Name: De muis Hindbrain als een Model voor het bestuderen van embryonale neurogenese (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-29T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Leer embryonale neurogenese bestuderen in het muizenhindbrain met behulp van gehele orgaan- en histologische analyse. Deze methode helpt onderzoekers neuronale ontwikkeling in vivo te onderzoeken.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Vasiliki Chantzara voor de uitvoering van getimede verparingen en het personeel van de biologische Resource-eenheid op de UCL Institute van oftalmologie voor muis veehouderij. Deze studie werd ondersteund door een Wellcome Trust Investigator Award 095623/Z/11/Z CR.

Alle dierlijke werk werd uitgevoerd overeenkomstig UK Home Office en lokale ethische richtsnoeren.
1. Samenvatting van de stappen en Timing
<ol><li>Getimede verparingen van volwassen muizen uitvoeren vanaf een stam geschikt de biologische vraag onderzochte verkrijgen van embryonale dag (e) 9.5-e13.5 zwangerschappen; vereist 12-15 dagen.</li>
	<li>Optioneel, bereiden 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) / 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) oplossing en het uitvoeren van injectie (Protocol sectie 2); vereist ~ 1 uur op de dag vóór of op de dag van embryo isolatie, afhankelijk van de gewenste lengte van EdU/BrdU labeling.</li>
	<li>Uitvoeren van embryo isolatie en hindbrain dissectie (punt 3 van het Protocol); vereist ~ 10 min/embryo.</li>
	<li>Uitvoeren van wholemount immunofluorescentie labeling (Protocol sectie 4); vereist 3 dagen.</li>
	<li>Sectie met behulp van een vibratome en het uitvoeren van zwevende sectie immunofluorescentie labeling (Protocol sectie 4): 2 dagen vereist.</li>
	<li>Sectie met behulp van een cryostaat en het uitvoeren van immunofluorescentie labeling van cryosecties (Protocol sectie 5); vereist 2 dagen.</li>
</ol>2. Injecteer zwangere vrouwelijke muis met BrdU of EdU (optioneel)
<ol><li>Ontbinden BrdU of EdU in steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) aan concentraties van 10 mg/mL en 1 mg/mL, respectievelijk. Let op: BrdU en EdU zijn giftig; Draag passende bescherming.</li>
	<li>Weeg de zwangere muis en berekenen van het volume van BrdU of EdU oplossing die moet worden beheerd om te bereiken van 100 mg/kg BrdU of 5 mg/kg EdU.</li>
	<li>Injecteren BrdU of EdU oplossing via het intraperitoneaal route beide 1 h of 1 dag vóór het verzamelen van de embryo's, afhankelijk van de gewenste lengte van labeling. Opmerking: Labeling voor 1 h visualiseert hindbrain cellen in de S-fase. Labeling voor 1 dag visualiseert het nakroost van hindbrain NPC's.</li>
</ol>3. dissectie van Hindbrains van e9.5 - e13.5 muis embryo 's
<ol><li>Euthanaseren een getimede-zwangere vrouwelijke muis met behulp van een ethisch goedgekeurde procedure stadium de vereiste zwangerschapsduur (b.v., cervicale dislocatie). Met behulp van scherpe schaar, de peritoneale holte opengesneden en zorgvuldig accijnzen van de baarmoeder. Plaats van de verwijderde baarmoeder met embryo's in een 60 mm kunststof schotel met 20 mL ijskoud PBS. Opmerking: Aseptische techniek is niet vereist.</li>
	<li>Het uitvoeren van alle verdere dissectie met behulp van een Microscoop ontleden. Met behulp van horlogemaker pincet nummer 5, scheurt de wand van de baarmoeder spier gebruikt om te bloot van de embryo's, elk embryo door doorsnijden omvat de navelstreng en het verwijderen van de dooierzak.</li>
	<li>Met behulp van een steriele Pipet van Pasteur met een wide-boring openen, breng elk embryo in een schone kunststof schotel met ijskoude PBS.</li>
	<li>Met behulp van horlogemaker pincet nummer 55, verbreken het hoofd (figuur 1E).</li>
	<li>U kunt desgewenst behouden een klein stukje weefsel (bijvoorbeeld¼ van een dooierzak of ongeveer 2 mm staart tip) voor genomic DNA isolatie en latere genotypering.</li>
	<li>Met behulp van horlogemaker pincet nummer 55, accijnzen het weefsel met de hindbrain parallel aan en onmiddellijk onder de neuroepithelium van de hindbrain te scheiden van gezichts- en reukkolf weefsel (figuur 1F).</li>
	<li>Positie van de hindbrain en caudal hoofd weefsel dorsale zijde omhoog en de 4th ventrikel, die is bedekt met een laag van dunne weefsel (plaat dak) te identificeren. Zorgvuldig doorboren de dak plaat met behulp van horlogemaker pincet nummer 55 (figuur 1G) en schil weg overtollige weefsel met een tang, verhuizen rostrally langs de middellijn over het veroorzaakt, en dan caudally over de achterste hindbrain en ruggenmerg (figuur 1G ); de hindbrain moet nu worden blootgesteld in een open boek voorbereiding (Figuur 1 H).</li>
	<li>Hindbrains voorbereiden door wholemount immunolabeling (optie 1).<ol>
<li>Met behulp van horlogemaker pincet nummer 55, zorgvuldig tease weg resterende hoofd mesenchym en eventuele hersenvliezen gekoppeld aan de pial kant van de hindbrain met behulp van Tang (figuur 1I). Verwijder de veroorzaakt en ruggenmerg weefsel (figuur 1J) te laten alleen het hindbrain weefsel (Figuur 1 K). Opmerking: Deze stap van de procedure dient niet te worden gevolgd op e9.5 of e10.5, omdat het probeert om dit te doen zou waarschijnlijk beschadigen de hindbrain neuroepithelium; Bovendien, verwijderen de hersenvliezen is niet essentieel omdat de hindbrain neuroepithelium voldoende dun in dit stadium is dat efficiënte penetratie van antilichamen voor immunolabeling. Deze stap moet, echter, worden gevolgd van e11.5, wanneer het meningeal weefsel consolideert, ter verbetering van antilichaam penetratie in de hindbrain neuroepithelium. Dissectie is het makkelijkst wanneer uitgevoerd in ijskoude PBS (gebruik schone PBS voor elke hindbrain).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hindbrains voorbereiden op vibratome en cryosectioning (optie 2)<ol>
<li>Met behulp van horlogemaker pincet nummer 55, verwijder de veroorzaakt en ruggenmerg weefsel (figuur 1J). Opmerking: Het is niet nodig om mesenchym en hersenvliezen van hindbrains die bestemd zijn voor het segmenteren (zoals weergegeven in figuur 1I) te verwijderen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hindbrains van de kunststof schotel overbrengen met ronde bodem van 2 mL tubes met behulp van een pipet van Pasteur, gecombineerd alle PBS en positiebepaling voor 2 uur bij 4° C met zacht-agitatie in vers ontdooid 4% w/v formaldehyde opgelost in PBS. Let op: Formaldehyde is giftig; Draag passende bescherming.</li>
	<li>Spoel hindbrains 3 x keer met PBS. Bewaren bij 4 ° C in PBS als immunolabeling zal binnen 2-3 dagen beginnen of vervang PBS met 50% methanol/50% PBS voor 5 min voordat de overdracht naar 100% methanol voor langere opslag bij-20° C.
</li>
</ol>4. Wholemount immunofluorescentie
<ol><li>Indien nodig, hindbrains in aflopende serieel verdunningen van methanol in PBS (b.v.75% methanol, 50% methanol, 25% methanol) bij kamertemperatuur (RT) voor elke 5 minuten hydrateren en vervolgens overbrengen naar PBS. Opmerking: Een gesorteerde reeks van methanol is vereist voor zachtjes hindbrains hydrateren en conservering van het juiste weefsel.</li>
	<li>Permeabilize van hindbrains gedurende 30 minuten bij 4 ° C in PBS met 0,1% Triton X-100 (PBT) met zachte agitatie.</li>
