Name: Vastleggen van de kinetiek van de interactie van een ionkanaal eiwit met kleine moleculen door de Bio-laag interferometrie Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Leer de bio-laag interferometrie (BLI) assay om interacties tussen het hEAG1 ionkanaal en kleine moleculen zoals PIP2 te meten. Deze methode biedt een hoogdoorvoerbenadering voor ligandscreening met minimale hoeveelheden eiwit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Bio-ID Center en SJTU Cross-disciplinair onderzoeksfonds in geneeskunde en Engineering (YG2016QN66), National Natural Science Foundation of China (31271217), en nationale Basic Research programma van China (2014CB910304).

Opmerking: De HEK-293T-cellijn voortdurend uiting van vlag-gelabeld hEAG1 kanaal eiwit is gebouwd door transfecting een pCDH lentivirale plasmide met de opeenvolging van DNA van hEAG1 met een vlag in de distale C-terminus in HEK-293T cellen, gevolgd door de puromycin-resistente selectie15zoals hiervoor is beschreven.
1. affiniteit zuivering van vlag-gelabeld hEAG1 kanaal eiwit uit HEK-293T cellen
<ol><li>Ontdooi cellen stabiel hEAG1 kanalen van vloeibare stikstof te uiten in het warme water (37 ° C) snel. Beënt de cellen (ongeveer 5 x 106 bevroren cellen) in een 10 cm schotel. Groeien de cel overnachting in Dulbecco van bewerkt Eagle's (DMEM) medium aangevuld met 8 mL 10% foetale runderserum (FBS) 100 eenheden/mL penicilline, 100 μg/mL streptomycine, 4 mM L-glutamine en veranderde het medium de volgende dag.</li>
	<li>Controleer de GFP fluorescentie van deze cellen HEK-293T met behulp van een fluorescente microscoop om ervoor te zorgen dat het hoge percentage cellen express stabiel hEAG1 kanalen in het kweken systeem. Trypsinize exponentieel groeiende cellen met 1 mL van 0,25% trypsine voor 1 minuut bij kamertemperatuur en thenadd 2 mL serum-bevattende cultuur vloeistof te beëindigen van de spijsvertering. 400 μL van celsuspensie overbrengen in een 15 cm schotel met 15 mL van volledige DMEM medium. Bereidt gerechten, vier 15 cm in totaal.</li>
	<li>
Oogsten van deze cellen na 2-3 dagen cultuur wanneer de cellen op ongeveer 90 bereiken % confluentie.
	<ol>
<li>Verwijder het groeimedium uit de cellen en was ze twee keer met 4 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (1 x PBS, pH = 7.4).</li>
		<li>Gooi PBS na het wassen.</li>
		<li>Schraap de cellen in 2 mL 1 x PBS voor elk gerecht met behulp van cel schrapen en overdracht de geschraapt cellen met 1 mL Pipetteer in een tube van 15 mL.</li>
		<li>Centrifugeer de celsuspensie gedurende 5 minuten bij 420 x g bij 4 ° C.</li>
		<li>Decanteren en verwijder het supernatant.</li>
		<li>Resuspendeer de pellet cel in totaal 4 mL lysisbuffermengsel (10 mM HEPES, 1.5 mM MgCl2, 10 mM NaCl, 1% NP-40, pH 7.0, ingeperkt volledige proteaseinhibitor) gedurende 30 minuten op ijs en vortex grondig de lysate elke 10 min.</li>
		<li>Centrifugeer de cel lysate gedurende 10 minuten bij 12.000 x g bij 4 ° C.</li>
		<li>Het supernatant overbrengen in een tube van 5 mL en bewaar deze op ijs voor onmiddellijk gebruik.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
De hars Dizzee RASCAL M2 affiniteit voor te bereiden.
	<ol>
<li>Grondig schorten de hars (geleverd als een 50%-suspensie in winkel buffer) door zachte inversie om ervoor te zorgen dat de fles van Dizzee RASCAL M2 affiniteit gel is een uniforme opschorting van gel kralen.</li>
		<li>Onmiddellijk overdracht 400 μL van schorsing tot een gekoeld 1,5 mL koker.</li>
		<li>Centrifugeren van de suspensie voor 30 s bij 8, 000 x g bij 4 ° C en verwijder het supernatant zorgvuldig te wassen de buffer van de winkel.</li>
		<li>500 μL 1 x PBS toevoegen aan de hars en de pellet met 1 mL pipet op te schorten. Vervolgens het centrifugeren van de suspensie voor 30 s bij 8, 000 x g bij 4 ° C en gooi het supernatant PBS zorgvuldig. Herhaal deze wassen stap naar de opgeslagen buffer leeg.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voeg toe 500 μL eiwit extract supernatant bereid bij stap 1.3.8 tot de hars pellet op te schorten de pellet en spoel de suspensie tot een nieuwe gekoeld 5 mL koker. Herhaal deze stap opnieuw om ervoor te zorgen dat geen gel kralen links. Voeg de linker eiwit-extract aan het mengsel.</li>
	<li>Incubeer het mengsel 's nachts in een roteerapparaat bij 8 omwentelingen per minuut bij 4 ° C tot de vlag fusieproteïne te vangen.</li>
	<li>Centrifugeer het mengsel na 12u incubatie gedurende 10 min bij 1, 000 x g bij 4 ° C.</li>
	<li>Verwijder het supernatant en wassen van de pellet driemaal met 500 μL van 1 x PBS. Houd het op ijs voor onmiddellijk gebruik.</li>
	<li>
De vlag hEAG1 elutie eiwit met 3 x vlag peptide.
	<ol>
<li>3 X FLAG elutie oplossing voor te bereiden. Los op 3 X FLAG peptide in 500 μL stockoplossing (0.5 M Tris-HCl, 1 M NaCl, pH = 7,5) met een concentratie van 8 μg/μL.</li>
		<li>Voeg toe 10 μL 3 x vlag elutie oplossing aan 390 μL van PBS een 200 ng/μL eindconcentratie oplossing.</li>
		<li>400 μL van 3 x vlag elutie oplossing aan de gel kralen voorbereid op stap 1.8 toevoegen.</li>
