeelsnelheid op 25 microliter per seconde en klik op lezen met overdrachtsvloeistof.
Tijdens het eerste interval, selecteer 60 lezingen met een leesintervaltijd van één seconde met 10 lezingen die moeten worden geregistreerd voordat de verbindingen in de meetplaat worden gedoseerd en 50 lezingen die moeten worden voltooid erna. Stel het tweede interval in met een leesintervaltijd van 30 seconden en 18 lezingen. Selecteer drie tipwasbeurten voor het protocol, waarbij elke wasstap moet worden ingesteld om de juiste wasvloeistof, één wascyclus, een snelle pompsnelheid en vijf streken per wasbeurt te omvatten.
Gebruik de functie pauze pipettor om de pauze van de pipettor van 300 seconden in te sluiten en gebruik de instelling mix met overdrachtsvloeistof om automatische vermenging van de CXCL12-oplossing binnen de chemokine-plaat mogelijk te maken. In het volgende tabblad overdrachtsvloeistof, stel 25 microliter van elk put van de chemokine-plaat in om te worden overgebracht naar de meetplaat en plaats de tips 20 microliter onder het vloeistofvlak. Stel de zuigsnelheid in op 50 microliter per seconde en de uitdeelsnelheid op 25 microliter per seconde.
Gebruik de knop lezen met overdrachtsvloeistof om het eerste interval in te stellen om 145 lezingen te omvatten met een leesintervaltijd van één seconde. Stel het tweede interval in op een leesintervaltijd van zes seconden en 20 lezingen. Selecteer nog drie tipwascycli.
Klik vervolgens op de temperatuur van het podium instellen en stel de apparaattemperatuur in op 37 graden Celsius. Aan het einde van de ladingsverf incubatie, gooi de buffer van de meetplaat weg en droog de plaat op een labdoek. Was de cellen met 150 microliter per put van testbuffer en vervang de buffer na twee minuten door 80 microliter testbuffer.
Plaats de meetplaat in de leespositie, de verbindingsplaat op de bron twee-positie, de chemokine-plaat op de bron drie-positie en een doos met zwarte tips op de bron een-positie. Sluit het apparaat en klik op protocol signaaltest om de achtergrond relatieve lichteenheden en fluorescentievariantie over de plaat te bepalen. Selecteer testsignaal in het pop-upvenster.
Als achtergrondwaarden van 8.000 tot 10.000 relatieve lichteenheden worden verkregen, selecteert u updaten en klik op opslaan om het hoofdprotocol op te slaan. Druk vervolgens op uitvoeren om de test te starten. In deze grafiek kan een dosisafhankelijke toename van fluorescentie worden waargenomen die correleert met de dosisafhankelijke toename in de afgifte van calcium. Toenemende niveaus van CXCL12-geïnduceerde fluorescentie maken de opbouw van een dosisresponscurve mogelijk op basis van het verschil tussen de minimale en maximale respons boven de basislijn tussen de eerste meting na toevoeging van de chemokine en de laatste meting in het protocol. Geen fluorescerende calcium-gerelateerde respons werd opgeroepen door CXCL12, zelfs bij een hoge concentratie wanneer cellen werden gebruikt die het corresponderende functionele chemokine receptor CXCR4 misten, wat de receptorspecificiteit van de CXCL12-opgewekte meting aantoont. Een belangrijke toepassing voor deze cel-gebaseerde test is het identificeren van kleine moleculen
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze celgebaseerde assay is ontworpen om moleculen te identificeren en te karakteriseren die de door G-proteïnegekoppelde receptoren gemedieerde intracellulaire calciummobilisatie kunnen stimuleren of remmen. Hiermee kunnen stoffen worden gescreend die interageren met CXC-chemokine receptor 4 (CXCR4) en die de receptor-gemedieerde intracellulaire calciumvrijgave kunnen modificeren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Farmacologie
- Celbiologie
Achtergrond
- G-eiwitgekoppelde receptoren (GPCR's) zijn cruciale therapeutische doelwitten.
- Intracellulaire calciummobilisatie is een belangrijke signaalroute.
- Het identificeren van modulatoren van GPCR's kan leiden tot nieuwe kandidaat-geneesmiddelen.
- Assays kunnen onderscheid maken tussen agonistische en antagonistische eigenschappen.
Doel van de studie
- Om een methode te ontwikkelen voor het screenen van CXCR4-interagerende stoffen.
- Om geneesmiddelenonderzoek voor GPCR-gerelateerde ziekten te faciliteren.
- Om het begrip van receptor-gemedieerde signalering te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Celgebaseerde assay met gebruik van een 96-wells plaatformaat.
- Coaten van wells met gelatine om celhechting te ondersteunen.
- Gebruik van trypsine EDTA voor celdetachering en resuspensie.
- Screening naar moleculen die de intracellulaire calciumspiegels beïnvloeden.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van verbindingen die de calciumvrijgave kunnen remmen of stimuleren.
- Demonstratie van het vermogen van de assay om zowel agonisten als antagonisten te screenen.
- Potentieel voor de ontdekking van nieuwe therapeutische middelen die gericht zijn op GPCR's.
