Name: Een nieuwe Feeder-vrij systeem voor massaproductie van lymfkliertest Natural Killer cellen In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Leer een nieuw feeder-vrij systeem voor massaproductie van hoogzuivere natuurlijke killercellen uit muizenbeenmerg. Deze methode verbetert de zuiverheid aanzienlijk voor onderzoek naar aangeboren immuniteit en kankerimmuniteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door de Research Grants Raad van Hong Kong (GRF 468513, CUHK3/CRF/12R) en de innovatie en technologie Fonds van Hong Kong (ITS/227/15, ITS InP/164/16, ITS-InP/242/16), directe subsidie voor onderzoek-CUHK (2016.035) en Hong Kong geleerde Programma.
H.-Y.L. ontworpen en begeleid alle experimenten en bijgedragen tot de voorbereiding van de manuscript. P.M.-R.C. experimenten uitgevoerd, geanalyseerd gegevens en bijgedragen tot de voorbereiding van de manuscript. P.C.-T. T., J.Y.-FC, J.S.-C., H., Q.-M.W., en G.-Y.L. verzamelde dierlijke monsters en deelgenomen aan dierproeven. J.S., X.-R.H., en K.-F.T. bijgedragen tot de voorbereiding van de manuscript.

Het protocol is voor het verkrijgen en differentiatie van de NK beenmerg-afgeleide cellen (BM-NK) gebaseerd op eerder gepubliceerde methoden20,21,22. Alle procedures met muizen zijn goedgekeurd door het dier Experimental ethische Commissie (AEEC) aan de Chinese Universiteit van Hongkong.
1. bereiding van OP9 voorwaardelijke Medium
<ol><li>Cultuur van de lymfkliertest stroma cellijn OP9 in alpha-MEM met 20% FBS, 100 U/mL penicilline G en 100 µg/mL streptomycine, bij 37 ° C in een bevochtigde sfeer van lucht/CO2 (95%: 5%).<ol>
<li>De cellen met een hemocytometer, dan zaad 2 x 106 OP9 cellen aan elke maatkolf van 75 cm2 cultuur met 15 mL medium tellen. Cultuur gedurende 48 uur.</li>
		<li>Wanneer de cultuur 80% samenvloeiing bereikt, wassen van de kolf met 10 mL PBS en Voeg 20 mL van gewone alpha-MEM-medium (zonder FBS en antibiotica) per fles.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Het OP9 voorwaarde medium ophalen in de erlenmeyer van de cultuur op 24 h, cel puin ruimen met 0,25 µm polyethersulfon (PES) filter en bewaren bij 4 ° C (gebruik binnen 2 weken).</li>
</ol>2. isolatie van beenmergcellen van de muis
<ol><li>Een 12-week-oude C57BL/6J muis met een overdosis van de pentobarbitone (100 mg/kg, intraperitoneale injectie) euthanaseren. Bevestigen van dood door het ontbreken van ademhaling, dan oogst de botten van het dijbeen met een chirurgisch mes snijden bij de kruisingen tussen botten en verwijder de resterende spieren met het mes door het zachte krabben.</li>
	<li>Plaats de botten in een 50 mL centrifugebuis met gekoeld steriel alpha-MEM en voer de volgende stappen uit in een kabinet bioveiligheid.</li>
	<li>Het alpha-MEM-medium verwijderen en spoel de botten met 70% ethanol voor 30 s.</li>
	<li>Wassen van de botten met ijskoude steriel PBS tweemaal aan het opruimen van de resterende ethanol.</li>
	<li>Breng de botten in een mortier met 5 mL ijskoud PBS, en zachtjes fragmentize de botten met een stamper (doen niet verpulveren ze).</li>