	<li>Incubeer gedurende 1 uur bij 4 ° C in PBT met 10% serum van de warmte-geïnactiveerd geit met zachte agitatie hindbrains. Opmerking: Gebruik een serum van de host-soorten die de secundaire antilichamen zijn gerezen in. Voor primaire antilichamen opgegroeid in geit, incubeer in serumvrij eiwit blokkeren, bijvoorbeeld 5% bovien serumalbumine in PBS of een geschikt alternatief voor commerciële (Zie Tabel van materialen). Dit zal niet-specifieke kleuring vaak waargenomen bij het gebruik van primaire antilichamen opgegroeid in geit.</li>
	<li>Incubeer hindbrains's nachts bij 4 ° C in PBT met 1% warmte-geïnactiveerd serum en primaire antilichamen met zachte agitatie (bijv., konijn anti-phospho Histon H3 [pHH3] verdund 1:400). Opmerking: Gebruik voor primaire antilichamen opgegroeid in geit, PBT zonder serum.</li>
	<li>Wassen van de hindbrains bij 4 ° C 5 x met PBT voor elk 1U.</li>
	<li>Incubeer hindbrains's nachts bij 4 ° C in PBT met passende fluorophore-geconjugeerde secundaire antilichamen (bv, geit anti-konijn Alexa Fluor 488) op 1:200 in PBT gericht tegen de primaire antilichamen gebruikt. Houd hindbrains in het donker hiervandaan op fluorophores beschermen photobleaching. Opmerking: Gebruik voor primaire antilichamen opgegroeid in geit, anti-geit Fab fragmenten van secundaire antilichamen om niet-specifieke kleuring.</li>
	<li>Wassen van de hindbrains bij 4 ° C 5 x met PBT voor elk 1U.</li>
	<li>De hindbrains in 4% formaldehyde in PBS voor 15 min. op RT voor de langetermijnbewaring van antilichaam-bindende postfix. Kort spoelen tweemaal in PBS.</li>
	<li>Dekking van een glasplaatje Microscoop met twee lagen van zwarte isolatietape en accijnzen van een vierkantje van de gelaagde tape naar het maken van een zak groot genoeg is om te houden van één hindbrain.</li>
	<li>Pipetteer van elke hindbrain in een zakje met een pipet van Pasteur, verwijderen van de overtollige vloeistof en voeg een geschikt antifade reagens aan de zak voordat het langzaam bedekken met een dekglaasje glas aan om te voorkomen dat overlapping luchtbellen onder het dekglaasje aan. Zegel van het dekglaasje aan en brengt deze naar de dia met een dun laagje nagellak. Bewaren dia bij 4 ° C in het donker tot Beeldacquisitie (Protocol sectie 7).</li>
</ol>5. de Vibratome segmenteren en drijvende sectie immunofluorescentie
<ol><li>Indien nodig, hydrateren hindbrains van methanol, zoals beschreven in stap 4.1.</li>
	<li>Hindbrains insluiten in gesmolten 3% w/v agar bereid in gedestilleerd water. Nota: Toestaan gesmolten agarose afkoelen tot ongeveer 55° C kort voordat het insluiten warmte om schade te voorkomen aan hindbrain.</li>
	<li>Dwarse hindbrain secties gesneden met een dikte van 70 µm met behulp van een vibratome. Breng elke vers gesneden sectie met een penseel in een putje van de plaat van een 24-well met ijskoude PBS.</li>
	<li>Label van de zwevende secties, zoals beschreven in stappen 4.2-4.7, maar de stappen als volgt wijzigen: wassen het drijvende afdelingen bij 4 ° C 3 x met PBT voor 15 minuten elk, verlaagt de incubatietijd voor secundaire antilichamen tot en met 2 h en incubeer in secundair antilichaam op RT.</li>
	<li>Eventueel na het labelen met antilichamen voor andere epitopes zoals beschreven in stap 5.4, detecteren EdU+ kernen met behulp van een EdU labeling kit volgens de instructies van de fabrikant. Incubeer de zwevende secties in de reactie cocktail gedurende 30 minuten bij 37 ° C in het donker. Wassen hindbrain afdelingen bij 4 ° C 3 x met PBT voor elke 15 min.</li>
	<li>Eventueel na labeling voor andere epitopes zoals beschreven in stap 5.4, detecteren BrdU+ kernen als volgt.<ol>
<li>Incubeer zwevende secties in zoutzuur 2 N bij 37 ° C gedurende 30 minuten in het donker.</li>
		<li>Incubeer zwevende secties in 0,1 M natriumboraat buffer pH 8,5 tweemaal voor 5 minuten elk op RT in het donker te neutraliseren het zoutzuur.</li>
		<li>Wassen van zwevende secties 3 x kort in PBS bij 4 ° C.</li>
		<li>Immunofluorescentie labeling voor BrdU zoals beschreven in stap 5.4 uitvoeren</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubeer de zwevende secties voor 2 min op RT 10 µg/ml 4', 6-diamidino-2-phenylindole-dihydrochloride (DAPI) in PBS te counterstain celkernen.</li>
	<li>Postfix de zwevende secties in 4% formaldehyde gedurende 15 minuten op RT.</li>
	<li>Wassen zwevende secties kort in PBS. Zorgvuldig overbrengen in zwevende secties een glasplaatje Microscoop met behulp van een penseel. MOP van overtollige PBS rond de sectie met vloeipapier of weefsel.</li>
	<li>Mount secties met 80% glycerol in PBS en dek langzaam met een dekglaasje glas aan het vermijden van overlapping luchtbellen. Winkel dia bij 4 ° C in het donker tot Beeldacquisitie (stap 7).</li>
</ol>6. de cryostaat segmenteren en Cryosection immunofluorescentie Labeling
<ol><li>Indien nodig, hydrateren hindbrains van methanol, zoals beschreven in stap 4.1.</li>
	<li>Incubeer hindbrains in sacharose van de 30% w/v in PBS naar cryoprotect hindbrains voor bevriezing. Opmerking: Hindbrains zijn klaar voor het bevriezen wanneer ze gezonken aan de onderkant van de buis, waarin meestal ≤ 2 h voor e9.5-10.5 hindbrains en 3-6 h voor e11.5-13,5 hindbrains.</li>
	<li>Hindbrains in optische snijden temperatuur samengestelde (OCT) dompelen en snel bevriezen door de overdracht van mallen met hindbrains in LGO tolueen afgekoeld tot-40 ° C à-50 ° C op droog ijs. Opmerking: Bevroren, ingesloten hindbrains kunnen worden achtergelaten bij-20 ° C korte en de lange termijn-80 ° C tot segmenteren.</li>
	<li>Dwarse hindbrain secties op een dikte van 10 µm met behulp van een cryostaat en overdracht aan via een elektrostatisch proces zelfklevende Microscoop dia's gesneden. Opmerking: Hindbrain cryosecties kan worden achtergelaten bij-20 ° C korte en de lange termijn-80 ° C tot etikettering.</li>
	<li>Incubeer dia's op RT voor 15 min te drogen van de secties op de dia's. Wassen met PBS cryosecties los OCT en mark een hydrofobe barrière rond cryosecties met een PAP-pen. Herhaal stap 5,4-5,8.</li>
	<li>Herhaal stap 5.10 met behulp van een medium polyvinyl alcohol gebaseerde montage in plaats van glycerol.</li>
</ol>7. de Beeldacquisitie
<ol><li>Foto's met behulp van een epifluorescerende of confocale laser scanning microscoop uitgerust met lenzen geschikt voor waterige media gemonteerde dia's en optische filters geschikt voor de fluorophores gebruikt voor immunolabeling.</li>
	<li>Naar het image van de hele hindbrain of een hindbrain-sectie, gebruik maken van een lens voor 10 x vergroting (bijvoorbeeld figuur 2B); gebruiken om te visualiseren hindbrains gebieden voor kwantificering, een 40 X vergroting (bijvoorbeeld figuur 2D) en te visualiseren van afzonderlijke cellen, gebruikt u een lens met een 63 x vergroting (bijvoorbeeld figuur 2C).</li>
</ol>8. alternatieve methoden
<ol><li>Meng na stap 3.8, losse hindbrains voor de productie van een eencellige schorsing voor stroom cytometry toepassingen15.</li>
	<li>Na stap 3.8, meng nietgefixeerde hindbrains om RNA extract van eencellige schorsingen voor RT-qPCR (b.v., 16). Opmerking: Zorg ervoor alle reagentia en apparatuur worden RNase-gratis in het hele ter voorkoming van achteruitgang van RNA en steriele gehouden.</li>
	<li>Na stap 3.8, meng nietgefixeerde hindbrains om te isoleren van NPC's en deze kan doorgeven in vitro als neurospheres voor de analyse van hindbrain NPC gedrag17. Opmerking: Zorg ervoor alle reagentia en apparatuur worden gehouden steriele Bacteriële/schimmelinfecties verontreiniging van neurosphere culturen te voorkomen.</li>
</ol>

