Name: Zika Virus specifieke diagnostische Epitope ontdekking (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Ontdek hoe je Zika-virus-specifieke peptiden identificeert voor diagnostische assays met behulp van een high-density peptide microarray. Deze methode detecteert IgM- en IgG-antilichamen in serum en biedt een tijdlijn van infectie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Huidige wordt ondersteund door een SBIR (Small Business Innovation Research) administratieve toeslag subsidie van NIDCRR44 DE024456. U01 DE017855 NIDCR HIV-subsidie die ontstaan uit NIDCR verlenen voor de ontwikkeling van een bevestigende diagnose van de point-of-care voor HIV. Wij erkennen dankbaar Silke Weisenburger(PEPperPRINT Heidelberg, Germany) voor haar technische bijstand en vriendelijke ondersteuning. Wij danken ook NYU Langone Medical Center voor het LI-COR Odyssey Imaging systeem.

Deze gegevens zijn een onderdeel van een lopend onderzoek studie, uitgevoerd aan de New York University College voor tandheelkunde en goedgekeurd door de institutionele Review Board van de New York University School of Medicine, IRB # H10-01894. Klinische monsters gebruikt in deze studie werden de geïdentificeerde monsters eerder gebruikt voor diagnose en met toestemming van de Wadsworth Center van New York State Department van gezondheid, Albany, NY.
1. het installeren de ZIKV High-density Peptide Microarray Slide in een specifieke incubatie-lade
<ol><li>Omgaan met het glasplaatje door de randen met poederloze handschoenen. De afmetingen van de dia glas zijn 75.4 mm door 25.0 mm en 1 mm dik. Plaats de dia in het incubatie-lade met het microarray oppervlak naar boven.</li>
	<li>Plaats de glanzende zijde van het zegel beneden zijn gericht op het bedrukte oppervlak van microarray. Om een goede positie, overlappen de schroefgaten van het zegel en de grondplaat.</li>
	<li>Plaats het bovenste gedeelte van de lade naar het zegel te maken een microarray kamer.</li>
	<li>Het beveiligen van de dia in de lade door aanscherping even de duimschroeven achter elkaar met de hand in een afwisselend patroon vanaf de linkerbovenhoek gevolgd door rechtsonder. Plaats het deksel van de incubatie-lade.</li>
</ol>2. achtergrond interactie detectie: Kleuring de Microarray met secundaire antilichamen
Opmerking: Gebruik een pipet om het storten van de oplossingen (standaard en blokkerende buffers, verdunde secundaire antilichamen) in de hoek van de kamer van microarray.
<ol><li>Incubeer de microarray met een standaard buffer (1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), 0,05% Tween 20, pH 7.4, gefilterd met een 0,45 µm filter) (totale hoeveelheid 2.000 µL/microarray) gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (RT) op een roteerschudapparaat bij 140 omwentelingen per minuut.</li>
	<li>Verwijder de standaard buffer door zuigen met een pipet uit de hoek van de kamer van microarray. Vul lege dia houders met lege dia's om te voorkomen dat het breken van de dia van microarray.</li>
	<li>Blokkeren de microarray met de buffer met blokkerend (totale hoeveelheid 2.000 µL/microarray) gedurende 60 minuten op RT op een roteerschudapparaat bij 140 omwentelingen per minuut.</li>
	<li>Verwijder de buffer met blokkerend door zuigen met een pipet uit de hoek van de kamer van microarray.</li>
	<li>Incubeer de microarray met secundair antilichaam, Anti-menselijke IgM fluorescerende geconjugeerd, verdunde 1:5000 (totale hoeveelheid 2.000 µL/microarray) in de kleuring buffer (10% blokkeerbuffer in standaard buffer) gedurende 30 min. bij RT in het donker op een roteerschudapparaat op 140 rpm.</li>
	<li>Het secundaire antilichaam verwijderen door zuigen met een pipet uit de hoek van de kamer van microarray.</li>
	<li>Wassen van de microarray 3 x, 1 min per wasbeurt met standaard buffer (totale hoeveelheid 2.000 µL/microarray op RT op een roteerschudapparaat bij 140 omwentelingen per minuut. Na elke wasbeurt, verwijdert u het standaard buffer door zuigen met een pipet uit de hoek van de kamer van microarray.</li>
	<li>Dompel de dia 2 x in een vers bereide dompelen buffer (1 mM Tris, pH 7.4), (totaal volume van 200 mL).</li>
	<li>Droog de microarray zorgvuldig, voor ongeveer 1 min., door het zuigen overtollige vocht zeer zorgvuldig vanaf de top naar de onderkant van de dia zonder het aanraken van de dia-oppervlak. Het analyseren van de dia in een microarray scanner lezer.</li>
</ol>3. blootstelling van de Microarray voor het hosten van Serum
