Eiwitkristallisatie, het verkrijgen van een vast rooster van biomoleculen, verduidelijkt de eiwitstructuur en maakt het mogelijk om de eiwitfunctie te bestuderen. Kristallisatie omvat het drogen van gezuiverd eiwit onder een combinatie van vele factoren, waaronder pH, temperatuur, ionensterkte en eiwitconcentratie. Zodra kristallen zijn verkregen, kan de eiwitstructuur worden verduidelijkt door middel van röntgendiffractie en berekening van een elektronen dichtheidsmodel.
Deze video introduceert eiwitkristallisatie en toont een algemene procedure. Eiwitexpressie en zuivering, kristallisatie en röntgendiffractie worden in de procedure behandeld. Toepassingen van eiwitkristallisatie omvatten in silico geneesmiddelontwerp, bindingsplaatsbepaling en membraaneiwitstructuuranalyse.
Eiwitkristallisatie, het verkrijgen van een vast rooster van biomoleculen, verduidelijkt eiwitstructuur en maakt de studie van eiwitfunctie mogelijk. Kristallisatie omvat het drogen van gezuiverd eiwit onder een combinatie van vele factoren, waaronder pH, temperatuur, ionische sterkte en eiwitconcentratie. Zodra kristallen zijn verkregen, kan de eiwitstructuur worden verduidelijkt door röntgendiffractie en berekening van een elektronendichtheidsmodel.
Deze video introduceert eiwitkristallisatie en toont een algemene procedure. Eiwitexpressie en -zuivering, kristallisatie en röntgendiffractie komen in de procedure aan bod. Toepassingen van eiwitkristallisatie omvatten in silico geneesmiddelontwerp, bindingsplaatsbepaling en membraaneiwitstructuuranalyse.
Eiwitkristallisatie is het proces van het verkrijgen van een gekristalliseerde vaste vorm van een eiwit. Deze kristallen zijn vooral waardevol voor structurele biologen en helpen bij de studie van eiwitfunctie. Andere technieken, zoals massaspectrometrie of SDS-PAGE, kunnen alleen informatie verschaffen over de eendimensionale structuur van eiwitten. Eiwitkristallisatie wordt aangevuld door de technieken van recombinante eiwitexpressie en röntgendiffractie. Deze video zal de principes van eiwitkristallisatie, een algemene laboratoriumprocedure en verschillende toepassingen ervan op het gebied van biochemie laten zien.
De eerste stap die vereist is in het proces is het verkrijgen van milligramhoeveelheden zeer zuiver eiwit, meestal door middel van recombinante eiwitexpressie. Het gen dat overeenkomt met het eiwit van belang wordt gekloond in een expressievector, en het geëxpresseerde eiwit wordt gefuseerd met een affiniteitstag, zoals poly-histidine, om de zuivering door affiniteitschromatografie te vergemakkelijken. Voor meer informatie, zie de video over affiniteitschromatografie in deze collectie.
De vorming van het gezuiverde eiwit tot kristallen is afhankelijk van de juiste combinatie van vele factoren, waaronder pH, ionische sterkte, concentraties van precipitant en eiwit, temperatuur en snelheid van gelijkgewicht. De meest gebruikte methode is dampdiffusie, waarvan er twee categorieën zijn: hangende druppel en zittende druppel. Een druppeltje dat zuiver eiwit, buffer en precipitant bevat, wat een ionische vaste stof is die watermoleculen bindt, waardoor de beschikbaarheid van water voor het eiwit wordt verminderd en een hogere eiwitconcentratie wordt nagebootst, bevindt zich in een gesloten microputje met een reservoir met een meer geconcentreerde mix van dezelfde buffer en precipitant. Aan het begin zijn de concentraties van eiwit en precipitant te laag om kristallisatie te veroorzaken. Tijdens het verloop van het experiment verdampt het water uit de druppel en verzamelt zich in het reservoir; een afname van de hoeveelheid water in de druppel veroorzaakt dat het systeem oververzadigd raakt, en nucleatie, gevolgd door kristallisatie, kan optreden. De netto overdracht van water uit de druppel is in evenwicht, en het systeem wordt gehandhaafd totdat het proces voltooid is.