<ol><li>Wilsch-Brauninger, M., Florio, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neocortex+expansion+in+development+and+evolution+-+from+cell+biology+to+single+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neocortex expansion in development and evolution - from cell biology to single genes.</a> Curr Opin Neurobiol. 39, 122-132 (2016).</li>
<li>Gregg, C., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNTF%2FLIF%2Fgp130+receptor+complex+signaling+maintains+a+VZ+precursor+differentiation+gradient+in+the+developing+ventral+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">CNTF/LIF/gp130 receptor complex signaling maintains a VZ precursor differentiation gradient in the developing ventral forebrain.</a> Development. 132 (3), 565-578 (2005).</li>
<li>Kwon, G. S., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eomes%3A%3AGFP-a+tool+for+live+imaging+cells+of+the+trophoblast%2C+primitive+streak%2C+and+telencephalon+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Eomes::GFP-a tool for live imaging cells of the trophoblast, primitive streak, and telencephalon in the mouse embryo.</a> Genesis. 45 (4), 208-217 (2007).</li>
<li>Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hox+Genes+and+the+Hindbrain%3A+A+Study+in+Segments%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Hox Genes and the Hindbrain: A Study in Segments.</a> Curr Top Dev Biol. 116, 581-596 (2016).</li>
<li>Guthrie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+and+axon+guidance+of+cranial+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Patterning and axon guidance of cranial motor neurons.</a> Nat Rev Neurosci. 8 (11), 859-871 (2007).</li>
<li>Fantin, A., Vieira, J. M., Plein, A., Maden, C. H., Ruhrberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+embryonic+mouse+hindbrain+as+a+qualitative+and+quantitative+model+for+studying+the+molecular+and+cellular+mechanisms+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The embryonic mouse hindbrain as a qualitative and quantitative model for studying the molecular and cellular mechanisms of angiogenesis.</a> Nat Protoc. 8 (2), 418-429 (2013).</li>
<li>Terriente, J., Gerety, S. S., Watanabe-Asaka, T., Gonzalez-Quevedo, R., Wilkinson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+from+hindbrain+boundaries+regulates+neuronal+clustering+that+patterns+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Signalling from hindbrain boundaries regulates neuronal clustering that patterns neurogenesis.</a> Development. 139 (16), 2978-2987 (2012).</li>
<li>Coolen, M., Thieffry, D., Drivenes, O., Becker, T. S., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-9+controls+the+timing+of+neurogenesis+through+the+direct+inhibition+of+antagonistic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">miR-9 controls the timing of neurogenesis through the direct inhibition of antagonistic factors.</a> Dev Cell. 22 (5), 1052-1064 (2012).</li>
<li>Dias, J. M., Alekseenko, Z., Applequist, J. M., Ericson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tgfbeta+signaling+regulates+temporal+neurogenesis+and+potency+of+neural+stem+cells+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Tgfbeta signaling regulates temporal neurogenesis and potency of neural stem cells in the CNS.</a> Neuron. 84 (5), 927-939 (2014).</li>
<li>Jacob, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoid+acid+specifies+neuronal+identity+through+graded+expression+of+Ascl1%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Retinoid acid specifies neuronal identity through graded expression of Ascl1.</a> Curr Biol. 23 (5), 412-418 (2013).</li>
<li>Alexandre, P., Reugels, A. M., Barker, D., Blanc, E., Clarke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+derive+from+the+more+apical+daughter+in+asymmetric+divisions+in+the+zebrafish+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurons derive from the more apical daughter in asymmetric divisions in the zebrafish neural tube.</a> Nat Neurosci. 13 (6), 673-679 (2010).</li>
<li>Peretz, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+role+of+hindbrain+boundaries+as+pools+of+neural+stem%2Fprogenitor+cells+regulated+by+Sox2%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">A new role of hindbrain boundaries as pools of neural stem/progenitor cells regulated by Sox2.</a> BMC Biol. 14, 57(2016).</li>
<li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+the+zebrafish+embryonic+brain+by+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy.</a> J Vis Exp. (26), (2009).</li>
<li>Taverna, E., Haffner, C., Pepperkok, R., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+to+manipulate+the+fate+of+single+neural+stem+cells+in+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A new approach to manipulate the fate of single neural stem cells in tissue.</a> Nat Neurosci. 15 (2), 329-337 (2011).</li>
<li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> J Vis Exp. (94), (2014).</li>
<li>Hutton, S. R., Pevny, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX2+expression+levels+distinguish+between+neural+progenitor+populations+of+the+developing+dorsal+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">SOX2 expression levels distinguish between neural progenitor populations of the developing dorsal telencephalon.</a> Dev Biol. 352 (1), 40-47 (2011).</li>
<li>Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+embryonic+mouse+neural+stem+cell+culture+using+the+neurosphere+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay.</a> J Vis Exp. (47), (2011).</li>
<li>Sauer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitosis+in+the+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Mitosis in the neural tube.</a> The Journal of Comparative Neurology. 62 (2), 377-405 (1935).</li>
<li>Sessa, A., Mao, C. A., Hadjantonakis, A. K., Klein, W. H., Broccoli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tbr2+directs+conversion+of+radial+glia+into+basal+precursors+and+guides+neuronal+amplification+by+indirect+neurogenesis+in+the+developing+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Tbr2 directs conversion of radial glia into basal precursors and guides neuronal amplification by indirect neurogenesis in the developing neocortex.</a> Neuron. 60 (1), 56-69 (2008).</li>
<li>Pilz, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+progenitors+in+the+mammalian+telencephalon+includes+a+new+radial+glial+cell+type%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Amplification of progenitors in the mammalian telencephalon includes a new radial glial cell type.</a> Nat Commun. 4, 2125(2013).</li>
<li>Fantin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+macrophages+act+as+cellular+chaperones+for+vascular+anastomosis+downstream+of+VEGF-mediated+endothelial+tip+cell+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Tissue macrophages act as cellular chaperones for vascular anastomosis downstream of VEGF-mediated endothelial tip cell induction.</a> Blood. 116 (5), 829-840 (2010).</li>
<li>Kayam, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+Pax6+in+the+segmental+organization+of+the+hindbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A novel role for Pax6 in the segmental organization of the hindbrain.</a> Development. 140 (10), 2190-2202 (2013).</li>
<li>Tata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+embryonic+neurogenesis+by+germinal+zone+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Regulation of embryonic neurogenesis by germinal zone vasculature.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (47), 13414-13419 (2016).</li>
</ol>

De auteurs geen strijdige belangen of belangenconflicten.