Let op: Deze stap onder laboratoriumomstandigheden veiligheid, Biosafety Level 2 (BSL-2) vanwege de potentiële besmettelijke aard van de serum-exemplaren uitvoeren. Werken binnen een klasse II biologische veiligheidskast (BSC).
<ol><li>Inactivering van serummonster bij 56 ° C gedurende 30 minuten en centrifuge op 16.000 rcf gedurende 5 minuten bij 4 ° C13. Opmerking: Gebruik een pipet om het storten van de oplossingen (kleuring, standaard buffer en verdund serum) in de hoek van de kamer van microarray.</li>
	<li>Verdun serummonster in kleuring buffer beginnen bij een verdunning 1:1,000 (totale hoeveelheid 2.000 μL/microarray). Houd het bij 4 ° C tot gebruik.</li>
	<li>Incubeer de microarray met de kleuring buffer (totale hoeveelheid 2.000 μL/microarray) gedurende 15 minuten op RT op een roteerschudapparaat bij 140 omwentelingen per minuut.</li>
	<li>Verwijder de kleuring buffer door zuigen met een pipet uit de hoek van de kamer van microarray.</li>
	<li>Incubeer de microarray met de verdunde serummonster 's nachts bij 4 ° C op een roteerschudapparaat bij 140 omwentelingen per minuut.</li>
	<li>Verwijder het verdunde serummonster door zuigen met een pipet uit de hoek van de kamer van microarray.</li>
	<li>Wassen van de microarray 3 x, 1 min per wasbeurt met standaard buffer (totale hoeveelheid 2.000 μL/microarray op RT op een roteerschudapparaat bij 140 omwentelingen per minuut. Na elke wasbeurt, verwijdert u het standaard buffer door zuigen met een pipet uit de hoek van de kamer van microarray.</li>
</ol>4. vlekken met secundaire antilichamen en gelabelde controle antilichamen
Opmerking: Gebruik een pipet om het storten van de oplossingen (standaard buffers, verdunde middelbare en label antilichamen) in de hoek van de kamer van microarray.
<ol><li>Verdun het secundaire antilichaam in de kleuring buffer. Opmerking: Gebruik anti-menselijke IgM fluorescerende geconjugeerd antilichaam of anti-menselijke IgG fluorescerende geconjugeerd antilichaam bij een verdunning 1:5,000 (totale hoeveelheid 2.000 µL/microarray) in kleuring buffer.</li>
	<li>Mix besturingselement label antilichaam (monoklonaal anti-HA fluorescerende geconjugeerd) bij een verdunning 1:1,000 (totale hoeveelheid 2 000 µL/microarray) in buffer met secundair antilichaam eerder verdund in buffer kleuring vlekken.</li>
	<li>Incubeer met de microarray gedurende 30 min. op RT in het donker op een roteerschudapparaat bij 140 omwentelingen per minuut.</li>
	<li>Verwijder de mix van verdunde middelbare en label antilichamen door zuigen met een pipet uit de hoek van de kamer van microarray.</li>
	<li>3 x met standaard buffer (totale hoeveelheid 2.000 µL/microarray) wassen. Elke wasbeurt is voor 1 min op een roteerschudapparaat bij 140 omwentelingen per minuut. Na elke wasbeurt, verwijdert u het standaard buffer door zuigen met een pipet uit de hoek van de kamer van microarray.</li>
</ol>5. Microarray scannen
<ol><li>Dompel de dia 2 x in vers bereide dompelen buffer (1 mM Tris, pH 7.4) (totaal volume van 200 mL).</li>
	<li>Droog de microarray zorgvuldig, ongeveer 1 min., door zuigen zeer zorgvuldig vanaf de top naar de onderkant van de dia zonder het aanraken van de dia-oppervlak.</li>
	<li>Scan de microarray volgens de instructies van de scanner. Plaats de dia op de scanner met het bedrukte oppervlak naar boven.</li>
	<li>Maak een nieuw project en selecteer het scangebied. Scanner parameters als instellen: resolutie: 21 µm, intensiteit voor zowel 700 en 800 nm kanalen: 7.0, scannen kwaliteit: medium en Offset: 0.8.</li>
	<li>Verwerven en sla de scan onbewerkte afbeelding als een 16-bits grayscale TIFF bestandsformaat.</li>
</ol>6. Microarray analyse met behulp van een specifieke Software
<ol><li>Open de onbewerkte afbeelding (TIFF-afbeelding). Open het bestand van de grid array.</li>
	<li>Het raster van de array naar de scannen afbeelding uitlijnen met de pijltjestoetsen muis of het toetsenbord van de computer.</li>
	<li>Selecteer "Kwantificeren selectie" in de specifieke software, waardoor een uitlezing-bestand waarin de signaalsterkte voor elke vlek, de waarde van de achtergrond en de corresponderende opeenvolging van peptide. Opmerking: Dit uitvoerbestand kan ook worden geïmporteerd naar een spreadsheetprogramma voor aanvullende analyse en grafieken.</li>
</ol>7. Microarray opslag
<ol><li>Bewaar de microarray verzegeld in het donker bij 4 ° C onder zuurstof vrij stikstof of argon gas.</li>
</ol>