- Validatie van de effectiviteit van de assay in processen voor geneesmiddelenontwikkeling.
Conclusies
- De assay biedt een robuust platform voor de ontdekking van geneesmiddelen die zich richten op GPCR's.
- Het maakt de identificatie van diverse farmacologische agentia mogelijk.
- Deze methode kan bijdragen aan vorderingen in de behandeling van ziekten die verband houden met GPCR's.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Deze kinetische fluorescentie-gebaseerde Ca2+-mobilisatie-assay stelt biofarma R&D-teams in staat om te screenen op GPCR-agonisten, antagonisten en allosterische modulatoren in één robuust celgebaseerd formaat. Door kwantitatieve real-time read-outs van de intracellulaire calciumflux te leveren, ondersteunt de assay vroege targetvalidatie en mechanistische risicoreductie voor drug discovery-programma's gericht op GPCR's. De aanpasbaarheid aan meerdere GPCR's vergroot de herbruikbaarheid van de assay binnen de gehele portfolio en het voorspellende vertrouwen bij de identificatie van lead-verbindingen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door onderscheid te maken tussen agonist-, antagonist- en allosterische modulatoractiviteit bij CXCR4 en andere Ca2+-mobiliserende GPCR's.
- Operationele waarde: Ondersteunt functionele targetvalidatie via dosisafhankelijke inhibitie of stimulatie van ligand-geïnduceerde calciumvrijzetting.
- Voorspellende waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit bij vroege lead-identificatie door directe functionele readouts van receptormodulatie te leveren.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert kwantitatieve, kinetische fluorescentiegegevens die geschikt zijn voor hit-bevestiging en structuur-activiteitsrelatie (SAR)-analyse.
- Operationele waarde: Compatibel met 96-well plaatformaten en geautomatiseerde vloeistofbehandeling voor high-throughput screeningscampagnes.
- Reproduceerbaarheid: Bevat ingebouwde wasstappen en temperatuurcontroles om variabiliteit tussen de wells te minimaliseren en assay-standaardisatie te ondersteunen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Continuïteit: Maakt gebruik van ziekterelevante GPCR-signalering (Ca2+-mobilisatie) om de brug te slaan tussen discovery en preklinische efficiëntiemodellering.
- Afstemming van Biomarkers: Calciumflux dient als een proximale, mechanistisch gekoppelde readout voor de activering van downstream-paden in ziektemodellen.
- Risico-gecorrigeerde Voortgang: Maakt vroege triage van verbindingen mogelijk op basis van functionele potentie en selectiviteit, waardoor het risico op uitval in een later stadium wordt verminderd.
Integratie van Pipeline & Workflow
De assay past binnen het vroeg stadium van het ontdekkingsproces en ondersteunt de identificatie van leadverbindingen via functionele screening van GPCR-modulatoren voordat er wordt overgegaan naar preklinische validatie.
- Discovery Biology: Faciliteert hypothesetesten en de verduidelijking van signaalpaden door real-time intracellulaire calciumdynamiek te meten na receptoractivatie.
- Screening: Biedt assay-gereedheid en kwantitatieve resultaten die een betrouwbare evaluatie van verbindingen over chemotypische series mogelijk maken.
- Analytics: Genereert dosis-responscurves en IC50/EC50-waarden via niet-lineaire regressie ter ondersteuning van de prioritering van verbindingen.
- Translationeel onderzoek: Legt een verbinding met preklinisch werk via geconserveerde GPCR-signaleringsmechanismen, in het bijzonder in immuun- en oncologische ziektemodellen.
- Bedrijfsbrede hergebruik: Vereist minimale aanpassing voor implementatie bij andere GPCR-targets, wat schaalbaarheid op platformniveau en consistentie tussen projecten bevordert.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen in targetmodulatie, vermindering van fout-positieven door receptor-specifieke controles en mechanistische risicoreductie van vroege leads.
- Operationele waarde: Standaardisatie via geautomatiseerde vloeistofoverdracht, temperatuurregeling en wasprotocollen; schaalbaarheid voor screening met een medium tot hoge doorvoer.
- Strategische waarde: Verbeterde go/no-go-beslissingen door functionele activiteit (agonisme, antagonisme, allosterische modulatie) in een vroeg stadium van de discovery funnel te identificeren.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van GPCR-gerichte programma's mogelijk op basis van functionele validatie en data over target engagement.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in celkweek, het laden van fluorescente kleurstoffen en het bedienen van een fluorescentieplaatlezer.
- Afhankelijk van instrumentatie die in staat is tot kinetische fluorescentiemetingen met geautomatiseerde vloeistofoverdracht en temperatuurregeling.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor de celpreparatie, de tijden voor het laden van kleurstoffen en de procedures voor het uitplaten van verbindingen.
- Aanpassing aan andere GPCR's kan validatie van de receptorexpressie en koppeling aan Ca2+-signaalpaden vereisen.
- Potentiële interferentie door autofluorescente verbindingen maakt counter-screening of bevestiging via een orthogonale assay noodzakelijk.