Dit protocol wordt beschreven hoe u de muis embryonale hindbrain als een model om te bestuderen van de mechanismen van ontwikkelingsstoornissen neurogenese. Met behulp van een verscheidenheid van verschillende immunolabeling methoden, hindbrain NPCs kan worden gevisualiseerd en hun aantal gekwantificeerd in weefselsecties of over orgel wholemounts. Het gemak van de dissectie en platte anatomie zorgt ervoor dat de hindbrain in de voorbereiding van een 'open boek' informatie te verzamelen over orgel-wide neurogenese patronen image kan worden gemaakt.
Verder laten we zien dat NPC morfologie en celcyclus-gerelateerde NPC positionering kunnen worden gemakkelijk gevisualiseerd in drijvende- of cryosecties van de hindbrain. Beide gedragingen kunnen worden benut om het definiëren van nieuwe voorlopercellen populaties, zoals eerder is uitgevoerd in de zoogdieren telencephalon20. Bijvoorbeeld, vroege gevormde Sox2+ neuroepithelia en Pax6+ apicale radiale glia zijn aanwezig in de hindbrain21,22, maar de hindbrain mist Tbr2+ basale progenitoren3 .
Het protocol hier beschreven kan ook worden aangepast aan het observeren van het gedrag van specifieke NPC subpopulaties door fluorescerende labeling voor levende imaging en/of lineage tracering in vaste weefsels. Dit kan worden bereikt, bijvoorbeeld door het bestuderen van de hindbrains uit muizen dragen de tamoxifen-afleidbare transgenic Sox1-iCreERT2 en de Rosa26tdTomato verslaggever23.
Behalve voor een betere kennis van lymfkliertest neurogenese, kan bestuderen van de hindbrain toelichten in grote lijnen relevante neurogene mechanismen die worden gedeeld door de soorten, omdat het hindbrain een zeer geconserveerde hersenen regio die verwachting is lijkt meer tussen gewervelde dieren dan de reukkolf.
Zoals hindbrain neurogenese over een relatief korte tijd venster dan reukkolf neurogenese23 plaatsvindt, is het belangrijk om te overwegen de noodzaak voor het vergelijken van voldoende geënsceneerd embryo's. Dienovereenkomstig, experimentele bias wordt vermeden door tellen en het opnemen van het aantal Somiet paren in een embryo voorafgaand aan zijn hindbrain te isoleren. Het hindbrain weefsel zelf is broos en pincet moet daarom voorzichtig worden omgegaan wanneer het scheiden van het hindbrain weefsel van het hoofd mesenchym en hersenvliezen; een paar van 'praktijk runs' zou daarom aan te raden voordat dissectie van waardevolle embryo's tot stand is gebracht. Bovendien moet de hindbrains uit een buis worden overgedragen naar de andere met behulp van een precisiepipet wide-boring Pasteur in plaats van met een tang om schade (van de pipet openen kan worden uitgebreid door het kappen van het uiteinde met een schone schaar) te voorkomen. Ten slotte, hoewel ongebruikelijk, de omvang van de EdU/BrdU opneming in de S-fase NPC's mogelijk variabele, met name tijdens de korte (dat wil zeggen, 1 h) peulvruchten. Ter verbetering van labeling, zorgen dat EdU/BrdU goed is ontbonden vóór het laden van de oplossing in de spuit en zorgvuldig te injecteren in de peritoneale holte. Arme injecties, zoals die subcutaan per ongeluk, zal resulteren in het verliezen of het overvullen van de EdU/BrdU-oplossing en voorkomen dat het invoeren van het verkeer.