<ol><li>Kelser, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meet+dengue%27s+cousin%5BTitle%5D)+AND+%22Zika.+Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Meet dengue's cousin.</a> Zika. Microbes Infect. 18 (3), 163-166 (2016).</li>
<li>Musso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Zika+virus+in+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Virol%22%5BJournal%5D)">Detection of Zika virus in saliva.</a> J Clin Virol. 68, 53-55 (2015).</li>
<li>Siqueira, W. L., et al. <a target="_blank" href="https://www.oralhealthgroup.com/features/oral-clinical-manifestations-patients-infected-zika-virus/">Oral Clinical Manifestations of Patients Infected with Zika Virus.</a> Oral Health. , (2016).</li>
<li>Duarte, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+of+Zika+Virus+Infection+in+Pregnant+Women%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Bras+Ginecol+Obstet%22%5BJournal%5D)">Challenges of Zika Virus Infection in Pregnant Women.</a> Rev Bras Ginecol Obstet. 38 (6), 263-265 (2016).</li>
<li>Buus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+mapping+of+linear+antibody+epitopes+using+ultrahigh-density+peptide+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High-resolution mapping of linear antibody epitopes using ultrahigh-density peptide microarrays.</a> Mol Cell Proteomics. 11 (12), 1790-1800 (2012).</li>
<li>Kouzmitcheva, G. A., Petrenko, V. A., Smith, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+diagnostic+peptides+for+lyme+disease+through+epitope+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Identifying diagnostic peptides for lyme disease through epitope discovery.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 8 (1), 150-160 (2001).</li>
<li>Hamby, C. V., Llibre, M., Utpat, S., Wormser, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Peptide+library+screening+to+detect+a+previously+unknown+linear+diagnostic+epitope%3A+proof+of+principle+by+use+of+lyme+disease+sera%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Use of Peptide library screening to detect a previously unknown linear diagnostic epitope: proof of principle by use of lyme disease sera.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 12 (7), 801-807 (2005).</li>
<li>t Hoen, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+display+screening+without+repetitious+selection+rounds%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Phage display screening without repetitious selection rounds.</a> Anal Biochem. 421 (2), 622-631 (2012).</li>
<li>Townend, J. E., Tavassoli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traceless+Production+of+Cyclic+Peptide+Libraries+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Traceless Production of Cyclic Peptide Libraries in E. coli.</a> ACS Chem Biol. 11 (6), 1624-1630 (2016).</li>
<li>Turchetto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+expression+of+animal+venom+toxins+in+Escherichia+coli+to+generate+a+large+library+of+oxidized+disulphide-reticulated+peptides+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">High-throughput expression of animal venom toxins in Escherichia coli to generate a large library of oxidized disulphide-reticulated peptides for drug discovery.</a> Microbial Cell Factories. 16 (1), 6(2017).</li>
<li>Carmona, S. J., Sartor, P. A., Leguizamon, M. S., Campetella, O. E., Aguero, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+Peptide+Discovery%3A+Prioritization+of+Pathogen+Diagnostic+Markers+Using+Multiple+Features%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Diagnostic Peptide Discovery: Prioritization of Pathogen Diagnostic Markers Using Multiple Features.</a> Plos One. 7 (12), e50748(2012).</li>
<li>Lagatie, O., Van Dorst, B., Stuyver, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+three+immunodominant+motifs+with+atypical+isotype+profile+scattered+over+the+Onchocerca+volvulus+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Identification of three immunodominant motifs with atypical isotype profile scattered over the Onchocerca volvulus proteome.</a> PLoS Negl Trop Dis. 11 (1), e0005330(2017).</li>
<li>Basile, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+an+ELISA+kit+%28YF+MAC-HD%29+to+detect+IgM+to+yellow+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Development and validation of an ELISA kit (YF MAC-HD) to detect IgM to yellow fever virus.</a> J Virol Methods. 225, 41-48 (2015).</li>
<li>Madden, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK153387/">The BLAST Sequence Analysis Tool.</a> The NCBI Handbook. , 2nd ed, (2013).</li>
<li>Services, U. S. D. oH. aH. <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/">Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL)</a>. , 5th ed, Vol. HHS Publication No. (CDC) 21-1112 (2009).</li>
<li>Pellois, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individually+addressable+parallel+peptide+synthesis+on+microchips%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">Individually addressable parallel peptide synthesis on microchips.</a> Nat Biotech. 20 (9), 922-926 (2002).</li>
<li>Stafford, P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22261726">Physical Characterization of the "Immunosignaturing Effect".</a> Mol Cell Proteomics. 11 (4), (2012).</li>
<li>Gardner, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+screening+for+anti-CMV+biologics+identifies+a+broadly+neutralizing+epitope+of+an+essential+envelope+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Functional screening for anti-CMV biologics identifies a broadly neutralizing epitope of an essential envelope protein.</a> Nat Commun. 7, (2016).</li>
<li>Nixon, C. E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28468980">Identification of protective B-cell epitopes within the novel malaria vaccine candidate P. falciparum Schizont Egress Antigen-1.</a> Clin Vaccine Immunol. , (2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

