Zika Virus specifieke diagnostische Epitope ontdekking

Het algemene doel van dit experiment is om Zika-virusspecifieke peptiden te identificeren voor gebruik in een diagnostisch onderzoek om Zika-virusantilichamen te detecteren. Dit is cruciaal, omdat het virus binnen ongeveer 10 dagen uit het bloed verdwijnt, terwijl antilichamen jarenlang aanwezig blijven. Deze methode stelt ons in staat om antigenen en epitopen te identificeren door gebruik te maken van een microarray van het volledige Zika-proteoom om peptiden te identificeren die IgM of IgG antilichamen in een serummonster van een geïnfecteerde persoon vastleggen.

Het belangrijkste voordeel van het detecteren van zowel vroege antilichamen, IgM, en latere antilichamen, IgG, is om de clinicus een tijdlijn van de infectie te geven. En dit is vooral belangrijk bij zwangere vrouwen. Hoewel dit protocol inzicht geeft in de oorzaak van de Zika-virusinfectie, kan het worden toegepast op andere pathogenen, met behulp van een microarray die specifiek is voor dat pathogeen als de eiwitsequentie bekend is.

Houd de glazen plaat vast aan de randen met poedervrije handschoenen. De afmetingen van de glazen plaat zijn 75,4 millimeter bij 25,0 millimeter en 1 millimeter dik. Plaats de plaat in de incubatielade met de microarrayoppervlak naar boven.

Vul de lege schuifhouders met lege schuiven om te voorkomen dat de microarrayplaat breekt. Plaats de glanzende kant van de afdichting met de afdichting naar beneden op het bedrukte oppervlak van de microarray. Om een goede positie te garanderen, overlappen de schroefgaten van de afdichting en de basisplaat elkaar.

Plaats het bovenste deel van de lade op de afdichting om een microarraykamer te creëren. Bevestig de plaat in de lade door de duimschroeven één voor één met de hand vast te draaien in een afwisselend patroon. Begin vanuit de bovenkant links en ga naar de onderkant rechts.

Plaats het deksel op de incubatielade. Zorgvuldig omgaan met de microarray is essentieel om krassen op het microarrayoppervlak te voorkomen. Oplossingen worden toegevoegd aan en vervolgens verwijderd uit de hoek van de microarraykamer.

Het drogen van de microarray is ook belangrijk om een goede scanafbeelding te krijgen. Incubeer de microarray met 2.000 microliter standaardbuffer per microarray gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur op een orbitale shaker bij 140 rpm. Verwijder de standaardbuffer door te aspireren met een pipet uit de hoek van de microarraykamer, blokkeer vervolgens de microarray met een blokkeringsbuffer gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur op een orbitale shaker bij 140 rpm.

Verwijder de blokkeringsbuffer door te aspireren uit de hoek van de microarraykamer met een pipet. Voeg anti-menselijke IgM fluorochroomgeconjugeerde secundaire antilichaam verdund 1:5.000 in de kleuringsbuffer toe aan de microarray. Incubeer vervolgens de microarray gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker op een orbitale shaker bij 140 rpm.

Gebruik een pipet om het secundaire antilichaam te verwijderen door te aspireren uit de hoek van de microarraykamer. Was de microarray gedurende één minuut met 2000 microliter met standaardbuffer per microarray bij kamertemperatuur op een orbitale shaker bij 140 rpm. Verwijder de standaardbuffer met behulp van de gedemonstreerde techniek en herhaal de wassing twee keer.

Dompel vervolgens de plaat twee keer in 200 milliliter van een vers bereide doopbuffer. Droog de microarray voorzichtig gedurende ongeveer een minuut door overtollig vocht heel voorzichtig van de bovenkant naar de onderkant van de plaat te aspireren zonder het plaatoppervlak aan te raken. Analyseer de plaat in een microarrayscannerlezer zoals later in deze video wordt gedemonstreerd.

Inactiveer het serummonster gedurende 30 minuten bij 56 graden Celsius. Centrifugeer vervolgens het monster gedurende vijf minuten bij 16.000 RCF bij vier graden Celsius. Bewaar het monster bij vier graden Celsius tot gebruik.

Incubeer vervolgens de microarray met de kleuringsbuffer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur op een orbitale shaker bij 140 rpm. Verwijder de kleuringsbuffer door te aspireren uit de hoek van de microarraykamer met een pipet. Verdun het serummonster en de kleuringsbuffer, beginnend met een 1:1.000 verdunning.

Incubeer het verdunde monster met de microarray een nacht bij vier graden Celsius op een orbitale shaker bij 140 rpm. Verwijder het verdunde serummonster met behulp van de gedemonstreerde techniek. Was vervolgens de microarray drie keer zoals eerder.

Verdun het secundaire antilichaam in de kleuringsbuffer. Gebruik anti-menselijke IgM fluorochroomgeconjugeerd antilichaam of anti-menselijke IgG fluorochroomgeconjugeerd antilichaam in een verdunning van 1:5.000 in kleuringsbuffer. Meng vervolgens het controle-gelabelde antilichaam in een verdunning van 1:1000 in kleuringsbuffer met het verdunde secundaire antilichaam.

Incubeer met de microarray gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker en op een orbitale shaker bij 140 rpm. Verwijder het mengsel van verdund secundair en gelabeld antilichaam door te aspireren uit de hoek van de microarraykamer met een pipet. Was vervolgens de microarray drie keer met standaardbuffer.

Elke wasbeurt duurt één minuut op een orbitale shaker bij 140 rpm. Verwijder ten slotte het wasbuffer uit de microarraykamer zoals eerder. Om microarray-scanning uit te voeren, dompel de plaat twee keer in 200 milliliter vers bereide doopbuffer.

Droog de microarray gedurende ongeveer een minuut door heel voorzichtig van de bovenkant naar de onderkant van de plaat te aspireren zonder het plaatoppervlak aan te raken. Scan de microarray volgens de instructies van de scanner. Plaats de plaat op de scanner met de bedrukte kant naar boven.

Maak een nieuw project aan en selecteer het scangebied. Stel de scannerparameters in met een resolutie van 21 micron, een intensiteit van 7,0 voor zowel de 700 als 800 nanometer kanalen, een scankwaliteit van gemiddeld en een offset van 0,8. Verkrijg en sla het scantekenbeeld op als een 16-bits grijswaarden TIF-bestandsformaat.

Om de gegevens te analyseren, opent u de ruwe afbeelding. Open vervolgens het arrayrasterbestand. Lijn het arrayraster uit met het scanbeeld met de muis of pijltjestoetsen van de computer.