Tijdens de embryonale ontwikkeling van de zoogdieren verdelen NPC's in de ventriculaire (VZ) en de subventriculaire (SVZ) zones van de groeiende neuroepithelium voor het genereren van nieuwe neuronen in een proces 'neurogenese' genoemd. De generatie van nieuwe neuronen en hun NPC precursoren heeft uitvoerig zijn onderzocht in de reukkolf1, terwijl minder is gekend over dit proces in andere regio's.
De reukkolf is een complex en ingewikkeld gevouwen structuur momenteel grotendeels met histologische methoden onderzocht na weefsel afdelen, waardoor begrip neurogenese patronen over de hele orgel uitdagend. Bovendien, zijn studies van reukkolf neurogenese niet noodzakelijkerwijs voorspellende van neurogene gedrag in andere hersengebieden of het ruggenmerg. Bijvoorbeeld, signalering signalen kunnen uiteenlopende reacties uitlokken tussen verschillende CNS-regio's, zoals opgemerkt in het geval van Ciliaire neurotrophic factor en leukemie remmende factor, die zelf-vernieuwing van NPC's te bevorderen in de laterale ganglionaire eminentie, maar rijden differentiatie van ruggenmerg progenitoren2. Bovendien, een subklasse van NPC's die bevolken de ontwikkelende reukkolf en aanzienlijk bijdragen aan de uitbreiding van de hersenschors1 afwezig zijn uit de hindbrain en het ruggenmerg3. Omgekeerd, is het denkbaar dat het ruggenmerg en hindbrain alternatieve NPC subtypen niet aanwezig in de cortex bevatten.
De muis embryo hindbrain is de evolutionaire oudste regio van de hersenen van zoogdieren en genereert de kleine hersenen en hersenstam. Ondanks haar instandhouding over soorten, is relatief weinig bekend over hindbrain neurogenese, met inbegrip van NPC subtypen of hun verordening. De meerderheid van hindbrain onderzoek in de muis is gericht op het proces van weefsel segmentatie, gedreven door Hox-genen4, en de patronen van post mitotische neuronen5. Bovendien, is de hindbrain gebruikt als een model voor het bestuderen van de mechanismen van ontwikkelingsstoornissen angiogenese6.
In tegenstelling tot de hindbrain van de muis, is de zebravis hindbrain gebruikt uitgebreid NPC differentiatie en bloedlijn progressie in een gewervelde model-organisme (bijvoorbeeld,7,8) te volgen. De hindbrain chick heeft ook tewerkgesteld te bestuderen neurogenese tijdens gewervelde ontwikkeling (b.v.,9,10). Gelijkaardig aan de zebravis hindbrain11, de chick hindbrain kunnen levende beeld om te bestuderen van NPC gedrag en verordening over tijd12. Analoog longitudinale observatie door levende imaging is niet momenteel mogelijk in zoogdieren organismen, omdat ze de ontwikkeling van in utero. Bovendien gericht manipulatie door middel van technieken zoals electroporation gemakkelijk kan worden toegepast op free-living zebrafish embryo's of kuiken embryo's in ovo (b.v.,13), maar dergelijke technieken zijn ook meer uitdagende in utero.
Toch is de muis embryo hindbrain prachtig geschikt voor het definiëren van de moleculaire en cellulaire mechanismen die neurogenese regeren. Ten eerste, analyse van de muis hindbrain zal, in veel gevallen, informatie verstrekken die meer relevant is voor mensen ontwikkelingen dan dat verkregen door het bestuderen van lagere gewervelde dieren. Bovendien vindt u een groot aantal genetisch gemodificeerde muis stammen dat kan ofwel worden gebruikt voor lot lymfkliertest NPC's in kaart te brengen of te veranderen van regulerende mechanismen met constitutieve of voorwaardelijke mutant allelen van relevante genen. Tot slot, het heeft onlangs aangetoond dat microinjection van ventriculaire hindbrain progenitoren ex vivo maakt ten minste een kort onderzoek van hindbrain NPC kinetiek14. Nog, op dit moment is zeer weinig bekend over de spatio organisatie en het gedrag van hindbrain NPC's in het kader van een hele orgel.
We laten hier zien een eenvoudige en snelle methode om met behulp van de hindbrain als een krachtig model voor het analyseren van zoogdieren NPC gedrag in wholemount preparaten en weefselsecties. Wij bieden verder protocollen voor het gebruik van immunolabeling voor het bestuderen van verschillende neurogenese parameters en proces hindbrain monsters verder voor downstream moleculaire toepassingen zoals kwantitatieve reverse-transcriptase (qRT)-PCR.

```html
<table>
<tbody>
<tr>
<td>Rondbodemreagensbuis, 2,0 ml (Safe-Lock)</td>
<td>VWR</td>
<td>211-2120</td>
<td>Ook verkrijgbaar bij andere commerciële leveranciers</td>
</tr>
<tr>
<td>Kunststof celkweekschaal, 60 mm</td>
<td>Thermo Fisher</td>
<td>150288</td>
<td>Ook verkrijgbaar bij andere commerciële leveranciers</td>
</tr>
<tr>
<td>Celkweekplaten, 12-wels</td>
<td>Thermo Fisher</td>
<td>150628</td>
<td>Ook verkrijgbaar bij andere commerciële leveranciers</td>
</tr>
<tr>
<td>Pasteur pipetten</td>
<td>Copan</td>
<td>200C</td>
<td>Ook verkrijgbaar bij andere commerciële leveranciers</td>
</tr>
<tr>
<td>Dumont Watchmaker pincet, nr. 5</td>
<td>FST</td>
<td>91150-20</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Dumont Watchmaker pincet, nr. 55</td>
<td>FST</td>
<td>11295-51</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>29G naald/sering</td>
<td>BD</td>
<td>BD Micro-Fine +1ml</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-fosfo-histone H3 primaire antistof</td>
<td>Millipore</td>
<td>06-570</td>
<td>Geit, verdunning 1:400</td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-BrdU primaire antistof</td>
<td>Abcam</td>
<td>ab6326</td>
<td>Raad, verdunning 1:400</td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-Ki67 primaire antistof</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>550609</td>
<td>Muis, verdunning 1:400</td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-RC2 primaire antistof</td>
<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
<td>RC2</td>
<td>Muis (IgM), verdunning 1:400</td>
</tr>
<tr>
<td>Alexa Fluor 488-geconjugeerd geit anti konijn secundaire antistof</td>
<td>Thermo Fisher</td>
<td>A11029</td>
<td>Verdunning 1:200</td>
</tr>
<tr>
<td>Alexa Fluor 594-geconjugeerd geit anti konijn secundaire antistof</td>
<td>Thermo Fisher</td>
<td>A11037</td>
<td>Verdunning 1:200</td>
</tr>
<tr>
<td>Alexa Fluor 488-geconjugeerd geit anti muis IgM secundaire antistof</td>
<td>Thermo Fisher</td>
<td>A21042</td>
<td>Verdunning 1:200</td>
</tr>
<tr>
<td>Alexa Fluor 488-geconjugeerd geit anti muis secundaire antistof</td>
<td>Thermo Fisher</td>
<td>A11001</td>
<td>Verdunning 1:200</td>
</tr>
<tr>
<td>Alexa Fluor 594-geconjugeerd geit anti raad secundaire antistof</td>
<td>Thermo Fisher</td>
<td>A11007</td>
<td>Verdunning 1:200</td>
</tr>
<tr>
<td>4',6-Diamidino-2-Fenylindole, Dihydrochloride (DAPI)</td>
<td>Sigma</td>
<td>D9542</td>
<td>Gebruik bij 10 µg per mL</td>
</tr>
<tr>
<td>5-ethynyl-2’-deoxyuridine (EdU)</td>
<td>Sigma</td>
<td>900584</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>5-broom-2’-deoxyuridine (BrdU)</td>
<td>Sigma</td>
<td>B5002</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit</td>
<td>Thermo Fisher</td>
<td>C10086</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Heat-inactivated geit serum</td>
<td>Sigma</td>
<td>G9023</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Bovine serum albumine</td>
<td>Sigma</td>
<td>A7906</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>DAKO eiwit-blokkeer serumvrij</td>
<td>Agilent</td>
<td>X0909</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>Sigma</td>
<td>T8787</td>
<td>Ook verkrijgbaar bij andere commerciële leveranciers</td>
</tr>
<tr>
<td>Fosfaat bufferoplossing</td>
<td>Sigma</td>
<td>P4417</td>
<td>Ook verkrijgbaar bij andere commerciële leveranciers</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6148</td>
<td>Ook verkrijgbaar bij andere commerciële leveranciers</td>
</tr>
<tr>
<td>Natriumtetraboraat</td>
<td>Sigma</td>
<td>B9876</td>
<td>Ook verkrijgbaar bij andere commerciële leveranciers</td>
</tr>
<tr>
<td>Sucrose</td>
<td>Sigma</td>
<td>S0389</td>
<td>Ook verkrijgbaar bij andere commerciële leveranciers</td>
</tr>
<tr>
<td>Agarose</td>
<td>Sigma</td>
<td>A9539</td>
<td>Ook verkrijgbaar bij andere commerciële leveranciers</td>
</tr>
<tr>
<td>Super PAP pen vloeibare blocker</td>
<td>Ted Pella, Inc.</td>
<td>22309</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>SlowFade Antifade Kit</td>
<td>Thermo Fisher</td>
<td>S-2828</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Glycerol</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>10337700</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Mowiol</td>
<td>Millipore</td>
<td>475904</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>OCT</td>
<td>Scigen</td>
<td>4583</td>
<td>Ook verkrijgbaar bij andere commerciële leveranciers</td>
</tr>
<tr>
<td>Isopentaan</td>
<td>Sigma</td>
<td>M32631</td>
<td>Ook verkrijgbaar bij andere commerciële leveranciers</td>
</tr>
<tr>
<td>Methanol</td>
<td>Thermo Fisher</td>
<td>10675112</td>
<td>Ook verkrijgbaar bij andere commerciële leveranciers</td>
</tr>
<tr>
<td>Zoutzuur</td>
<td>Thermo Fisher</td>
<td>10316380</td>
<td>Ook verkrijgbaar bij andere commerciële leveranciers</td>
</tr>
<tr>
<td>Microscoopglazen</td>
<td>VWR</td>
<td>631-0912</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Superfrost microscoopglazen</td>
<td>VWR</td>
<td>631-0108</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Thermometer</td>
<td>VWR</td>
<td>620-0858</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Dekglas</td>
<td>VWR</td>
<td>631-0137</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Stereo Microscope, Leica MZ16</td>
<td>Leica</td>
<td>niet van toepassing</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Confocale laserscanningmicroscoop LSM710</td>
<td>Zeiss</td>
<td>niet van toepassing</td>
<td></td>
</tr>
</tbody>
</table>
```

de muis hindbrain als een model voor het bestuderen van embryonale neurogenese

The Mouse Hindbrain As a Model for Studying Embryonic Neurogenesis

De muis embryo reukkolf is het meest werkzame systeem voor het bestuderen van zoogdieren neurogenese tijdens de ontwikkeling. Echter, de zeer gevouwen reukkolf neuroepithelium is niet vatbaar voor wholemount analyse te onderzoeken orgel bestrijkende neurogenese patronen. Bovendien, het definiëren van de mechanismen van reukkolf neurogenese is niet noodzakelijkerwijs voorspellende van neurogenese in andere delen van de hersenen; bijvoorbeeld, als gevolg van de aanwezigheid van reukkolf-specifieke voorlopercellen subtypen. De muis-hindbrain biedt een alternatief model voor het bestuderen van embryonale neurogenese dat is vatbaar voor wholemount analyse, evenals weefselsecties te observeren de spatio distributie en het gedrag van neurale voorlopercellen. Bovendien is het gemakkelijk voor andere downstream-toepassingen, zoals cel isolatie of moleculaire biologie analyse ontleed. Zoals de muis hindbrain kan gemakkelijk worden geanalyseerd in het grote aantal cel lineage verslaggever en mutant muis stammen die beschikbaar zijn gekomen, biedt het een krachtig model voor het bestuderen van de cellulaire en moleculaire mechanismen van ontwikkelingsstoornissen neurogenese in een zoogdier organisme. Hier presenteren we een eenvoudige en snelle methode om met behulp van de muis embryo hindbrain voor het analyseren van zoogdieren neurale progenitor cel (NPC) gedrag in wholemount preparaten en weefselsecties.

Deze sectie ziet u voorbeelden van de resultaten die kunnen worden verkregen bij de studie van de neurogenese in de muis embryonale hindbrain door middel van wholemount en weefsel sectie analyse.
We laten zien dat immunolabeling van de wholemount van de microdissected hindbrain met een antilichaam voor de mitotische marker pHH3 visualiseert verdelen van NPC's in de VZ (figuur 2B - D). Laten we pHH3+ NPC's bij een hoge vergroting wil de verschillende fases van de mitose (figuur 2C). We hebben laten zien dat deze labeling methode geschikt om te worden uitgevoerd in verschillende opeenvolgende stadia van ontwikkeling van de hindbrain is te observeren het tijdsverloop van NPC mitose in dit orgel (figuur 2D).
We laten zien dat imaging dwarse immunolabeled vibratome secties van de hindbrain 1 h na EdU injectie, visualiseert de splitsing richting van mitotische NPC (figuur 3B), het patroon van de pseudostratified, interkinetic nucleaire migratie van fietsen progenitoren18 (figuur 3B, D), en de algehele VZ structuur (figuur 3B - D). Merk op dat mitotische pHH3+ NPC's zijn alleen bij de ventriculaire oppervlak aanwezig en niet meer basally (Figuur 3 c), die contrasteert de basale divisie patroon van het geëngageerder NPC's in de reukkolf19.
We illustreren ook hoe fietsen NPC's en hun gedifferentieerde nageslacht kan gelabeld zijn met BrdU of EdU om te beoordelen van NPC lineage progressie (Figuur 4). De immunolabeling van transversale cryosecties van de muis hindbrain 1 dag na BrdU injectie voor BrdU en Ki67toont het aantal en de positionering van de fietsen van NPC's in de neuroepithelium (figuur 4A, B), waarbij het aantal zelf vernieuwen NPC's kan worden gedefinieerd door berekening van het percentage van de Ki67+ BrdU+ cellen onder alle BrdU+ cellen (figuur 4A, C).
Ten slotte, laten we een voorbeeld van immunolabeling van hindbrain vibratome secties voor RC2, een antigeen in de tussenliggende gloeidraad van neurale-specifieke nestin, om te visualiseren NPC endfeet (figuur 5B) en processen (figuur 5C). Vibratome secties, in plaats van dunne cryosecties, toestaan verbeterde observatie van de zeer vertakte NPC's en ook met de algemene structuur van de neuroepithelial.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56793/56793fig1.jpg"> Figuur 1 : Sleutel stappen in de dissectie van een hindbrain van een e11.5 muis embryo. (A - D) Schematische voorstelling van hindbrain microdissection. (A) het caudal hoofd weefsel wordt verwijderd door doorsnijden omvat langs de rode gestippelde lijnen. (B) de dak plaat is doorboord en vervolgens weg gescheurd in zowel rostraal en caudal richtingen langs de middellijn (verticale rode lijnen) en dan lateraal te onthullen van de hindbrain neuroepithelium. (C) de neuroepithelium is uit de buurt van de hersenvliezen keek na het plaatsen van de verlostang tussen beide structuren, en het veroorzaakt en ruggenmerg weefsels worden verwijderd door doorsnijden omvat het weefsel met de verlostang langs de rode gestippelde lijnen. (D) deze procedure levert een afgevlakte hindbrain. (E--K) Fotolader van belangrijke fasen van de procedure van de microdissection hindbrain. (E) het embryo is onthoofd door doorsnijden omvat langs de stippellijn. (F) de hindbrain en de 4th ventrikel, omsloten door de dak-plaat, zijn weggesneden en gescheiden van het hoofd door doorsnijden omvat langs de dotted strafregels. (G) de 4th ventrikel is gericht naar boven voordat een klein gat in het dak plaat (sterretje) wordt doorboord. Het gat is verruimd door het weefsel peeling zorgvuldig zowel rostrally als caudally langs de middellijn (pijlen) om de hindbrain bloot te stellen. De hindbrain is gepositioneerd pial zijde naar beneden en van links naar uitklapbare in een open boek voorbereiding (H; zwart pijlpunt geeft hindbrain zenuwweefsel). Als de hindbrain vereist voor wholemount immunolabeling is, wordt het pial membraan verwijderd door nieuwsgierige zachtjes de neuroepithelium van de hindbrain van de omliggende meningeal membranen met pincet (ik). Veroorzaakt (mb) en het ruggenmerg (sc) overtollige weefsel is verwijderd (stippellijnen in J) te isoleren van de hindbrain (K). Schaal bar: 500 µm voor (E), 300 µm voor (F - - K). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56793/56793fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56793/56793fig2.jpg"> Figuur 2 : Wholemount immunolabeling kan worden gebruikt voor het kwantificeren van NPC mitoses over de hindbrain. (A) schema nl gezicht beeldvorming van mitotische NPC's in de hindbrain ventriculaire laag te illustreren. V, ventriculaire hindbrain kant; P, pial hindbrain kant. (B) Confocal tegel scan z stapel e10.5 hindbrain na wholemount immunolabeling voor de mitotische marker pHH3 (rood). Het witte vak geeft aan de ruimte die zijn genoemd bij hogere vergroting in het tweede deelvenster in (D). (C) pre anafase (witte pijlpunt) en anafase (zwarte pijlpunt) mitotische cijfers zijn te onderscheiden binnen de totale cohort van mitotische NPCs. (D) tijdsverloop van wholemount pHH3 labeling van e9.5-13,5. Schaal bars: 500 µm in (B); 20 µm in (C); 100 µm in (D). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56793/56793fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56793/56793fig3.jpg"> Figuur 3 : Fietsen NPC's binnen hun germinal zone in de rostraal hindbrain. (A) Schematische voorstelling afgebeeld van de positie van de mitotische (groen) en de S-fase (rood)-NPC's op de ventriculaire oppervlak van hindbrain en op het gebied van periventricular, respectievelijk. Een virtuele doorsnede door de hindbrain wordt weergegeven bij hogere vergroting aan de rechterkant. De zwarte pijl geeft de richting van migratie van NPC nakomelingen die hebben verlaten de celcyclus naar de differentiatie-zone. (B) Confocal z stapel van een drijvende e11.0 hindbrain sectie van een embryo die een 1U EdU pols ontvangen; immunolabeling voor pHH3 en EdU werd gebruikt om te visualiseren mitotische (groen) en de S-fase (rood) NPC's, respectievelijk. Hindbrain oppervlakken worden aangeduid met stippellijnen; V, ventriculaire hindbrain kant; P, pial hindbrain kant. Het gebied aangegeven met een wit vakje wordt weergegeven bij hogere vergroting in de inzet; pijlen geven aan dat het vliegtuig van de splijting van een NPC in anafase, ten opzichte van de ventriculaire oppervlak. (C) Eén kanaal pHH3 immunolabeling alleen weer te geven. Mitotische NPC's worden aangeduid met cyaan pijlpunten; het gebrek aan basale divisies wordt aangegeven door Δ. (D) enkel kanaal weergeven EdU labeling alleen. EdU+ NPC's nemen een pseudostratified verdeling als gevolg van hun interkinetic nucleaire migratie. De afstand die NPC's uit de buurt van de ventriculaire oppervlak migreren kan worden gemeten, zoals een vertegenwoordiger oranje lijn. Schaal bars: 100 µm in (B -D); 10 µm in verzonken vlak in (B). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56793/56793fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56793/56793fig4.jpg"> Figuur 4 : Combineren BrdU met het labelen van de Ki67 om te bepalen hindbrain NPC zelf-vernieuwing capaciteit. (A) Confocal z stack van een e10.5 hindbrain cryosection na labeling voor Ki67 (groen) en BrdU (rood) na een 1 dag BrdU pulse. Dubbel-positieve cellen in de ventriculaire zone zijn NPC's die BrdU hebben opgenomen en worden nog steeds door middel van de celcyclus, zoals aangegeven door het labelen van de Ki67. Het aandeel van de double-gelabeld cellen onder de totale bevolking van de BrdU+ geeft het percentage van zichzelf vernieuwende NPC's (B, C) enkele kanalen weergeven van Ki67 (B) en (C) BrdU immunolabeling alleen. Een BrdU+ -cel die mist Ki67 en daarom heeft waarschijnlijk verlaten de celcyclus wordt aangegeven door een cyaan pijlpunt in (A,C). Hindbrain oppervlakken worden aangeduid met stippellijnen; V, ventriculaire hindbrain kant; P, pial hindbrain kant. Schaal bar: 50 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56793/56793fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56793/56793fig5.jpg"> Figuur 5 : Nestin immunolabeling visualiseert NPC processen en endfeet. (A - C) Immunofluorescentietest voor RC2, die een epitoop herkend op de neurale tussenliggende gloeidraad nestin, illustreert NPC morfologie over de hindbrain neuroepithelium. (A) Confocal z stack van een zwevende sectie uit een hindbrain van de e11.5 na RC2 immunolabeling; vakken staan bij hogere vergroting in (B, B'; apicale/ventriculaire regio) en (C, C', basale regio). Hindbrain oppervlakken worden aangeduid met stippellijnen; V, ventriculaire hindbrain kant; P, pial hindbrain kant. (B, C) Confocale z stapels boxed gebieden in (A); interne optische secties worden weergegeven in (B', C'), respectievelijk. Een NPC apicale endfoot verankerd aan de ventriculaire oppervlakte is aangegeven met een pijl in (B'). Enkele en fasciculated NPC processen worden aangeduid met witte en zwarte pijlpunten in (C'), respectievelijk. Schaal bars: 100 µm, (A); 25 µm voor (B, C). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56793/56793fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Dit artikel demonstreert hoe de muis embryonale hindbrain kan worden gebruikt als een model voor het bestuderen van ontwikkelingsstoornissen neurogenese in zowel hele organen en weefsel sectie preparaten.