Om de 3D-structuur te visualiseren, wordt röntgendiffractie gebruikt. Om röntgendata van een kristal te verkrijgen, wordt het in een monochromatische röntgenstraal geplaatst, waarbij het onder alle hoeken aan de straal wordt blootgesteld. Elke belichting levert een beeld op, waarbij elke stip een gediffracteerde röntgenstraal is, die uit het kristal komt en wordt geregistreerd door een detector. De gegevens worden gecombineerd om een model van de rangschikking van atomen binnen het kristal te produceren. De resulterende kristalstructuur toont de 3-dimensionale plaatsing van de atomen, met een typische resolutie van 2 angstroms.
Nu we de principes van eiwitkristallisatie hebben behandeld, laten we een gegeneraliseerd protocol bekijken.
Om de procedure te beginnen, wordt een expressievector met het gen van belang in cellen getransformeerd. De cellen worden geïncubeerd en in de middenlogfase wordt de expressie geïnitieerd door een inductor toe te voegen, zoals IPTG, die de transcriptie van het mRNA van het gen activeert. Na eiwitexpressie wordt het ruwe materiaal gesuspendeerd in lysisbuffer en vervolgens door centrifugatie geklaard.
Het geklaarde lysate wordt vervolgens geladen op een nikkelkolom, en het polyhistidin-gelabelde eiwit bindt aan de kolom terwijl alle andere biomoleculen worden weggespoeld.
Zodra enkele milligrammen zuiver eiwit zijn verkregen, is het klaar voor kristallisatie door middel van dampdiffusie. Een 24-well hangende/zittende druppelbak wordt gevuld met verschillende concentraties natriumchloride en natriumacetaatbufferoplossingen. Voor de zittende druppelmethode worden gelijke volumes eiwit en reservoiroplossing gepipetteerd op de plank boven elke put, en vervolgens wordt de bak bedekt met transparant plakband. De bak wordt vervolgens in een incubatiekamer geplaatst en de putten worden de volgende dag en vervolgens om de paar dagen gecontroleerd op groei.
Zodra een geschikt kristal is verkregen, is het klaar voor röntgendiffractieanalyse. Het kristal wordt op een goniometer gemonteerd om het kristal in geselecteerde oriëntaties te plaatsen. Het kristal wordt verlicht met een monochromatische bundel röntgenstralen onder alle hoeken, waardoor een diffractiepatroon wordt geproduceerd. De software zet de tweedimensionale beelden, genomen in verschillende oriëntaties, om in een driedimensionaal model van de dichtheid van elektronen binnen het kristal door de posities van de atomen in het kristal te bepalen.
Nu we een procedure hebben besproken, laten we enkele nuttige toepassingen van eiwitkristallisatie en een andere kristallisatietechniek bekijken.
Eiwitkristallisatie kan worden gebruikt voor in silico geneesmiddelontwerp. De driedimensionale structuur van het polymerase-basiseiwit 2 van het influenzavirus, dat is gelinkt aan virale infectie bij zoogdieren, werd bepaald door kristallisatie en röntgendiffractie. Potentiële bindingsplaatsen in het eiwit worden gevisualiseerd, en met behulp van een dockingprogramma werd een driedimensionaal molecuul ontworpen dat in een kloof in het eiwit zou kunnen worden geplaatst.
Co-kristallisatie van eiwit-DNA-complexen is ook een nuttige techni
Eiwitkristallisatie, het verkrijgen van een vast rooster van biomoleculen, verduidelijkt de eiwitstructuur en maakt het mogelijk om de eiwitfunctie te bestuderen. Kristallisatie omvat het drogen van gezuiverd eiwit onder een combinatie van vele factoren, waaronder pH, temperatuur, ionensterkte en eiwitconcentratie. Zodra kristallen zijn verkregen, kan de eiwitstructuur worden verduidelijkt door middel van röntgendiffractie en berekening van een elektronen dichtheidsmodel.