	<li>De botten zachtjes doorroeren door zwenken van de stamper om de beenmergcellen in de PBS vrij te geven. De PBS met beenmergcellen in een nieuwe 50 mL centrifugebuis verzamelen.</li>
	<li>Herhaal stap 2.6 voor vier keer totdat de botfragmenten effen wit van kleur geworden.</li>
	<li>Centrifugeer de buis bij 465 x g gedurende 5 min bij 4 ° C, en vervolgens de vloeistof wordt weggeworpen.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet met 18 mL steriel gedistilleerd water en laat het staan voor 30 s tot het verwijderen van rode bloedcellen.</li>
	<li>Voeg toe 2 mL ijskoud 10 X PBS om te stoppen met de reactie, filtert vervolgens het mengsel door een zeef cel 70 µm te verwijderen van de lysed rode bloedcellen.</li>
	<li>Centrifugeer de buis bij 465 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Resuspendeer de pellet met 20 mL ijskoud PBS.</li>
	<li>De cellen door stap te herhalen 2.11 een tweede keer wassen.</li>
	<li>Breng de pellet cel in een 100-mm steriele petrischaal met 10 mL van de voorwaardelijke medium OP9 uit stap 1.2 aangevuld met 20% FBS en een mengsel van 0,5 ng/mL lymfkliertest IL-7, 30 ng/mL muis SCF en 100 U/mL lymfkliertest flt3L.</li>
	<li>Incubeer de schotel bij 37 ° C met 5% CO2 voor 2 h. overdracht de niet-vastgemaakte cellen in een nieuwe verpakking van de cultuur bij een dichtheid van 5 x 105 levensvatbare cellen/mL (aantal cellen door hemocytometer met trypan-blauw-uitsluiting) met dezelfde middellange formule als in stap 2.13 , en Incubeer bij 37 ° C met 5% CO2.</li>
	<li>Op dag 4, wijzigen de toestand van de cultuur op OP9 voorwaardelijke normaal aangevuld met 20% FBS en 2.000 U/mL lymfkliertest IL-2.</li>
	<li>Vernieuwen van het kweekmedium elke 3 dagen; volwassen NK-cellen kunnen worden verkregen door dag 7 en gekwalificeerd als in punt 4.</li>
</ol>3. siRNA-gemedieerde Gene Silencing van NK-cellen differentiëren
<ol><li>Meng het siRNA of onzin besturingselement (NC) met een agent van de transfectie volgens de producthandleiding.</li>
	<li>Voer stap 3.1 op elk punt van de tijd sinds dag 0.</li>
	<li>Toevoegen van de 50 nM van siRNA of NC mengsel aan de cellen van stap 2.14.</li>
	<li>Herhaal stap 3.1 op elke middelgrote verfrissing (bijvoorbeelddag 0, 4 en 7) tot de experimentele eindpunt.</li>
</ol>4. analyse van NK celdifferentiatie gebruikt Stroom Cytometry
<ol><li>Op een passend tijdstip, de opschorting van de differentiatie van cellen verzamelen en wassen met ijskoude PBS.</li>
	<li>Het herstellen van de cellen met de fixatie van de cel buffer volgens de producthandleiding.</li>
	<li>Wassen van de vaste cellen met ijskoude PBS en vervolgens resuspendeer 1 x 106 cellen in 100 µL van Stroom Cytometry kleuring Buffer met Cy3-geconjugeerde anti-muis NKp46 en PE-geconjugeerde anti-muis CD244 antilichamen in een verdunningsverhouding van 1:100.</li>
	<li>Vlek het monster in het donker bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.</li>
	<li>Resuspendeer de gebeitst monsters met 300 µL van PBS, dan FACS gegevens verwerven en analyseren met Cytobank platform20 (http://cytobank.org/).</li>
</ol>