De muis Hindbrain als een Model voor het bestuderen van embryonale neurogenese

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded ...

Het algemene doel van deze procedure is om het gehele orgaan en histologische analyse van de embryonale achterhersenen van de muis tijdens de ontwikkeling mogelijk te maken. Deze methode maakt de studie van ontwikkelingen op neurogenese in de achterhersenen van een zoogdiermodelorganisme mogelijk. De zich ontwikkelende achterhersenen van de muis is een uitstekend model voor het bestuderen van de activiteit van neurale progenese vanwege de platte architectuur die observatie van neurogenesepatronen over het hele orgaan vergemakkelijkt.Begin deze procedure met het euthanaseren van een zwangere vrouwelijke muis op een ethisch goedgekeurde wijze in het vereiste zwangerschapsstadium. Gebruik scherpe schaar om de buikholte open te snijden en verwijder voorzichtig de baarmoeder. Plaats de verwijderde baarmoeder met de embryo's in een plastic schaal van 60 millimeter met 20 milliliter ijskoud PBS.Voer alle verdere dissectie uit met behulp van een dissectiesmicroscoop. Gebruik Watchmaker-tang nummer vijf om de baarmoederwand te scheuren om de embryo's bloot te leggen. Laat elk embryo los door de navelstreng door te snijden en verwijder de dooierzak.Nadat elk embryo is overgebracht naar een schone plastic schaal met ijskoud PBS, gebruik Watchmaker-tang nummer 55 om het hoofd af te snijden. Optioneel, bewaar een klein stukje weefsel voor genomische DNA-isolatie en daaropvolgende genotypering. Gebruik Watchmaker-tang nummer 55 om het weefsel dat de achterhersenen bevat, parallel aan en onmiddellijk onder het neuro-epithelium van de achterhersenen te verwijderen om het te scheiden van gezichts- en voorhersenweefsel.Plaats de achterhersenen en caudale hoofdweefsels met de dorsale kant naar boven en identificeer de vierde ventrikel die bedekt is met een dunne weefsellaag die bekend staat als het dakplaatje. Prik voorzichtig het dakplaatje door met behulp van Watchmaker-tang nummer 55 en scheer overtollig weefsel weg met behulp van de tang, beweeg rostrale langs de middenlijn over de middenhersenen en vervolgens caudale over de achterste achterhersenen en het ruggenmerg. De achterhersenen zouden nu zichtbaar moeten zijn in een open boek-voorbereiding.Om achterhersenen voor immuunlabeling van gehele preparaten voor te bereiden, gebruik Watchmaker-tang nummer 55 om voorzichtig het resterende hoofd van mesenchym en eventueel gehecht meninges aan de afgeschilde kant van de achterhersenen los te maken. Verwijder het middenhersenen en ruggenmergweefsel om alleen het achterhersenweefsel over te laten. Om achterhersenen voor vibratome en cryosectie voor te bereiden, gebruik Watchmaker-tang nummer 55 om het middenhersenen en ruggenmergweefsel te verwijderen.Breng de achterhersenen over van de plastic schaal in ronde bodem twee milliliter buisjes met behulp van een Pasteur-pijpje. Nadat alle PBS is geaspieerd, fixeer de achterhersenen gedurende twee uur bij vier graden Celsius met zachte agitatie in vers ontdooide 4% gewicht per volume formaldehyde opgelost in PBS. Spoel tenslotte de achterhersenen drie keer met PBS.Indien nodig, rehydrateer achterhersenen in seriële dalende delusiën van methanol in PBS bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten bij elke concentratie. Breng vervolgens de achterhersenen over naar PBS. Permeabiliseer de achterhersenen gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius in PBS met PBT met zachte agitatie.Incubeer vervolgens de achterhersenen gedurende één uur bij vier graden Celsius in PBT bevattend 10% hitte-geïnactiveerd geitenserum. Incubeer vervolgens de achterhersenen een nacht als eerder in PBT bevattend 1% hitte-geïnactiveerd serum en primaire antilichamen. De volgende dag, was de achterhersenen gedurende één uur bij vier graden Celsius met PBT.Na de wassing, incubeer de achterhersenen een nacht bij vier graden Celsius in PBT bevattend de juiste fluorofoor geconjugeerde secundaire antilichamen gericht tegen de primaire antilichamen die zijn gebruikt. Houd de achterhersenen vanaf dit punt in het donker om fluoroforen te beschermen tegen fotobleken. Na wassing zoals eerder met PBT, post-fixeer de achterhersenen in 4% formaldehyde in PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur voor langdurige conservering van antilichaambinding.Bedek ondertussen een glazen microscoopglas met twee lagen zwart elektrisch tape en snij een klein vierkantje uit het gelaagde tape om een zak groot genoeg te maken om de achterhersenen te houden. Nadat de achterhersenen twee keer kort zijn gespoeld in PBS, breng deze over in de zak met een Pasteur-pijpje. Verwijder het overtollige vocht en voeg een geschikte anti-fade reagens toe aan de zak.Bedek vervolgens langzaam de achterhersenen met een glazen dekglas om luchtbellen onder het dekglas te voorkomen. Verzegel het dekglas en bevestig het aan het glas met een dunne laag nagellak. Bewaar de schuif bij vier graden Celsius in het donker tot beeldverwerving.Bevat achterhersenen in gesmolten agarose bij 3% gewicht per volume bereid in gedistilleerd water. Snijd de overgedragen achterhersenensecties tot een dikte van 70 microns met behulp van een vibratoom. Breng elke vers gesneden sectie met behulp van een penseel over in één putje van een 24-putjesplaat bevattend ijskoud PBS.Na het labelen van de drijvende secties zoals beschreven in het tekstprotocol, was ze kort in PBS. Breng drijvende secties voorzichtig over naar een glazen microscoopglas met behulp van een penseel. Neem het overtollige PBS rond de sectie op met behulp van blottingpapier of tissue.Bekijk de secties niet met 80% glycerol in PBS. Bedek ze vervolgens langzaam met een glazen dekglas om luchtbellen te voorkomen. Bewaar de schuif bij vier graden Celsius in het donker tot beeldverwerving.Incubeer de achterhersenen in 30% gewicht per volume sucrose in PBS bij vier graden Celsius om achterhersenen te cryobeschermen voorafgaand aan bevriezing. Dompel de achterhersenen onder in optisch snijdende temperatuur compound of OCT. Bevriest ze vervolgens snel door de mallen met de achterhersenen over te brengen naar isopentaan gekoeld