		<li>Incubeer het monster in het roteerapparaat bij 8 omwentelingen per minuut gedurende 2 uur bij 4 ° C.</li>
		<li>Centrifugeer de hars voor 30 s bij 8, 000 x g.</li>
		<li>Het supernatant overbrengen in een verse 1,5 mL-buis en sla het bij 4 ° C voor onmiddellijk gebruik.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. concentratie Assay en bevestiging van gezuiverd vlag Fusion hEAG1 door BCA eiwit Assay Kit en het westelijke bevlekken
<ol><li>Bepaal de concentratie van gezuiverde eiwit met de BCA eiwit assay kit volgens de vervaardiging's instructie.</li>
	<li>Gebruik 30 μL steekproeven voor westelijke analyse om te bevestigen dat de proteïne van belang had gezuiverd met behulp van een antilichaam Anti-Flag als eerder beschreven15.</li>
</ol>3. het labelen van de gezuiverde kanaal eiwit met biotine voor de BLI Assay
<ol><li>Bereiden van 5 mg/mL stockoplossing van Biotine in PBS. Toevoegen voor elke test (twee biosensoren), een 3-voudig molaire overmaat van biotine op 20 μg gezuiverde proteïne te bereiken van een beter biotinylation van de N-terminal van de gezuiverde proteïne in PBS.</li>
	<li>Incubeer het monster in het donker in de ijskast voor minstens 30 min.</li>
	<li>Voorbereiding van de steekproef verdunning (SD)-buffer: PBS met 0,02% Polysorbaat 20 en 0,1% bovien serumalbumine (BSA, pH 7.4).</li>
	<li>Ultrafiltratie als u wilt wijzigen de buffer van de gezuiverde kanaal proteïne aan SD buffer uitvoeren De niet-afhankelijke Biotine verwijderen met behulp van ultrafiltratie apparaat met molecuulgewicht cutoff van 30 kDa, het toevoegen van de SD-buffer en centrifugeren van het monster van 12.000 x g, voor 10 min bij 4 ° C.</li>
	<li>Verwijder de ultrafiltrate uit de centrifugebuis van ultrafiltratie apparaat, 200 μl SD buffer in het filter apparaat toevoegen en centrifugeren het monster 12.000 x g gedurende 10 minuten bij 4° C. Herhaal deze handeling ten minste driemaal.</li>
	<li>Voor het verzamelen van de buffer uitgewisseld monster, omgekeerd invoegen het filter apparaat in een tube van 1,5 mL en centrifugeren hen bij 2.000 x g, gedurende 5 min bij 4 ° C. Houd het monster op het ijs voor onmiddellijk gebruik.</li>
</ol>4. bereiding van PIP2 oplossing Assay
<ol><li>De stockoplossing van PIP2 (1 mM) in gedeïoniseerd H2O bereiden door gedurende 30 minuten op ijs als eerder beschreven17sonicating. Bewaar de oplossing in glazen flesjes op-20 ° C en het verdund om de eindconcentraties onmiddellijk vóór experimenten door krachtige vortexing.</li>
</ol>5. BLI Assay
<ol><li>Schakel de apparatuur en controleren van het "instrument" statusvenster om te controleren of dat de machine is "ready" staat de apparatuur ten minste prewarm gedurende 30 minuten vóór de BLI-studie.</li>
	<li>Zorg ervoor dat de deur van het instrument is afgesloten alvorens de Data-acquisitie software te openen en kies de "nieuwe kinetiek Experiment" in de Experiment-Wizard.</li>
	<li>Definieer de putjes op de 96-wells-plaat door rechts te klikken om te kiezen van de buffer, belasting en monster worden gebruikt. Voor monster putten, de eenheid voor concentratie van biotinyleerd vlag hEAG1 fusieproteïne moet worden ingevoerd als molar (10 μg, 0.09 μM).</li>
	<li>Definieer de assay stappen, met inbegrip van de basislijn, laden, associatie en dissociatie. Kies een stap assay en tweevoudig tikken voort naar de desbetreffende kolom. Een duplicaat van assay definitie is ingesteld voor controle sensoren. Stel de rpm als 1.000. Kies 1 min voor basislijn stap en 5 – 10 min voor laden, associatie en dissociatie, respectievelijk. Het uitvoeren van de test bij kamertemperatuur (ongeveer 24 ° C). Opmerking: Er zijn twee belangrijke procedures: laden van het biotinyleerd kanaal eiwitten aan de sensoren en keuring van de interactie met klein molecuul verbindingen. Ze kunnen voortdurend worden overgegaan (basislijn, laden, basislijn, associatie en dissociatie). Als alternatief, ze kunnen worden overgegaan afzonderlijk om te voorkomen verspillen van de test-verbindingen als de eerste laden mislukt deel.</li>
	<li>Klik op de kolommen die de sensoren bevatten en klik op de "opvulling" om aan te geven van de locaties van sensoren in de lade van de sensor.</li>
	<li>Bekijk alle geplande stappen om te controleren op fouten en ga terug naar het corrigeren.</li>
	<li>Stel de locatie van gegevensbestanden en klik op "Go" om te beginnen met de test. Opmerking: De sensoren nodig prewetted gedurende ten minste 10 min. in SD buffer, als deze stap heeft gedaan, dan de instelling 'Uitgestelde start van het experiment' moet worden overgeslagen. Als dat niet het geval is, een 600 s vertraging instellen voordat de prewetting van de sensoren.</li>
	<li>Zet een zwarte 96-wells-plaat in de bodem van de lade en de hoek van de A1 van de plaat in de uitsparing in de lade legt de plaat plaats invoegen. Voor de putten voor het laden van de sensoren, voeg 200 μL van assay buffer per putje in 2 putten in rij A en 2 wells in rij B van de 96-wells-plaat.</li>
	<li>Bereiden een andere zwarte 96-wells-plaat als de monster-plaat en de putjes vullen met 200 μl SD buffer in rij B als besturingselement of biotinyleerd hEAG1 eiwit oplossing (10 μg) in rij A zoals tijdens de programmering in stap 5.3 toegewezen. Opmerking: Vermijd invoering van bubbels.</li>
	<li>Open het deurtje van het instrument en schuif de lade van de sensor en proef van de plaat in de linker en rechter plaat houder, respectievelijk. Controleer dat de sensor lade en monster plaat staan juist gebaseerd op de vorm van links plaat houder en "A1" markering op de hoogste juiste hoek van de juiste plaat houder. Sluit de deur en start van de test.</li>
</ol>6. de gegevensanalyse
<ol><li>Open de Data-analyse software en laadt u de map met de gegevens van de bepaling. Klik op "Verwerking" te krijgen in de menu-interface van de verwerking en zien we de kleurrijke rauwe kinetische bochten.</li>
	<li>Onder stap 1: "Gegevensselectie", klik op "Sensor selectie". Op de "Sensor lade #1", klik op de sensor putten alleen bevochtigd met SD buffer en klik met de rechtermuisknop op "Verandering Sensor Type" op "Reference Sensor". Op de ' Sample plaat kaart ", wijzen de alle de aspecifieke bindende putjes en klik met de rechtermuisknop op"Verandering goed Type"te"Goed referentie".</li>
	<li>Tik in het vak vóór "Aftrekken" van stap 2 en wijs 'Dubbele Reference'.</li>
	<li>In stap 3: "Align Y-as", selecteer "Baseline" als de uitlijning stap. Voer bij "tijdsbereik", de laatste 10 s van dat basislijn (d.w.z. uit: 0.1 tot: 59,8).</li>
	<li>In stap 4: "Inter stap Correction", selecteer "uitlijning op basislijn" om te minimaliseren van signaal verschuivingen tussen de associatie en dissociatie stappen.</li>
	<li>In stap 5: "Proces", selecteer Savitzky-Golay filter functie in de meeste gevallen en ga door "Procesgegevens".</li>
	<li>Ruwe gegevens worden opgeslagen voor verdere gegevensanalyse gebruikmaken van andere software in stap 7: "Resultaten opslaan".</li>
	<li>
Klik op "analyse | Curve-Fitting".
	<ol>
<li>Kies voor "Stap te analyseren", "vereniging | Dissociatie". Voor "Model", selecteert u 1:1. Opmerking: we kiezen voor 1:1 model omdat het goed op onze oorspronkelijke gegevens voorzien en de mogelijkheid van vermeden over montage onder 1:2 of 2:1 model te wijten aan hun grote vrijheid. Maar andere opties hier beschikbaar zijn en naar behoren kunnen worden gekozen voor de analyse van andere montage voor verschillende bindende modellen van de analyt.</li>
		<li>Kies voor "Montage", Global (volledig). Selecteer voor "Groeperen op", "Kleur". Selecteer "Rmax ontkoppeld door Sensor" dat onafhankelijke montage van maximale signaal reactie (Rmax).</li>
		<li>Klik op "Fit Curves!" om te beginnen met de niet-lineaire regressie-analyse. Vergelijking van de heuvel en enkele exponentiële functie werden gebruikt in onze studie.</li>
		<li>Klik op "gegevens exporteren | Rapport opslaan"om op te slaan resultaten passend. Of klik op "gegevens exporteren | Montage resultaten exporteren"om op te slaan van de ruwe gegevens voor verdere grafieken en gegevensanalyse met andere software.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Peetla, C., Stine, A., Labhasetwar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+Interactions+with+Model+Lipid+Membranes%3A+Applications+in+Drug+Discovery+and+Drug+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Biophysical Interactions with Model Lipid Membranes: Applications in Drug Discovery and Drug Delivery.</a> Mol. Pharm. 6 (5), 1264-1276 (2009).</li>
<li>van de Waterbeemd, H., Smith, D. A., Beaumont, K., Walker, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Property-based+design%3A+Optimization+of+drug+absorption+and+pharmacokinetics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Property-based design: Optimization of drug absorption and pharmacokinetics.</a> J. Med. Chem. 44 (9), 1313-1333 (2001).</li>
<li>Papo, N., Shai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+peptide+membrane+interaction+using+surface+plasmon+resonance%3A+Differentiation+between+pore+formation+versus+membrane+disruption+by+lytic+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Exploring peptide membrane interaction using surface plasmon resonance: Differentiation between pore formation versus membrane disruption by lytic peptides.</a> Biochemistry. 42 (2), 458-466 (2003).</li>
<li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nat. Commun. 1, 100-106 (2010).</li>
<li>Fechner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+does+matter%21+Label-free+detection+of+small+molecule-protein+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Size does matter! Label-free detection of small molecule-protein interaction.</a> Anal. Bioanal. Chem. 406 (17), 4033-4051 (2014).</li>
<li>Wallner, J., Lhota, G., Jeschek, D., Mader, A., Vorauer-Uhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Bio-Layer+Interferometry+for+the+analysis+of+protein%2Fliposome+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Biomed.+Anal%22%5BJournal%5D)">Application of Bio-Layer Interferometry for the analysis of protein/liposome interactions.</a> J. Pharm. Biomed. Anal. 72, 150-154 (2013).</li>