We ontwierpen een protocol met behulp van een diskette met hoge dichtheid peptide microarray met de gehele Zika virus eiwit sequentie (Frans-Polynesische stam). De microarray werd geproduceerd door afdrukken 3,423 verschillende overlappende lineaire peptiden. Elke peptide was 15 aminozuren en gevarieerd door slechts één residu van zijn naaste buur in de reeks (d.w.z., 14 residu overlapping). Hoewel kortere overlappingen kunnen worden afgedrukt, is epitoop toewijzing nauwkeuriger met langere overlappingen. Elke p...

Zika virus (ZIKV) diagnose op basis van klinische symptomen is uitdagend omdat het deelt vectoren, geografische spreiding en symptomen met Dengue en Chikungunya virus infectie1. Gezien het risico voor ongewenste zwangerschap resultaten bij vrouwen geïnfecteerd met ZIKV tijdens de zwangerschap, is het belangrijk om te onderscheiden tussen de 3 virussen. Hoewel de huidige moleculaire diagnostische tests specifiek zijn, zijn ze alleen nuttig in bloed of speeksel in de relatief korte periode van acute infectie2,3. Serologische tests zijn essentieel voor de diagnose buiten deze beginperiode van infectie4.
De ontwikkeling van een specifieke serologische test ZIKV is een uitdaging om twee redenen: ten eerste de Zika-antigenen die het menselijke immuunsysteem reageert op niet op dit moment bekend zijn; en tweede, geconserveerde flavivirussen aminozuur sequenties veroorzaken antilichaam Kruisallergie. Ons doel was om te ontdekken unieke ZIKV specifieke peptiden in diagnostiek worden gebruikt. Verschillende benaderingen zijn ontwikkeld om scherm peptide bibliotheken die betrekking hebben op hele eiwitten met inbegrip van phage, bacteriële, en gist oppervlak weer5,6,7,8,9, 10. Onze strategie was het gebruik van een hoge dichtheid peptide microarray waarmee snelle en goedkope high-throughput serologische screenings11,12 en nadien de geïdentificeerde peptiden kunnen worden gebruikt ter verbetering van de huidige serologische tests voor de opsporing van ZIKV infectie.
Dit protocol maakt de ontdekking van Zika virus specifieke diagnostische peptiden met behulp van een diskette met hoge dichtheid peptide microarray (Figuur 1). De high-density peptide microarray werd geproduceerd met behulp van de peptide laser printing technologie. De gehele ZIKV eiwit reeks bestaande uit 3,423 aminozuurresidu's op basis van de Frans Polynesische stam (GenBank: KJ776791.2), werd gedrukt op een standaard glasplaatje in blokken van 15 lineaire residuen met een overlapping van 14 aminozuurresidu's in tweevoud voor een totaal 6,846 peptide vlekken. Naast de gehele Zika eiwit sequentie peptides, de microarray maakt gebruik van Influenza hemagglutinine (HA) peptiden voor interne controle.
Een Zika gevalideerd positieve serummonster verkregen Wadsworth Center (Albany, NY), werd gebruikt voor het identificeren van specifieke immunoglobuline M (IgM) en immunoglobuline G (IgG) reactieve peptiden. Na incubatie met het monster 's nachts, was de microarray gekleurd met een secundaire fluorescerende geconjugeerd antilichaam (Anti-menselijke IgM of anti-menselijke IgG) en geanalyseerd op een microarray scanner. Kwantificering van plek intensiteiten en peptide aantekening werd uitgevoerd met een specifieke software geboden door hetzelfde bedrijf dat de microarray vervaardigd.

<table><tbody><tr><td>PEPperCHIP Custom Peptide Microarray</td><td>PEPperPRINT</td><td>PPC.001.001</td><td>Custom peptide microarray: onze microarray bevat de volledige Zika-virus-eiwitsequentie</td></tr><tr><td>PEPperCHIP incubatielade 3/1</td><td>PEPperPRINT</td><td>PPC.004.001</td><td></td></tr><tr><td>PEPperCHIP-kleuringskit (680 nm) (anti-HA, DyLight-labeling)</td><td>PEPperPRINT</td><td>PPC.037.002</td><td></td></tr><tr><td>PepSLide Analyzer</td><td>PEPperPRINT</td><td>PSA.004.001</td><td>14 dagen gratis licentie voor Windows</td></tr><tr><td>Rockland Blocking buffer</td><td>Rockland</td><td>MB-070</td><td></td></tr><tr><td>anti-human IgM (mu keten) DyLight 800</td><td>Rockland</td><td>609-145-007</td><td></td></tr><tr><td>anti-human IgG Fc DyLight 680</td><td>Thermo Scientific</td><td>SA5-10138</td><td></td></tr><tr><td>LI-COR Odyssey Imaging System</td><td>LI-COR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orbitale shaker-apparaat</td><td>IKA</td><td>MTS 2/4 digitale microtiter shaker</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Illustrator</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deltagraph</td><td>Redrocks</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

zika virus specifieke diagnostische epitope ontdekking

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

High-density peptide microarrays toestaan screening van meer dan zesduizend peptiden op een uniforme standaard microscopie dia. Deze methode kan worden toegepast voor drugontdekking therapeutische target identificatie en ontwikkeling van diagnostiek. Hier presenteren we een protocol om te ontdekken van specifieke Zika virus (ZIKV) diagnostische peptiden met behulp van een diskette met hoge dichtheid peptide microarray. Een menselijke serummonster gevalideerd voor ZIKV infectie was geïncubeerd met een hoge dichtheid peptide microarray die hele ZIKV eiwit vertaald in 3,423 unieke 15 lineaire aminozuurresidu (aa) 's met een overlapping van 14-aa residuen bevatten afgedrukt in tweevoud. Kleuring met verschillende secundaire antilichamen binnen dezelfde array, we gedetecteerd peptiden die zich aan immunoglobuline M (IgM) en immunoglobuline G (IgG) antilichamen in het serum aanwezig binden. Deze peptiden werden geselecteerd voor verdere validatie experimenten. In dit protocol beschrijven we de strategie gevolgd om te ontwerpen, verwerken en analyseren van een high-density peptide microarray.

De resultaten verkregen met behulp van het protocol beschreven zijn afgebeeld in Figuur 2 en Figuur 3. Geen achtergrond interacties werden geconstateerd wanneer vooraf kleuring de microarray met secundaire anti-mens IgM (gegevens niet worden weergegeven). Kleuring met een anti-mens IgM resulteerde conjugaat in verschillende gebieden boven de achtergrond groene fluorescentie intensiteiten, met vermelding van de b...

In dit protocol beschrijven we een techniek om te ontdekken Zika virus specifieke diagnostische peptiden met behulp van een diskette met hoge dichtheid peptide microarray. Dit protocol kan readly worden aangepast voor andere opkomende infectieziekten.

Zika Virus specifieke diagnostische Epitope ontdekking

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

Het algemene doel van dit experiment is om Zika-virusspecifieke peptiden te identificeren voor gebruik in een diagnostisch onderzoek om Zika-virusantilichamen te detecteren. Dit is cruciaal, omdat het virus binnen ongeveer 10 dagen uit het bloed verdwijnt, terwijl antilichamen jarenlang aanwezig blijven. Deze methode stelt ons in staat om antigenen en epitopen te identificeren door gebruik te maken van een microarray van het volledige Zika-proteoom om peptiden te identificeren die IgM of IgG antilichamen in een serummonster van een geïnfecteerde persoon vastleggen.Het belangrijkste voordeel van het detecteren van zowel vroege antilichamen, IgM, en latere antilichamen, IgG, is om de clinicus een tijdlijn van de infectie te geven. En dit is vooral belangrijk bij zwangere vrouwen. Hoewel dit protocol inzicht geeft in de oorzaak van de Zika-virusinfectie, kan het worden toegepast op andere pathogenen, met behulp van een microarray die specifiek is voor dat pathogeen als de eiwitsequentie bekend is.Houd de glazen plaat vast aan de randen met poedervrije handschoenen. De afmetingen van de glazen plaat zijn 75,4 millimeter bij 25,0 millimeter en 1 millimeter dik. Plaats de plaat in de incubatielade met de microarrayoppervlak naar boven.Vul de lege schuifhouders met lege schuiven om te voorkomen dat de microarrayplaat breekt. Plaats de glanzende kant van de afdichting met de afdichting naar beneden op het bedrukte oppervlak van de microarray. Om een goede positie te garanderen, overlappen de schroefgaten van de afdichting en de basisplaat elkaar.Plaats het bovenste deel van de lade op de afdichting om een microarraykamer te creëren. Bevestig de plaat in de lade door de duimschroeven één voor één met de hand vast te draaien in een afwisselend patroon. Begin vanuit de bovenkant links en ga naar de onderkant rechts.Plaats het deksel op de incubatielade. Zorgvuldig omgaan met de microarray is essentieel om krassen op het microarrayoppervlak te voorkomen. Oplossingen worden toegevoegd aan en vervolgens verwijderd uit de hoek van de microarraykamer.Het drogen van de microarray is ook belangrijk om een goede scanafbeelding te krijgen. Incubeer de microarray met 2.000 microliter standaardbuffer per microarray gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur op een orbitale shaker bij 140 rpm. Verwijder de standaardbuffer door te aspireren met een pipet uit de hoek van de microarraykamer, blokkeer vervolgens de microarray met een blokkeringsbuffer gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur op een orbitale shaker bij 140 rpm.Verwijder de blokkeringsbuffer door te aspireren uit de hoek van de microarraykamer met een pipet. Voeg anti-menselijke IgM fluorochroomgeconjugeerde secundaire antilichaam verdund 1:5.000 in de kleuringsbuffer toe aan de microarray. Incubeer vervolgens de microarray gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker op een orbitale shaker bij 140 rpm.Gebruik een pipet om het secundaire antilichaam