Vastleggen van de kinetiek van de interactie van een ionkanaal eiwit met kleine moleculen door de Bio-laag interferometrie Assay
7 maart 2018
Het protocol hier beschrijft de interacties van gezuiverde hEAG1 ion kanaal eiwit met de kleine molecuul lipide ligand phosphatidylinositol 4, 5-difosfaat (PIP2). De meting toont aan dat BLI zou een mogelijke methode voor nieuwe kleine-molecuul ion kanaal ligand screening.
Het algemene doel van deze bio-layer interferentie of BLI-test is om de mogelijke interactie tussen gezuiverd hEAG1-ionkanaaleiwit en kleine molecuullipiden te meten. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het gebied van ionkanaalfarmacologie te beantwoorden, zoals of de kleine molecuul van belang direct kan interageren met dit ionkanaal en wat de kinetiek van de interactie is? Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een arbeidsvrije en hoge doorvoermethode is.
Er is slechts een kleine hoeveelheid geïmmobiliseerd eiwit nodig. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat een succesvolle test meerdere stappen omvat, waaronder eiwitexpressie, zuivering, labelen, nauwkeurig afgesteld sensor en data-analyse. Na het kweken van HEK293 T-cellen die stabiel hEAG1 expresseren gedurende twee tot drie dagen, oogst de cellen door het groeimedium te verwijderen en gebruik vier milliliter PBS om de cellen tweemaal te wassen.
Gooi de PBS weg. Schrap de cellen in twee milliliter PBS per schaal en gebruik een ene milliliter pipet om de cellen in een 15 milliliter buis over te brengen. Centrifugeer de celsuspensie bij 420 keer de zwaartekracht en vier graden Celsius gedurende vijf minuten.
Decanteer vervolgens de supernatant en gebruik vier milliliter lysbufer om de pellet op te schorsen. Incubeer de suspensie op ijs gedurende 30 minuten, terwijl je het lysate elke 10 minuten grondig vortext. Centrifugeer vervolgens de cellysaat bij 12.000 keer de zwaartekracht en vier graden Celsius gedurende 10 minuten.
Breng vervolgens de supernatant over naar een vijf milliliter buis en bewaar het op ijs voor onmiddellijk gebruik. Om de anti-FLAG M2 affiniteithars voor te bereiden, schorste de hars grondig door voorzichtig om te keren om ervoor te zorgen dat de fles met anti-FLAG M2 affiniteit gel een uniforme suspensie van gelkralen is. Breng onmiddellijk 400 microliter suspensie over naar een gekoelde 1,5 milliliter buis.
Centrifugeer vervolgens de suspensie bij 8.000 keer de zwaartekracht en vier graden Celsius gedurende 30 seconden en gooi voorzichtig de supernatant weg om de opslagoplossing weg te spoelen. Om de harspellet te hersuspenderen, voeg 500 microliter eiwitextractsupernatant toe aan de hars en breng de suspensie over in een nieuwe, gekoelde, vijf milliliter buis. Pipetteer een extra 500 microliter eiwitextract in de originele buis om eventuele resterende kralen te verzamelen en breng het extract over naar de vijf milliliter buis.
Incubeer het mengsel op een shaker bij acht rpm en vier graden Celsius gedurende de nacht om het FLAG-fusie-eiwit aan de hars te binden. Centrifugeer vervolgens het mengsel bij 1.000 keer de zwaartekracht bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Gooi de supernatant weg en was de pellet drie keer met 500 microliter van een x PBS.
Bewaar het op ijs voor onmiddellijk gebruik. Voeg 10 microliter van drie x FLAG elutieoplossing toe aan 390 microliter PBS voor een uiteindelijke concentratie van 200 nanogram per microliter. Voeg vervolgens 400 microliter van drie x FLAG elutieoplossing toe aan de eerder bereide gelkralen.
Incubeer het monster op een schuddende incubator bij acht rpm en vier graden Celsius gedurende twee uur. Centrifugeer vervolgens de hars bij 8000 keer de zwaartekracht gedurende 30 seconden. Breng de supernatant over naar een nieuwe 1,5 milliliter buis en bewaar het bij vier graden Celsius voor onmiddellijk gebruik.
Gebruik de BCA-eiwittest volgens de instructies van de fabrikant om de concentratie van het gezuiverde eiwit te bepalen. Gebruik vervolgens een 30 microliter monster voor Western Blot-analyse met een anti-Flag-antilichaam om te bevestigen dat het eiwit van belang gezuiverd is. Om het gezuiverde eiwit met biotin te labelen, bereid vijf milligram per milliliter biotin-oplossing in PBS voor.
Voeg voor elke test van twee biosensoren een driemaal molaire overmaat van biotin toe aan 20 microgram gezuiverd eiwit om een voorkeur N-terminale biotinylering van het gezuiverde eiwit in PBS te bereiken. Incubeer het monster in het donker op ijs gedurende ten minste 30 minuten. Om de ongebonden biotin en buffer te verwijderen, wissel het eiwit in SD-buffer.
Breng het eiwit over naar een ultrafiltratieapparaat met een moleculaire afsnijding van 30 kilodalton. Voeg vervolgens SD-buffer toe en centrifugeer de monster bij 12.000 keer de zwaartekracht en vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Verwijder het ultrafiltraat van de centrifugeerbuis.
Voeg 200 microliter SD-buffer toe aan het filterapparaat en centrifugeer het monster opnieuw. Herhaal het proces minimaal drie keer. Verzamel het buffer-uitwisselingsmonster door het filtratieapparaat om te draaien en plaats het in een 1,5 milliliter buis.
Centrifugeer het monster bij 2.000 keer de zwaartekracht en vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Houd het monster op ijs voor onmiddellijk gebruik. Om de BLI-test uit te voeren, verwarm het apparaat 30 minuten voorafgaand aan de studie voor door het instrument in te schakelen.
Controleer het statusvenster van het instrument om te bevestigen dat de machine in de gereedstaat is voordat u begint. Zorg ervoor dat de deur van het instrument gesloten is voordat u de data-acquisitiesoftware opent en kies in de experimentwizard de New Kinetics Experiment. Definieer de putten die op de 96-puttenplaat worden gebruikt door met de rechtermuisknop te klikken om de buffer, de lading en het monster te kiezen.
Voor monstersputten moet de concentratie-eenheid van PIP2 worden ingevoerd als molars. Om de teststappen te definiëren, kies een stap en dubbelklik op de respectieve kolom. Een duplicaat van de testdefinitie wordt ingesteld voor de controlesensoren.
Stel de rpm op 1.000. Kies een minuut voor de basislijnstap en vijf tot 10 minuten voor lading, associatie en dissociatie respectievelijk. Voer de test uit bij kamertemperatuur.
Klik op de kolommen die de sensoren bevatten en klik op vullen om de locatie van de sensoren in de sensorlade aan te geven. Bekijk alle geplande stappen om fouten te
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft de interactie van het gezuiverde hEAG1-ionkanaaleiwit met het lipideligand fosfatidylinositol 4, 5-bisfosfaat (PIP2). De bio-layer interferometrie (BLI)-assay wordt belicht als een potentiële methode voor het screenen van nieuwe kleine molecuul-ionkanaalliganden.
Belangrijkste Onderdeel van de Studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Ionkanaalfarmacologie
- Biofysische methoden
- Ligand-eiwitinteracties
Achtergrond
- hEAG1 is een type ionkanaalprotein.
- Kleine moleculaire lipiden kunnen de activiteit van ionkanalen beïnvloeden.
- Het begrijpen van deze interacties is cruciaal voor de ontwikkeling van geneesmiddelen.
- BLI is een high-throughput methode die minimale hoeveelheden monster vereist.
Doel van de studie
- Om interacties tussen hEAG1 en PIP2 te meten.
- Om de kinetiek van deze interacties te onderzoeken.
- Om de haalbaarheid van BLI voor ligandscreening te beoordelen.
Gebruikte methoden
- Bio-layer interferometrie (BLI) assay.
- Zuivering van het hEAG1-ionkanaaleiwit.
- Bereiding van kleine moleculaire lipideliganden.
- Data-analyse voor interactiekinetiek.
Belangrijkste resultaten
- Aantoonde interactie tussen hEAG1 en PIP2.
- Bood inzichten in de kinetiek van de interactie.
- Valideerde BLI als methode voor ligandscreening.
- Benadrukte de voordelen van het gebruik van minimale eiwithoeveelheden.
Conclusies
- BLI is een veelbelovende tool voor het bestuderen van interacties van ionkanalen.
- Interacties met kleine moleculen kunnen effectief worden gemeten.
- Deze aanpak kan de drug discovery in de ionkanaalfarmacologie faciliteren.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Bio-layer interferometrie (BLI) maakt snelle, labelvrije kwantificering van interacties tussen ionkanalen en kleine moleculen mogelijk, wat direct bijdraagt aan targetvalidatie in een vroeg stadium en mechanische risicoreductie bij de ontwikkeling van geneesmiddelen voor ionkanalen. Door de real-time bindingskinetiek tussen gezuiverd hEAG1 en PIP2 vast te leggen, biedt deze workflow bruikbare gegevens voor portfolio-triage en de prioritering van ligand-screeningcampagnes. Deze aanpak is bijzonder relevant voor oncologische en neurologische ziekteprogramma's die zich richten op aberrante ionkanaalactiviteit.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt directe meting van de bindingskinetiek tussen ionkanalen en potentiële kleine moleculen mogelijk.
- Ondersteunt functionele targetvalidatie door ligandbinding met gezuiverd hEAG1 te bevestigen.
- Biedt mechanistische risicoreductie door het kwantificeren van evenwichtdissociatieconstanten.
- Vergemakkelijkt voorspellend vertrouwen in target-ligandinteracties voor de verdere ontwikkeling van de portfolio.
Screening & assayontwikkeling
- Biedt een high-throughput, labelvrij assay-formaat dat geschikt is voor schaalbare ligandscreening.
- Vereist een minimale hoeveelheid eiwit, waardoor het gebruik van resources in vroege screeningworkflows wordt geoptimaliseerd.
- Genereert kwantitatieve, reproduceerbare kinetische gegevens voor assay-standaardisatie.
- Maakt een snelle vergelijking van bindingsprofielen van verbindingen mogelijk om het ontwerp van de screening-funnel te informeren.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij ziekterelateerde ionkanaaldoelen die betrokken zijn bij kanker en neurologische aandoeningen.
- Zorgt voor continuïteit van biofysische bindingsgegevens naar downstream functionele assays, zoals patch clamp.
- Ondersteunt de risico-gecorrigeerde voortgang van kandidaatliganden naar preklinische validatie.
- Biedt voorspellende waarde voor de ontwikkeling van translationele biomarkers wanneer dit wordt geïntegreerd met functionele read-outs.
Integratie van pipeline en workflow
Deze op BLI gebaseerde kinetische assay bevindt zich op het snijvlak van vroege ontdekking en lead-identificatie, waarmee biofysische targetvalidatie wordt verbonden met downstream functionele en translationele studies.
- Discovery Biology: Kwantificeert directe target-ligand interacties om mechanistische hypothesen te verduidelijken.
- Screening: Biedt een schaalbaar, reproduceerbaar platform voor initiële ligand-triage en hit-validatie.
- Analytics: Levert kinetische parameters en evenwichtsconstanten voor een robuuste vergelijking tussen verschillende condities.
- Translationeel onderzoek: Legt de basis voor het koppelen van bindingsgegevens aan ziekterelevante functionele resultaten.
- Bedrijfsmatige herutilisatie: Vestigt een herbruikbaar assay-platform voor diverse ionkanaal-targets en ligandklassen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij target-interactie.
- Operationele waarde: Stroomlijnt de opzet van assays met minimale eiwitvereisten en een snelle doorlooptijd.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go besluitvorming en kapitaalallocatie in de vroege ontdekkingsfase.
- Impact op portfolio: Maakt risicogebaseerde prioritering van ionkanaalprogramma's mogelijk op basis van kwantitatieve bindingsgegevens.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in eiwitzuivering, biotinylering en BLI-instrumentatie.
- Vraagt om toegang tot analytische infrastructuur voor real-time kinetische metingen en data-analyse.
- Standaardisatie van assaystappen en controles is cruciaal voor reproduceerbaarheid tussen teams.
- Aanpassingen kunnen nodig zijn voor verschillende ionkanaal-targets of ligandklassen.
- Een zorgvuldige controle van de assay-opzet en de stappen voor data-acquisitie is essentieel om procedurele fouten te vermijden.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:04
Title
1:01
Affinity Purification of FLAG-tagged hEAG1 Channel Protein from HEK-293 Cells
4:18
BCA Assay, Western Blotting, and Labeling the Purified Protein with Biotin for the BLI Assay
6:10
Bio-layer Interferometry Assay
8:06
Results: Interaction Kinetics of hEAG1 with PIP2 Using the Bio-layer Interferometry Assay
9:35
Conclusion