the-mouse-hindbrain-as-a-model-for-studying-embryonic-neurogenesis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Een methode om organotypische segmenten van de E12.5 muriene embryonale middenhersenen genereren is beschreven. De organotypische slice culturen kan worden gebruikt om het gedrag van dopaminerge neuronen of andere ventrale middenhersenen neuronen te observeren.

Organotypische Slice culturen van embryonale ventrale middenhersenen: Een systeem om Dopaminerge Neuronale Development Study In vitro</em

This video presents a method for generating cortical interneuron precursors from mouse embryonic stem cells. The protocol entails culturing the stem cells in media containing specific small molecule inhibitors, which facilitate stem cell proliferation and aggregation into embryoid bodies (EBs). Subsequently, the EBs are dissociated with enzymes and plated on culture plate wells coated with adhesion proteins to promote their differentiation into cortical interneuron precursors.

Generating Cortical Interneuron Precursors From Mouse Embryonic Stem Cells

Hoe neuronale netwerken zijn in de embryonale hersenen opgericht is een fundamentele vraag in ontwikkelingsstoornissen neurobiologie. Hier combineerden we een electroporatietechniek met nieuwe genetische hulpmiddelen, zoals Cre / Lox-plasmiden en piggyBac-gemedieerde DNA omzetting systeem in de aviaire hindbrain om dorsale interneurons labelen en volgen hun axonale projecties en synaptische doelen op verschillende ontwikkelingsstadia.

Elektroporatie van de hindbrain om Axonale Trajectories en Synaptic Doelen Trace in de Chick Embryo

Ondanks de functionele en medische belang van de...

Genetische Manipulatie van de muis Ontwikkelen Hypothalamus via<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporatie

Werkwijzen voor de manipulatie en analyse van NF-kB-afhankelijke volwassen hippocampus neurogenese beschreven. Een gedetailleerd protocol wordt gepresenteerd voor een dentate gyrus-afhankelijke gedragstest (genoemd het ruimtelijk patroon scheiding-Barnes doolhof) voor het onderzoek naar cognitieve uitkomst bij muizen. Deze techniek moet ook helpen onderzoek mogelijk te maken in andere experimentele instellingen.

Methoden voor de modulatie en analyse van NF-kB-afhankelijke Adult Neurogenese

Progenitorceltransplanten mitose is een kritische parameter van neurogenese. Veel van onze kennis van neurale voorlopercellen mitose is gebaseerd op de analyse van vaste weefsel. Live-beeldvorming in de embryonale hersenen plakjes is een veelzijdige techniek om mitose te beoordelen met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie in een gecontroleerde omgeving.

Live-Imaging van mitose in het ontwikkelen van muis embryonale Cortex

Embryonale neuronen worden geboren in de ventriculaire zone van de neurale buis, maar migreren naar geschikte doelen te bereiken. Facial branchiomotor (FBM) neuronen zijn een bruikbaar model om neuronale migratie te bestuderen. Dit protocol beschrijft de wholemount ex vivo cultuur van muizenembryo hindbrains naar mechanismen die FBM regulering van de migratie te onderzoeken.

Muis hindbrain<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultuur aan Facial Branchiomotor Neuron Migratie Studie

Uitdagende jonge neuronen in nieuwe hersengebieden kan het onthullen van belangrijke inzichten in hoe het milieu neuronale lot en rijping beeldhouwt. Dit protocol beschrijft een procedure om de oogst interneuron precursoren van specifieke hersengebieden en verplant ze ofwel homotopically of heterotopically in de hersenen van postnatale pups.

Homochronic transplantatie van Interneuron precursoren in vroege postnatale muis hersenen

Dit protocol presenteert een unieke manier om celculturen van het centrale zenuwstelsel te genereren uit embryonale dag 17 muizenhersenen voor neuro(immuno)logisch onderzoek. Dit model kan worden geanalyseerd met behulp van verschillende experimentele technieken, waaronder RT-qPCR, microscopie, ELISA en flowcytometrie.

Het opzetten van gemengde neuronale en gliale celculturen van embryonale muizenhersenen om infectie en aangeboren immuniteit te bestuderen

Tijdens de ontwikkeling van de hersenschors ontstaan neuronen en gliacellen in de ventriculaire zone die het ventrikel bekleedt en migreren ze naar het hersenoppervlak. Bij dit proces zijn veel genen betrokken. Dit protocol introduceert de techniek voor de time-lapse beeldvorming van migrerende neuronen en glia-voorlopercellen.

Time-lapse beeldvorming van migrerende neuronen en glia-voorlopercellen in embryonale hersenplakjes van muizen

Leer embryonale neurogenese bestuderen in het muizenhindbrain met behulp van gehele orgaan- en histologische analyse. Deze methode helpt onderzoekers neuronale ontwikkeling in vivo te onderzoeken.

De muis Hindbrain als een Model voor het bestuderen van embryonale neurogenese

Meer video's verkennen