<ol><li>Schreiber, R. D., Old, L. J., Smyth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+immunoediting%3A+integrating+immunity%27s+roles+in+cancer+suppression+and+promotion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer immunoediting: integrating immunity's roles in cancer suppression and promotion.</a> Science. 331 (6024), 1565-1570 (2011).</li>
<li>Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+tumour+micro-environment+heterogeneity+on+therapeutic+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response.</a> Nature. 501 (7467), 346-354 (2013).</li>
<li>Rusakiewicz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+infiltrates+are+prognostic+factors+in+localized+gastrointestinal+stromal+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Immune infiltrates are prognostic factors in localized gastrointestinal stromal tumors.</a> Cancer Res. 73 (12), 3499-3510 (2013).</li>
<li>Mamessier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+breast+cancer+cells+enhance+self+tolerance+by+promoting+evasion+from+NK+cell+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Human breast cancer cells enhance self tolerance by promoting evasion from NK cell antitumor immunity.</a> J Clin Invest. 121 (9), 3609-3622 (2011).</li>
<li>Stern, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-emptive+immunotherapy+with+purified+natural+killer+cells+after+haploidentical+SCT%3A+a+prospective+phase+II+study+in+two+centers%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Pre-emptive immunotherapy with purified natural killer cells after haploidentical SCT: a prospective phase II study in two centers.</a> Bone Marrow Transplant. 48 (3), 433-438 (2013).</li>
<li>Miller, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+adoptive+transfer+and+in+vivo+expansion+of+human+haploidentical+NK+cells+in+patients+with+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Successful adoptive transfer and in vivo expansion of human haploidentical NK cells in patients with cancer.</a> Blood. 105 (8), 3051-3057 (2005).</li>
<li>Rubnitz, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKAML%3A+a+pilot+study+to+determine+the+safety+and+feasibility+of+haploidentical+natural+killer+cell+transplantation+in+childhood+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">NKAML: a pilot study to determine the safety and feasibility of haploidentical natural killer cell transplantation in childhood acute myeloid leukemia.</a> J Clin Oncol. 28 (6), 955-959 (2010).</li>
<li>Curti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+transfer+of+alloreactive+haploidentical+KIR+ligand-mismatched+natural+killer+cells+after+infusion+in+elderly+high+risk+acute+myeloid+leukemia+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Successful transfer of alloreactive haploidentical KIR ligand-mismatched natural killer cells after infusion in elderly high risk acute myeloid leukemia patients.</a> Blood. 118 (12), 3273-3279 (2011).</li>
<li>Bachanova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+acute+myeloid+leukemia+by+haploidentical+natural+killer+cells+is+improved+using+IL-2+diphtheria+toxin+fusion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Clearance of acute myeloid leukemia by haploidentical natural killer cells is improved using IL-2 diphtheria toxin fusion protein.</a> Blood. 123 (25), 3855-3863 (2014).</li>
<li>Stringaris, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemia-induced+phenotypic+and+functional+defects+in+natural+killer+cells+predict+failure+to+achieve+remission+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Leukemia-induced phenotypic and functional defects in natural killer cells predict failure to achieve remission in acute myeloid leukemia.</a> Haematologica. 99 (5), 836-847 (2014).</li>
<li>Rouce, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TGF-%CE%B2%2FSMAD+pathway+is+an+important+mechanism+for+NK+cell+immune+evasion+in+childhood+B-acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">The TGF-β/SMAD pathway is an important mechanism for NK cell immune evasion in childhood B-acute lymphoblastic leukemia.</a> Leukemia. 30 (4), 800-811 (2016).</li>
<li>Derynck, R., Akhurst, R. J., Balmain, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+signaling+in+tumor+suppression+and+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genet%22%5BJournal%5D)">TGF-β signaling in tumor suppression and cancer progression.</a> Nature Genet. 29 (2), 117-129 (2001).</li>
<li>Massague, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18662538">TGFbeta in cancer.</a> Cell. 134 (2), 215-230 (2008).</li>
<li>Ikushima, H., Miyazono, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFbeta+signalling%3A+a+complex+web+in+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">TGFbeta signalling: a complex web in cancer progression.</a> Nat Rev Cancer. 10 (6), 415-424 (2010).</li>
<li>Pickup, M., Novitskiy, S., Moses, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+TGF%CE%B2+in+the+tumour+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">The roles of TGFβ in the tumour microenvironment.</a> Nat Rev Cancer. 13 (11), 788-799 (2013).</li>
<li>Rook, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+transforming+growth+factor+beta+on+the+functions+of+natural+killer+cells%3A+depressed+cytolytic+activity+and+blunting+of+interferon+responsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Effects of transforming growth factor beta on the functions of natural killer cells: depressed cytolytic activity and blunting of interferon responsiveness.</a> J Immunol. 136 (10), 3916-3920 (1986).</li>
<li>Bellone, G., Aste-Amezaga, M., Trinchieri, G., Rodeck, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+NK+cell+functions+by+TGF-beta+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of NK cell functions by TGF-beta 1.</a> J Immunol. 155 (3), 1066-1073 (1995).</li>
<li>Trotta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+utilizes+SMAD3+to+inhibit+CD16-mediated+IFN-%CE%B3+production+and+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity+in+human+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">TGF-β utilizes SMAD3 to inhibit CD16-mediated IFN-γ production and antibody-dependent cellular cytotoxicity in human NK cells.</a> J Immunol. 181 (6), 3784-3792 (2008).</li>
<li>Shull, M. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1436033">Targeted disruption of the mouse transforming growth factor-β1 gene results in multifocal inflammatory disease.</a> Nature. 359 (6397), 693-699 (1992).</li>
<li>Chen, T. J., Kotecha, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytobank%3A+providing+an+analytics+platform+for+community+cytometry+data+analysis+and+collaboration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Microbiol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cytobank: providing an analytics platform for community cytometry data analysis and collaboration.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 377, 127-157 (2014).</li>
<li>Williams, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+NK1.1%2B%2C+Ly49%2B+NK+cells+from+flt3%2B+multipotent+marrow+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of NK1.1+, Ly49+ NK cells from flt3+ multipotent marrow progenitor cells.</a> J Immunol. 163 (5), 2648-2656 (1999).</li>
<li>Fathman, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+earliest+natural+killer+cell-committed+progenitor+in+murine+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Identification of the earliest natural killer cell-committed progenitor in murine bone marrow.</a> Blood. 118 (20), 5439-5447 (2011).</li>
<li>Tang, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smad3+promotes+cancer+progression+by+inhibiting+E4BP4-mediated+NK+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Smad3 promotes cancer progression by inhibiting E4BP4-mediated NK cell development.</a> Nat Commun. 6 (8), 14677(2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In het huidige werk, hebben we een nieuwe methode voor de productie van beenmerg-afgeleide lymfkliertest NK cellen in vitrobeschreven. De cel feeder in de oorspronkelijke systeem21,22 is met succes vervangen door de voorwaardelijke medium OP9 cellen, die grotendeels de stabiliteit van het systeem van differentiatie vergroot. Bovendien, het systeem kan produceren hoge hoeveelheid en zuiverheid van volwassen NK cellen voor in vitro als in vivo...