<li>Wartchow, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensor-based+small+molecule+fragment+screening+with+biolayer+interferometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comput.+Aided+Mol.+Des%22%5BJournal%5D)">Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry.</a> J. Comput. Aided Mol. Des. 25 (7), 669-676 (2011).</li>
<li>Ekiert, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Highly+Conserved+Neutralizing+Epitope+on+Group+2+Influenza+A+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Highly Conserved Neutralizing Epitope on Group 2 Influenza A Viruses.</a> Science. 333 (6044), 843-850 (2011).</li>
<li>Shah, N. B., Duncan, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-layer+Interferometry+for+Measuring+Kinetics+of+Protein-protein+Interactions+and+Allosteric+Ligand+Effects%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects.</a> J. Vis. Exp. (84), e51383(2014).</li>
<li>Occhiodoro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+a+human+ether-a-go-go+potassium+channel+expressed+in+myoblasts+at+the+onset+of+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Febs+Lett%22%5BJournal%5D)">Cloning of a human ether-a-go-go potassium channel expressed in myoblasts at the onset of fusion.</a> Febs Lett. 434 (1-2), 177-182 (1988).</li>
<li>Pardo, L. A., Stuhmer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eag1%3A+An+emerging+oncological+target%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+Res%22%5BJournal%5D)">Eag1: An emerging oncological target.</a> Cancer. Res. 68 (6), 1611-1613 (2008).</li>
<li>Simons, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+voltage-gated+potassium+channel+gene+KCNH1+cause+Temple-Baraitser+syndrome+and+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in the voltage-gated potassium channel gene KCNH1 cause Temple-Baraitser syndrome and epilepsy.</a> Nat. Genet. 47 (1), 73-77 (2015).</li>
<li>Kortum, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+KCNH1+and+ATP6V1B2+cause+Zimmermann-Laband+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in KCNH1 and ATP6V1B2 cause Zimmermann-Laband syndrome.</a> Nat. Genet. 47 (6), 661-667 (2015).</li>
<li>Han, B., Tokay, T., Zhang, G. M., Sun, P., Hou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eag1+K%2B+Channel%3A+Endogenous+Regulation+and+Functions+in+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Oxid.+Med.+Cell.+Longev%22%5BJournal%5D)">Eag1 K+ Channel: Endogenous Regulation and Functions in Nervous System.</a> Oxid. Med. Cell. Longev. 2017, (2017).</li>
<li>Han, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+EAG+channels+are+directly+modulated+by+PIP2+as+revealed+by+electrophysiological+and+optical+interference+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Human EAG channels are directly modulated by PIP2 as revealed by electrophysiological and optical interference investigations.</a> Sci. Rep. 6, (2016).</li>
<li>Do, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+determining+dynamic+binding+capacity+of+resins+for+the+purification+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PREP%22%5BJournal%5D)">A rapid method for determining dynamic binding capacity of resins for the purification of proteins.</a> PREP. 60 (2), 147-150 (2008).</li>
<li>Rohacs, T., Chen, J., Prestwich, G. D., Logothetis, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+specificities+of+inwardly+rectifying+K%2B+channels+for+phosphoinositides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Distinct specificities of inwardly rectifying K+ channels for phosphoinositides.</a> J. Biol. Chem. 274 (51), 36065-36072 (1999).</li>
<li>Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+many+drug+targets+are+there%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">How many drug targets are there?</a> Nat. Rev. Drug Discov. 5 (12), 993-996 (2006).</li>
<li>Suh, B. C., Hille, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIP2+is+a+necessary+cofactor+for+ion+channel+function%3A+How+and+why%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">PIP2 is a necessary cofactor for ion channel function: How and why?</a> Annu. Rev. Biophys. 37, 175-195 (2008).</li>
<li>Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+High-affinity+Antibody-antigen+Binding+Kinetics+Using+Four+Biosensor+Platforms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms.</a> J. Vis. Exp. (122), e55659(2017).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Ionenkanalen van de membraan zijn geverifieerd als de primaire therapeutische doelen van meer dan 13% van de op dit moment bekende medicijnen voor de behandeling van een verscheidenheid van ziekten bij de mens, met inbegrip van cardiovasculaire en neurologische stoornissen18. Patch-clamp opnemen, is de gouden standaard voor het meten van de functionele van ionenkanalen met kleine molecules, wijd verbeid gebruikt voor ion kanaal liganden screening. Echter niet kunnen dergelijke elektrofysiologische...