te verwijderen door te aspireren uit de hoek van de microarraykamer. Was de microarray gedurende één minuut met 2000 microliter met standaardbuffer per microarray bij kamertemperatuur op een orbitale shaker bij 140 rpm. Verwijder de standaardbuffer met behulp van de gedemonstreerde techniek en herhaal de wassing twee keer.Dompel vervolgens de plaat twee keer in 200 milliliter van een vers bereide doopbuffer. Droog de microarray voorzichtig gedurende ongeveer een minuut door overtollig vocht heel voorzichtig van de bovenkant naar de onderkant van de plaat te aspireren zonder het plaatoppervlak aan te raken. Analyseer de plaat in een microarrayscannerlezer zoals later in deze video wordt gedemonstreerd.Inactiveer het serummonster gedurende 30 minuten bij 56 graden Celsius. Centrifugeer vervolgens het monster gedurende vijf minuten bij 16.000 RCF bij vier graden Celsius. Bewaar het monster bij vier graden Celsius tot gebruik.Incubeer vervolgens de microarray met de kleuringsbuffer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur op een orbitale shaker bij 140 rpm. Verwijder de kleuringsbuffer door te aspireren uit de hoek van de microarraykamer met een pipet. Verdun het serummonster en de kleuringsbuffer, beginnend met een 1:1.000 verdunning.Incubeer het verdunde monster met de microarray een nacht bij vier graden Celsius op een orbitale shaker bij 140 rpm. Verwijder het verdunde serummonster met behulp van de gedemonstreerde techniek. Was vervolgens de microarray drie keer zoals eerder.Verdun het secundaire antilichaam in de kleuringsbuffer. Gebruik anti-menselijke IgM fluorochroomgeconjugeerd antilichaam of anti-menselijke IgG fluorochroomgeconjugeerd antilichaam in een verdunning van 1:5.000 in kleuringsbuffer. Meng vervolgens het controle-gelabelde antilichaam in een verdunning van 1:1000 in kleuringsbuffer met het verdunde secundaire antilichaam.Incubeer met de microarray gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker en op een orbitale shaker bij 140 rpm. Verwijder het mengsel van verdund secundair en gelabeld antilichaam door te aspireren uit de hoek van de microarraykamer met een pipet. Was vervolgens de microarray drie keer met standaardbuffer.Elke wasbeurt duurt één minuut op een orbitale shaker bij 140 rpm. Verwijder ten slotte het wasbuffer uit de microarraykamer zoals eerder. Om microarray-scanning uit te voeren, dompel de plaat twee keer in 200 milliliter vers bereide doopbuffer.Droog de microarray gedurende ongeveer een minuut door heel voorzichtig van de bovenkant naar de onderkant van de plaat te aspireren zonder het plaatoppervlak aan te raken. Scan de microarray volgens de instructies van de scanner. Plaats de plaat op de scanner met de bedrukte kant naar boven.Maak een nieuw project aan en selecteer het scangebied. Stel de scannerparameters in met een resolutie van 21 micron, een intensiteit van 7,0 voor zowel de 700 als 800 nanometer kanalen, een scankwaliteit van gemiddeld en een offset van 0,8. Verkrijg en sla het scantekenbeeld op als een 16-bits grijswaarden TIF-bestandsformaat.Om de gegevens te analyseren, opent u de ruwe afbeelding. Open vervolgens het arrayrasterbestand. Lijn het arrayraster uit met het scanbeeld met de muis of pijltjestoetsen van de computer.

zika-virus-specific-diagnostic-epitope-discovery

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Zika Virus (ZIKV), een opkomend pathogeen, wordt in verband gebracht met foetale ontwikkelingsstoornissen en microcefalie. De oprichting van een effectief infectieus celkweeksysteem is cruciaal voor studies naar ZIKV-replicatie evenals voor de ontwikkeling van vaccins en geneesmiddelen. In deze studie worden verschillende virologische tests met betrekking tot ZIKV geïllustreerd en besproken.