Deze video introduceert eiwitkristallisatie en toont een algemene procedure. Eiwitexpressie en zuivering, kristallisatie en röntgendiffractie worden in de procedure behandeld. Toepassingen van eiwitkristallisatie omvatten in silico geneesmiddelontwerp, bindingsplaatsbepaling en membraaneiwitstructuuranalyse.
Eiwitkristallisatie is het proces van het verkrijgen van een gerammelde vaste vorm van een eiwit. Deze kristallen zijn vooral waardevol voor structurele biologen en helpen bij de studie van eiwitfunctie. Andere technieken, zoals massaspectrometrie of SDS-PAGE, kunnen alleen informatie geven over de eendimensionale structuur van eiwitten. Eiwitkristallisatie wordt aangevuld met de technieken van recombinante eiwitexpressie en röntgendiffractie. Deze video zal de principes van eiwitkristallisatie, een algemene laboratoriumprocedure en verschillende toepassingen in het biochemische veld laten zien.
De eerste stap die vereist is in het proces is het verkrijgen van milligram hoeveelheden van zeer zuiver eiwit, meestal door recombinante eiwitexpressie. Het gen dat overeenkomt met het eiwit van belang wordt gekloond in een expressievector, en het uitgedrukte eiwit wordt gefuseerd met een affiniteitstag, zoals poly-histidine, om te helpen bij de zuivering door affiniteitschromatografie. Om meer te leren, zie de video over affiniteitschromatografie in deze collectie.
De vorming van het gezuiverde eiwit in kristallen is afhankelijk van de juiste combinatie van vele factoren, waaronder pH, ionische sterkte, concentraties van precipitant en eiwit, temperatuur en snelheid van evenwicht. De meest gebruikte methode is dampdiffusie, waarvan er twee categorieën zijn: hanging drop en sitting drop. Een druppeltje dat zuiver eiwit, buffer en precipitant bevat, dat een ionische vaste stof is die watermoleculen bindt, waardoor de beschikbaarheid van water voor het eiwit wordt verminderd en een hogere eiwitconcentratie wordt nagebootst, bevindt zich in een gesloten microput met een reservoir met een meer geconcentreerde mengsel van dezelfde buffer en precipitant. Aan het begin zijn de concentraties van eiwit en precipitant te laag om kristallisatie te veroorzaken. Tijdens het verloop van het experiment verdampt water uit de druppel en verzamelt zich in het reservoir; een afname in de hoeveelheid water in de druppel zorgt ervoor dat het systeem oververzadigd raakt, en nucleatie, gevolgd door kristallisatie, kan optreden. De netto overdracht van water uit de druppel is in evenwicht en het systeem wordt onderhouden totdat het proces voltooid is.
Om de 3D-structuur te visualiseren, wordt röntgendiffractie gebruikt. Om röntgengegevens van een kristal te verkrijgen, wordt het in een monochromatische röntgenstraal geplaatst, waar het onder alle hoeken aan de straal wordt blootgesteld. Elke blootstelling levert een afbeelding op, waarbij elke spot een gediffracteerde röntgenstraal is, die uit het kristal komt en wordt geregistreerd door een detector. De gegevens worden gecombineerd om een model van de rangschikking van atomen binnen het kristal te produceren. De resulterende kristalstructuur toont de 3-dimensionale plaatsing van de atomen, met een typische resolutie van 2 angstroms.
Nu we de principes van eiwitkristallisatie hebben behandeld, laten we een gegeneraliseerd protocol bekijken.