Progressie van kanker is grotendeels afhankelijk van de tumor communicatie1,2, met inbegrip van gastheer afkomstige immunocytes, bijvoorbeeld, NK-cellen. Verschillende studies aangetoond dat intratumoral NK-cellen zijn negatief gecorreleerd met tumor progressie3,4. Bovendien, klinische studies is gebleken dat adoptief celtherapie NK een mogelijke strategie voor kanker5,6,7,8,9. NK cel-gebaseerde kanker immunotherapie onlangs voorgesteld als een therapeutische optie voor solide tumoren, maar uitdagingen bestaan als gevolg van de afscheiding van immunosuppressieve cytokinen en Downregulatie van liganden in de communicatie van stevige tumors activeren 10,11. Transformeren groeifactor-β (TGF-β) is gesuggereerd een onderdrukkende rol te spelen in carcinogenese, maar paradoxaal genoeg kankercellen produceren ook TGF-β1 ter ondersteuning van de tumor ontwikkeling12,13,14 , 15. de cytolytische activiteit van NK cellen via de down-regulering interferon responsiviteit en CD16-gemedieerde interferon-gamma (IFN-γ) productie in vitro16,17, TGF-β signalering kunt onderdrukken 18.
Hoewel verstoring van TGF-β signalering in de communicatie van de tumor kan een mogelijke manier voor het elimineren van kankers, volledig blokkeren TGF-β signalering zal leiden tot auto-immune ziekten als gevolg van zijn anti-inflammatoire functie, zoals blijkt uit de ontwikkeling van negatieve bijwerkingen, met inbegrip van systemische ontstekingen, modellen cardiovasculaire afwijkingen en autoimmuniteit in muis19. Dus, inzicht in het werkingsmechanisme bij immuunsuppressie TGF-β-gemedieerde zal leiden tot de identificatie van een toegankelijk therapeutisch doel voor de behandeling van kanker.
Om het ophelderen van de moleculaire gebeurtenissen die nodig zijn voor cel ontwikkeling van NK, gevestigde Williams et al. een in vitro -systeem voor20differentiëren lymfkliertest beenmerg hematopoietische stamcellen in NK cellen. Dit systeem vergemakkelijkt grotendeels het mechanistisch onderzoek naar NK-cel ontwikkeling, met inbegrip van de identificatie van nieuwe progenitorcellen van NK cellen21. Echter het beenmerg progenitoren moeten worden gekweekt in het systeem met ondersteunende OP9 stromale cellen als een feeder laag20,21, en deze heterogene celpopulatie grotendeels beperkt de verdere toepassing van gene disrupting tools (bijvoorbeeld, siRNA-gemedieerde gene silencing) specifiek toegepast op de onderscheidende NK-cellen.
Hier beschrijven we een feeder-vrij systeem dat is ontwikkeld door verdere aanpassing van de in vitro -systeem van Williams et al.20. In ons systeem, de OP9 feeder stromale cellen zijn niet vereist, en in plaats daarvan OP9 voorwaardelijke voedingsbodem wordt gebruikt zonder de differentiatie van NK cellen in vitroen dit onlangs leiden ons om te ontdekken welk TGF-β vermag bevordering van progressie van kanker via E4bp4-afhankelijke NK cel ontwikkeling in de tumor communicatie22te onderdrukken. Dit nieuwe systeem biedt met succes een achtergrond-gratis methode voor het ophelderen van het moleculaire mechanisme van NK-cel ontwikkeling onder bepaalde voorwaarden (bijvoorbeeldhoge TGF-β1, siRNA-gemedieerde gene silencing, enz.) in vitro.

<table><tbody><tr><td>OP9 cell line</td><td>ATCC</td><td>ATCC&reg; CRL-2749&trade;</td><td></td></tr><tr><td>MEM &alpha;, no nucleosides</td><td>Gibco</td><td>22561021</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Murine IL-7</td><td>PEPROTECH</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Murine SCF</td><td>PEPROTECH</td><td>250-03</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Murine Flt3-Ligand</td><td>PEPROTECH</td><td>250-31L</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Murine IL-2</td><td>PEPROTECH</td><td>212-12</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>1377815</td><td></td></tr><tr><td>IC Fixation Buffer&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>00-8222-49</td><td></td></tr><tr><td>Flow Cytometry Staining Buffer&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>00-4222-26</td><td></td></tr><tr><td>PE-conjugated anti-mouse CD244</td><td>eBioscience</td><td>12-2441-83</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-conjugated anti-mouse NKp46</td><td>Bioss</td><td>bs-2417R-cy3</td><td></td></tr><tr><td>Nonsense control (NC)</td><td>Ribobio</td><td>siN05815122147</td><td></td></tr><tr><td>siRNA against mouse E4BP4 mRNA</td><td>Ribobio</td><td>N/A</td><td>5&prime;-GAUGAGGGUGUA GUGGGCAAGUCUU-3&prime;</td></tr></tbody></table>

een nieuwe feeder-vrij systeem voor massaproductie van lymfkliertest natural killer cellen in vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cellen behoren tot het aangeboren immuunsysteem en een eerstelijns anti-kanker immuunsysteem verdediging; echter, zij worden onderdrukt in de communicatie van de tumor en het onderliggende mechanisme is nog grotendeels onbekend. De voortgang van het onderzoek van NK-cel-immuniteit wordt beperkt door het ontbreken van een consistente en betrouwbare bron van NK-cellen. Wij rapporteren hier een in vitro -systeem dat hoge kwaliteit en kwantiteit van beenmerg-afgeleide lymfkliertest NK cellen onder een feeder-free-conditie bieden kan. Wat nog belangrijker is, wij ook laten zien dat met succes de rijping van de cel E4bp4-afhankelijke NK siRNA-gemedieerde gene silencing remt met behulp van dit systeem. Deze roman in vitro NK cel differentiatie systeem is dus een biomaterial oplossing voor onderzoek van de immuniteit.

Representatieve resultaten worden verkregen volgens de beschreven protocol. Totale opschorting beenmergcellen werden gekweekt onder de feeder-vrije differentiatie systeem voor 11 dagen; aanzienlijke toename van de proliferatie tarief werd waargenomen door dag 7 vergeleken met het aantal totaal aantal cellen op dag 0(Figuur 1). Volwassen NK-cellen met hoge nucleaire aan cytoplasmatische ratio en morfologie van de submodule-rijke cytoplasma wer...

Hier presenteren we een protocol om de massa van gen-zwijgen lymfkliertest NK cellen met behulp van een systeem van differentiatie feeder-gratis voor mechanistisch onderzoek in vitro en in vivo.

Een nieuwe Feeder-vrij systeem voor massaproductie van lymfkliertest Natural Killer cellen In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Het algemene doel van dit nieuwe feeder-vrije systeem is om een methode te bieden om hoogzuivere natuurlijke killercellen massaal te produceren voor in vitro en in vivo assays. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van de belangrijkste vragen in de aangeboren immunologie, inclusief de ontwikkeling van natuurlijke killercellen en kankerimmuniteit. Het grote voordeel van deze techniek is dat dit nieuwe feeder-vrije systeem de zuiverheid van de geproduceerde natuurlijke killercellen aanzienlijk kan verhogen.Dit vergemakkelijkt aanzienlijk de volgende assays in vitro en in vivo. De indicatie van deze techniek strekt zich uit tot de natuurlijke killerimmuniteit omdat massaproductie van muis natuurlijke killercellen kan worden geproduceerd uit het beenmerg van kankerpatiënten voor analyse en modificatie voor persoonlijke immunotherapie. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in deze methode worstelen omdat het geconsumeerde medium moet worden verzameld van de OP9-cel tijdens de laadfase van groei.Facial demonstratie van deze methode is cruciaal omdat de beenmerg instructiestappen moeilijk te leren zijn, omdat de botten steriel moeten zijn met ethanol met een optimale tij

a-novel-feeder-free-system-for-mass-production-murine-natural-killer

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Hier beschrijven we een methode om efficiënt uit te breiden en te zuiveren van grote aantallen menselijke NK-cellen en beoordelen hun functie.

Uitbreiding, zuivering, en functionele beoordeling van de humane perifere bloed NK-cellen

This video demonstrates a technique for the expansion of natural killer (NK) cells directly from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a feeder cell line. PBMCs are co-cultured with genetically modified lymphoblastoid feeder cells expressing membrane-bound interleukin-21 (mIL-21), and the culture is supplemented with the cytokines interleukin-2 (IL-2) and interleukin-15 (IL-15). Together, this cocktail of ligands leads to the prolonged expansion of NK cells with high purity.

Ex Vivo Expansion of Natural Killer Cells from Peripheral Blood Mononuclear Cells

Dit protocol beschrijft de ontwikkeling, groei en in vivo beeldvorming van NK cellen uit hESCs en iPSCs.

Ontwikkeling, uitbreiding en<em&gt; In vivo</em&gt; Controle van Human NK cellen uit menselijke embryonale stamcellen (hESC &#39;s) en en geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs)

In deze studie presenteren we een in vitro kweeksysteem dat efficiënt pDC's kan genereren door co-cultiveren van gemeenschappelijke lymfoïde progenitorcellen met AC-6 feedercellen in aanwezigheid van Flt3-ligand.

In vitro generatie van Muriene plasmacytoïde dendritische cellen van Common Lymfoïde Progenitors met behulp van de AC-6 Feeder System

Hier presenteren we een aangepast protocol dat kan worden gebruikt om een groot aantal muisinvariante natuurlijke killer-T-cellen uit de muizenmilt te genereren. Het protocol schetst een benadering waarmee splenkachtige iNKT-cellen kunnen worden verrijkt, geïsoleerd en in vitro uitgebreid met behulp van een beperkt aantal dieren en reagentia.

Een geoptimaliseerde werkwijze voor het isoleren en Expanding Invariant Natural Killer T-cellen van Mouse Spleen

We beschrijven een snel en robuust protocol om invariante natural killer T (iNKT) cellen uit muizen milt te verrijken en in vitro uit te breiden tot geschikte aantallen voor in vitro en in vivo studies.

Zuivering en uitbreiding van muisinvariante Natural Killer T-cellen voor in vitro en in vivo studies

Hier presenteren we een methode om perifere bloed natural killer (PBNK), NK-cellen uit leverweefsels en chimere antigeenreceptor (CAR) -NK-cellen afgeleid van perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC's) of navelstrengbloed (CB) uit te breiden. Dit protocol demonstreert de uitbreiding van NK- en CAR-NK-cellen met behulp van 221-mIL-21-feedercellen naast de geoptimaliseerde zuiverheid van geëxpandeerde NK-cellen.

Natural Killer (NK) en CAR-NK-celuitbreidingsmethode met behulp van membraangebonden-IL-21-gemodificeerde B-cellijn

Het huidige protocol laat zien hoe CD3−/CD45+CD56+ cellen met milde cytotoxiciteit kunnen worden onderscheiden van humane expanded potential stamcellen (hEPSC's) onder zowel 3D- als 2D-kweekomstandigheden. Dit maakt routinematige fenotypische validatie mogelijk zonder de vernietiging van de complexe micro-omgeving.

Generatie van Natural Killer Cellen uit Human Expanded Potential Stamcellen

Van natuurlijke killercellen afgeleide extracellulaire blaasjes (NK-EV's) hebben een veelbelovend potentieel als biotherapeutica tegen kanker. Deze op methodologie gebaseerde studie presenteert een schaalbare closed-loop bioproductieworkflow die is ontworpen om continu grote hoeveelheden zeer zuivere NK-EV's te produceren en te isoleren. Tijdens het proces worden controletests uitgevoerd tijdens de bioproductieworkflow, zodat de EV's voldoen aan de kwaliteitsnormen voor productvrijgave.

Schaalbare bioproductieworkflow voor het produceren en isoleren van Natural Killer-cellen afgeleide extracellulaire kankerbiotherapeutica op basis van vesikels

Dit protocol beschrijft een schaalbare methode voor de uitbreiding van Adoptive Cell Therapies (ACT)-producten, namelijk Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T-cellen en Cytokine-Induced Killer (CIK)-cellen, met behulp van gaspermeable Rapid expansion (G-Rex) apparaten, waarmee efficiënte en robuuste groei wordt aangetoond in een klinisch relevante omgeving.

Efficiënte en snelle generatie van CAR-T en cytokine-geïnduceerde killercellen in GMP-schaalbare apparaten

Leer een nieuw feeder-vrij systeem voor massaproductie van hoogzuivere natuurlijke killercellen uit muizenbeenmerg. Deze methode verbetert de zuiverheid aanzienlijk voor onderzoek naar aangeboren immuniteit en kankerimmuniteit.

Een nieuwe Feeder-vrij systeem voor massaproductie van lymfkliertest Natural Killer cellen In Vitro

Meer video's verkennen