Zika Virus Besmettelijke celcultuur en de<em&gt; In Vitro</em&gt; Profylactisch effect van interferonen

Hier presenteren de auteurs een eenvoudig en efficiënt protocol om een lineair antigeen epitoop te definiëren met behulp van een gezuiverd monoklonaal antilichaam en peptide scanning door dot-blot hybridisatie. De geïdentificeerde epitoop kan vervolgens worden gebruikt in therapeutische en diagnostische toepassingen.

Peptide Scanning-bijgestaan ​​Identificatie van een monoklonaal antilichaam-erkende Lineair B-celepitoop

Dit protocol beschrijft het herstel van infectief Zika-virus uit een infectieuze cDNA-kloon met twee plasmiden.

Redding en karakterisering van het recombinante virus van een nieuwe infectieuze kloon van de Zika Virus

Huidige multiplexed diagnostiek te detecteren Zika, chikungunya, dengue virussen vereisen complexe monstervoorbereiding en dure instrumentatie en moeilijk te gebruiken in omgevingen met lage resource. Laten we een diagnose die gebruikmaakt van isotherme amplificatie met doelgroepen gerichte strand verschuifbare sondes op te sporen en deze virussen onderscheiden met hoge gevoeligheid en specificiteit.

Multiplexed isotherme amplificatie gebaseerd diagnostische Platform om te detecteren Zika, Chikungunya en Dengue 1

Een protocol bij het evalueren van antigeen-specifieke T-cel-reacties in de organen van de immunoprivileged van het Ifnar1- / - lymfkliertest model voor de Zika-virus (ZIKV)-infectie wordt beschreven. Deze methode is cruciaal voor het onderzoeken van de cellulaire mechanismen voor de bescherming en immunopathogenese van ZIKV vaccins en is ook waardevol voor de evaluatie van hun doeltreffendheid.

Evaluatie van Zika Virus-specifieke T-cel reacties in Immunoprivileged organen van besmette Ifnar1- / - muizen

Beschrijven we een methode om te evalueren van het effect van reeds bestaande immuniteit tegen dengue virus op de Zika-virus-infectie met behulp van menselijk serum, primaire menselijke cellen en kwantificering van de infectie door kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie.

Kwantificering van antilichaam-afhankelijke versterking van het Zika-Virus in primaire menselijke cellen

Het doel van het protocol is om de technieken aan te tonen die worden gebruikt om virale ziekten te onderzoeken door het Zikavirus te isoleren en te kwantificeren, van meerdere organen in een muis na infectie.

Isolatie en kwantificering van het Zikavirus van meerdere organen in een muis

Het gepresenteerde protocol kan de vectorcompetentie van Aedes aegypti-muggenpopulaties voor een bepaald virus, zoals Zika, in een containmentomgeving bepalen.

Vectorcompetentieanalyses op Aedes aegypti-muggen met behulp van het Zika-virus

In dit werk beschrijven we de protocollen die worden gebruikt in op replicon gebaseerde en virale enzymgebaseerde testen om te screenen op remmers van Zika-virusreplicatie in een screeningsformaat met hoge doorvoer.

Antivirale testen met hoge doorvoer om te screenen op remmers van Zika-virusreplicatie

Multiplexfluorescentie-immunoassays worden een referentie voor serologische tests. Hun toepassing wordt echter beperkt door de complexiteit en tijdrovende processen voor het koppelen van kralen en analyten. Dit rapport presenteert een semi-automatisch, reproduceerbaar multiplex-protocol voor het koppelen van microbolletjes dat vergelijkbaar is met de standaardmethode, terwijl de tijd tot resultaten aanzienlijk wordt verkort.

Een multiplex serologische test voor de detectie van antilichaamresponsen op arbovirussen

Ontdek hoe je Zika-virus-specifieke peptiden identificeert voor diagnostische assays met behulp van een high-density peptide microarray. Deze methode detecteert IgM- en IgG-antilichamen in serum en biedt een tijdlijn van infectie.

Zika Virus specifieke diagnostische Epitope ontdekking

Meer video's verkennen