Gericht op de cel met kleine moleculen aan de oppervlak-toegankelijk ion kanaal eiwitten biedt een enorm potentieel voor de ligand screening en biologische drug discovery1,2,3. Zo nodig een passend instrument is voor de studie van de interactie tussen ionkanaal en kleine moleculen en hun corresponderende functies. De patch-clamp-opname heeft aangetoond een uniek en onvervangbaar techniek in ion kanaal functionele assay. Bepalen of de kleine molecules rechtstreeks richten ionenkanalen echter andere technologieën. Traditioneel, werd de radioactieve ligand bindende bepaling gebruikt voor het observeren van de kinetiek van de binding tussen klein molecuul en haar doel ion kanaal eiwit. Het gebruik van deze techniek is echter beperkt vanwege haar eis in radioactieve labeling en detectie. Bovendien, voorkomt de vereiste stap naar het label van de kleine ligand in de studie zijn gebruikt in vele soorten ionenkanalen zonder bekende specifieke ligand. Sommige label-vrije technieken zoals NMR spectroscopie, X-ray diffractie, microscale thermophoresis (MST)4 en oppervlakte plasmon resonantie (SPR) werden gebruikt voor het meten van de eiwit-kleine molecule interacties. Maar dit soort tests meestal niet voldoende informatie kunt verstrekken vanwege de moeilijkheid om de full-length eiwit, lage resolutie van dynamiek, lage doorvoersnelheid en hoge kosten5. In tegenstelling tot deze technieken, bio-laag Interferometry (BLI) ontpopt zich als een nieuwe label-vrije methodologie te overwinnen deze nadelen voor het opsporen van eiwit-kleine molecule interacties door immobilizing van een kleine hoeveelheid eiwitSteekproef op de oppervlakken van biosensor en het meten van de optische veranderende signalen6,7. Als een veelbelovende biosensor platform, BLI techniek is al uitgevoerd om te zien hoe de interactie van kleine moleculen met natuurlijke water oplosbare eiwitten zoals een menselijke monoklonale antistof CR80208 en de gedetailleerde bepaling procedure heeft gemeld in een vorige artikel9. Hoewel de belangrijke rol van ion kanaal eiwitten voor nieuwe therapeutische doelen ontdekking heeft erkend, is de ion kanaal eiwit-kleine molecule interactie bepaling op basis van BLI niet beschreven.
De mens Ether à go-go kanalen (hEAG1) worden uitgedrukt in verschillende types van kankercellen en centrale zenuwstelsel, waardoor het kanaal a potentiële therapeutische doel van veel kankers en neuronale stoornissen10,11, 12,13,14. Het elektrofysiologische studie in ons lab heeft bevestigd dat de remmende werking van phosphatidylinositol 4, 5-difosfaat (PIP2) op hEAG1 kanaal15. Op basis van onze resultaten, PIP2 testen direct interactie met de hEAG1 met behulp van BLI techniek kan worden als een model voor andere soorten ion kanaal eiwit-kleine molecule samengestelde interactie met name voor die kanalen ontbreken van specifieke liganden. Volgens de instructies van BLI assay, wij bereid biotinyleerd hEAG1 eiwitten en geïmmobiliseerd hen op het oppervlak van daar (SA) biosensor tips gevolgd door interactie hen naar PIP2 oplossingen voor het observeren van hun directe binding tussen de eiwitten en de lipide. Na het aanbrengen van PIP2 op het gecoate oppervlak van hEAG1 eiwit, de dikte van de laag aan de oppervlakte toeneemt, die direct correleert de spectrale verschuiving en kan worden gemeten in real-time16. De bindende kinetiek kan worden bepaald als gevolg van een positieve verschuiving in vereniging stap en een negatieve verschuiving in dissociatie stap. Volgens dit principe, we gezuiverd van het functionele hEAG1 ion kanaal eiwit van HEK-239T stabiele expressie systeem met behulp van affiniteit zuivering methode de functionele toestand in vitro te handhaven, dan de kinetiek van de binding van gemeten verschillende concentratie PIP2, en leverde een semblable kinetische gegevens zoals waargenomen in elektrofysiologische metingen15. De nauwe correspondentie tussen de resultaten van de BLI en elektrofysiologische metingen tonen voor het eerst de geschiktheid van BLI als een passende analytische tool voor ion kanaal membraan eiwit-kleine molecule interactie.

<table><tbody><tr><td>DMEM/High Glucose Medium</td><td>HyClone</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (1x)</td><td>HyClone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>1697550</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Dish</td><td>Corning</td><td>430599</td><td>150 mm X 25 mm</td></tr><tr><td>Nonidet P-40 Substitute</td><td>Amresco</td><td>E109</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>BBI Life Sciences</td><td>A610476</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>BBI Life Sciences</td><td>A610440</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>BBI Life Sciences</td><td>A600332</td><td></td></tr><tr><td>Polyoxyethylene-20-Sorbitan Monolaurate</td><td>BBI Life Sciences</td><td>A600560</td><td></td></tr><tr><td>ANTI-FLAG M2 Affinity Gel</td><td>Sigma</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>3x FLAG peptide</td><td>Sigma</td><td>F4799</td><td></td></tr><tr><td>Octet-RED96</td><td>Pall/FortéBio</td><td>30-5048</td><td></td></tr><tr><td>Data Acquisition software</td><td>Pall/FortéBio</td><td>Version 7.1</td><td></td></tr><tr><td>Data Analysis software</td><td>Pall/FortéBio</td><td>Version 7.1</td><td></td></tr><tr><td>Biosensor/Streptavidin</td><td>Pall/FortéBio</td><td>18-5019</td><td></td></tr><tr><td>Microtiter plate</td><td>Greiner Bio-one</td><td>655209</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin</td><td>ThermoFisher</td><td>21338</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugal Machine</td><td>ThermoFisher</td><td>75004250</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Prestained Protein Ladder</td><td>ThermoScientific</td><td>318120</td><td></td></tr><tr><td>Ultrafiltration device</td><td>MILLIPORE</td><td>UFC503008</td><td>NMWL of 30 kDa</td></tr><tr><td>phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2)</td><td>Sigma</td><td>P9763</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody</td><td>Sigma</td><td>F1804</td><td>1:2000 dilution</td></tr><tr><td>goat anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2005</td><td>1:5000 dilution</td></tr><tr><td>Enhanced BCA Protein Assay Kit</td><td>Beyotime</td><td>P0010</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td><td>Roche</td><td>04693159001</td><td></td></tr><tr><td>Amersham Imager 600 Imaging System</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Western blot system</td><td>BIO-RAD</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

vastleggen van de kinetiek van de interactie van een ionkanaal eiwit met kleine moleculen door de bio-laag interferometrie assay

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

De bio-laag interferometrie (BLI) bepaling is een waardevol instrument voor het meten van de eiwit-eiwit en eiwit-kleine molecule interacties. Hier beschrijven we eerst de toepassing van dit nieuwe etiket-vrije techniek op de studie van de interactie tussen menselijke EAG1 (hEAG1) kanaal eiwitten met de kleine molecuul PIP2. hEAG1 kanaal is erkend als potentieel therapeutisch doel vanwege zijn afwijkende overexpressie in kanker en enkele winst-van-functie mutaties die betrokken zijn bij sommige soorten neurologische ziekten. We gezuiverd hEAG1 kanaal eiwitten uit een zoogdieren stabiele expressie-systeem en de interactie met PIP2 door BLI gemeten. De succesvolle meting van de kinetiek van de binding tussen hEAG1 eiwit en PIP2 toont aan dat de bepaling BLI een potentiële hoge gegevensdoorvoer aanpak gebruikt voor nieuwe kleine-molecuul ligand screening in ion kanaal farmacologie is.

We de vlag hEAG1 kanaal fusieproteïne van HEK-293T cellen stabiel overexpressie hEAG1 gezuiverd. De functie van deze fusieproteïne is aangetoond met behulp van de patch-clamp-methode en de kwaliteit en de specificiteit van gezuiverde eiwit worden bevestigd door westelijke vlek (Figuur 1). De gezuiverde kanaal eiwit is biotinyleerd voor het uitvoeren van een bepaling van de interactie met de lipiden (PIP2) met behulp van de real-time BLI assay. De B...

Het protocol hier beschrijft de interacties van gezuiverde hEAG1 ion kanaal eiwit met de kleine molecuul lipide ligand phosphatidylinositol 4, 5-difosfaat (PIP2). De meting toont aan dat BLI zou een mogelijke methode voor nieuwe kleine-molecuul ion kanaal ligand screening.

Vastleggen van de kinetiek van de interactie van een ionkanaal eiwit met kleine moleculen door de Bio-laag interferometrie Assay

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Het algemene doel van deze bio-layer interferentie of BLI-test is om de mogelijke interactie tussen gezuiverd hEAG1-ionkanaaleiwit en kleine molecuullipiden te meten. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het gebied van ionkanaalfarmacologie te beantwoorden, zoals of de kleine molecuul van belang direct kan interageren met dit ionkanaal en wat de kinetiek van de interactie is? Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een arbeidsvrije en hoge doorvoermethode is.Er is slechts een kleine hoeveelheid geïmmobiliseerd eiwit nodig. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat een succesvolle test meerdere stappen omvat, waaronder eiwitexpressie, zuivering, labelen, nauwkeurig afgesteld sensor en data-analyse. Na het kweken van HEK293 T-cellen die stabiel hEAG1 expresseren gedurende twee tot drie dagen, oogst de cellen door het groeimedium te verwijderen en gebruik vier milliliter PBS om de cellen tweemaal te wassen.Gooi de PBS weg. Schrap de cellen in twee milliliter PBS per schaal en gebruik een ene milliliter pipet om de cellen in een 15 milliliter buis over te brengen. Centrifugeer de celsuspensie bij 420 keer de zwaartekra

capturing-interaction-kinetics-an-ion-channel-protein-with-small

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

In this video, we demonstrate biolayer interferometry (BLI) technology to detect the intermolecular interactions between ligands and target analytes in real-time. BLI measures changes in the interference pattern of white light reflected off a layer of immobilized ligands on a biosensor surface as they interact with analytes in solution.

Biolayer Interferometry Technology to Detect Interactions between Ligand and Analyte

De protocollen beschrijven hier kinetische analyses van eiwit-eiwit interacties met Bio-layer interferometrie. F type ATP synthase, dat betrokken is bij de cellulaire energiemetabolisme, kan worden geremd door de ε subeenheid in bacteriën. We hebben Bio-layer interferometrie aangepast aan interacties van de katalytische complex studeren met remmende C-terminale domein ε's.

Bio-layer interferometrie voor het meten van kinetiek van eiwit-eiwit interacties en Allosteric Ligand Effects

Hier presenteren we een protocol voor het controleren van de montage en demontage van de toxine van de bloedzweer met behulp van biolayer interferometrie (BLI). Na montage/demontage op de biosensor oppervlak, de grote eiwitcomplexen worden vrijgegeven uit het oppervlak voor visualisatie en identificatie van onderdelen van de complexen met behulp van elektronenmicroscopie en massaspectrometrie, respectievelijk.

Analyseren van de dynamische eiwitcomplexen op gemonteerd en vrijgelaten uit Biolayer interferometrie Biosensor met behulp van spectrometrie van de massa en elektronenmicroscopie

Interacties van transcriptiefactoren (TFs) met de RNA-polymerase worden meestal bestudeerd met behulp van keuze assays. We passen een Biolayer interferometrie (BLI) technologie toe om de interactie van GrgA met de chlamydiale RNA-polymerase te karakteriseren. Vergeleken met keuze assays, bli detecteert real-time associatie en dissociatie, biedt een hogere gevoeligheid, en is zeer kwantitatief.

Toepassing van Biolayer interferometrie (BLI) voor het bestuderen van eiwit-eiwit interacties in transcriptie

Dit protocol beschrijft hoe TIRF-microscopie kan worden gebruikt om individuele ionkanalen te volgen en hun activiteit in ondersteunde lipidemembranen te bepalen, waardoor het samenspel tussen laterale membraanbeweging en kanaalfunctie wordt gedefinieerd. Het beschrijft hoe de membranen moeten worden voorbereid, de gegevens moeten worden vastgelegd en de resultaten moeten worden geanalyseerd.

Single-Molecule Imaging van Laterale Mobiliteit en Ion Channel Activity in Lipid Bilayers met behulp van Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopie

Dit artikel beschrijft een protocol voor het bestuderen van DNA-eiwitinteracties met behulp van een op streptavidine gebaseerd biolaaginterferometrie (BLI) systeem. Het schetst de essentiële stappen en overwegingen voor het gebruik van basis- of geavanceerde bindingskinetiek om de evenwichtsbindingsaffiniteit (KD) van de interactie te bepalen.

Analyse van DNA-eiwitinteracties met op streptavidine gebaseerde biolaaginterferometrie

De interactie tussen HCN kanalen en hun ondersteunende subunit is geïdentificeerd als een therapeutisch doel in depressieve stoornis. Hier wordt een fluorescentie-polarisatie- methode voor het identificeren van kleinmoleculige remmers van dit eiwit-eiwit interactie, gepresenteerd.

Methode voor het identificeren van kleinmoleculige remmers van het eiwit-eiwit interactie tussen HCN1 en TRIP8b

Eiwit-eiwit interacties kunnen zowel in de kern als in het cytoplasma van een cel optreden. Om deze interacties te onderzoeken, worden traditionele co-immunoprecipitatie en moderne proximity ligatie-assay toegepast. In deze studie vergelijken we deze twee methoden om de verdeling van NF90-RBM3 interacties in de kern en het cytoplasma te visualiseren.

Visualisatie van eiwit-eiwit interacties in nucleaire en cytoplasmatische fracties door Co-immunoprecipitatie en<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity Ligatie Assay

We beschrijven de gedetailleerde procedures en de strategieën voor het meten van de mechanische eigenschappen en mechanische ontvouwen trajecten van één eiwitmolecules met behulp van een atomic force microscope. We tonen ook representatieve resultaten als een referentie voor selectie en motivering van goed één eiwit molecuul opnames.

Kracht spectroscopie van één eiwitmolecules met behulp van een Atomic Force Microscope

Mechanosensitive ionenkanalen worden vaak bestudeerd in termen van vloeistof stroom/schuifspanning kracht gevoeligheid met patch-clamp opname. Afhankelijk van het experimentele protocol, kan de uitkomst op vloeistof stroom-Reglement van ionenkanalen echter onjuist. Hier, bieden wij methoden voor het voorkomen en corrigeren van dergelijke fouten met een theoretische basis.

Meting van de concentratie van de Ion in de ongemengde grenslaag met Open Patch-Clamp pipet: gevolgen in de controle van de ionenkanalen door Fluid Flow

Leer de bio-laag interferometrie (BLI) assay om interacties tussen het hEAG1 ionkanaal en kleine moleculen zoals PIP2 te meten. Deze methode biedt een hoogdoorvoerbenadering voor ligandscreening met minimale hoeveelheden eiwit.

Vastleggen van de kinetiek van de interactie van een ionkanaal eiwit met kleine moleculen door de Bio-laag interferometrie Assay (Video) | JoVE Journal

Vastleggen van de kinetiek van de interactie van een ionkanaal eiwit met kleine moleculen door de Bio-laag interferometrie Assay

Meer video's verkennen