Om de procedure te beginnen, wordt een expressievector die het gen van belang bevat, getransformeerd in cellen. De cellen worden geïncubeerd en in de midden-log fase wordt expressie geïnitieerd door het toevoegen van een inductor, zoals IPTG, die de transcriptie van het mRNA van het gen triggert. Na eiwitexpressie wordt het ruwe materiaal gesuspendeerd in lysisbuffer en vervolgens verduidelijkt door centrifugatie.
Het verduidelijkte lysaal wordt vervolgens geladen op een nikkelkolom, en het polyhistidine-getagde eiwit bindt zich aan de kolom terwijl alle andere biomoleculen worden weggespoeld.
Zodra er enkele milligrams zuiver eiwit zijn verkregen, is het klaar voor kristallisatie door dampdiffusie. Een 24-well hanging/sitting drop tray wordt gevuld met verschillende concentraties natriumchloride en natriumacetaat bufferoplossingen. Voor de sitting drop methode worden gelijke volumes van eiwit en reservoiroplossing gepipetteerd op het schap boven elke put en vervolgens wordt de tray bedekt met transparant plakband. De tray wordt vervolgens in een incubatiekamer geplaatst en de putten worden de volgende dag bewaakt op groei, en vervolgens om de paar dagen.
Zodra een geschikt kristal is verkregen, is het klaar voor röntgendiffractieanalyse. Het kristal wordt op een goniometer gemonteerd om het kristal in geselecteerde oriëntaties te positioneren. Het kristal wordt verlicht met een monochromatische straal van röntgenstralen onder alle hoeken, waardoor een diffractiepatroon ontstaat. De software zet de tweedimensionale beelden, genomen in verschillende oriëntaties, om in een driedimensionaal model van de dichtheid van elektronen binnen het kristal door de posities van de atomen in het kristal te bepalen.
Nu we een procedure hebben besproken, laten we enkele nuttige toepassingen van eiwitkristallisatie en een andere kristallisatietechniek bekijken.
Eiwitkristallisatie kan worden gebruikt voor in silico geneesmiddelontwerp. De driedimensionale structuur van het polymerase-basiseiwit 2 van het influenzavirus, dat is gekoppeld aan virale infectie bij zoogdieren, werd bepaald door kristallisatie en röntgendiffractie. Potentiële bindingsplaatsen in het eiwit worden gevisualiseerd en met behulp van een docking-programma werd een driedimensionaal molecuul ontworpen dat zich zou invoegen in een spleet in het eiwit.
Co-kristallisatie van eiwit-DNA-complexen is ook een nuttige techniek. DNA-bindende eiwitten moduleren een breed scala aan biologische functies zoals transcriptie en DNA-polymerisatie en DNA-reparatie; en kristalstructuren van deze complexen kunnen inzicht geven in eiwitfunctie, mechanisme en de aard van de specifieke interactie. Het E. coli-eiwit SeqA, een negatieve regulator van DNA-replicatie, werd geco-kristalliseerd met hemimethyleerd DNA.
Integrale membraaneiwitten zoals G-proteïnegekoppelde receptoren, of GPCR's, zijn moeilijk te kristalliseren vanwege hun beperkte hoeveelheid polair oppervlak die beschikbaar is voor het vormen van kristalroostercontacten, wat heeft geleid tot de ontwikkeling van door fusie-eiwit geassisteerde eiwitkristallisatie. Genen die coderen voor ?2 adrenerge receptor, een GPCR, en een lysozym werden in een expressievector geplaatst. De kristallisatie van het ?2AR- lysozym fusie-eiwit werd bereikt vanwege het verhoogde extracellulaire hydrofiele oppervlak boven het natuurlijk hydrofobe?2AR, geleverd door het lysozym, noodzakelijk voor he
Chapters in this video
0:00
Overview
0:50
Principles of Protein Crystallization
3:16
Protocol for Protein Expression, Crystallization, and X-Ray Diffraction
5:15
Applications
7:20
Summary
Videos from this collection: