Met behulp van 3 Single-molecuul FRET te bestuderen de correlatie van eiwitinteractie
30 januari 2018
Hier presenteren we een protocol om gegevens van de drie kleuren smFRET en haar analyse met een 3D ensemble verborgen Markov Model te verkrijgen. Met deze benadering kunnen wetenschappers kinetische informatie ophalen uit complexe eiwit systemen, met inbegrip van Allosterie of gecorreleerde interacties.
Het algemene doel van deze procedure is om de dynamiek van complexe eiwitsystemen op een kwantitatieve manier te bestuderen, met een focus op gecorreleerde interacties zoals coöperativiteit. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van kwantitatieve biologie waarin eiwitcomplexen en hun dynamische interacties van centraal belang zijn. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het dynamisch multicolor single molecule FRET toepast op biologisch relevante systemen.
Voorafgaand aan het samenstellen van de flowkamer snijdt u een flowkanaal in een 40 micron dikke transparante zelfklevende film, spuit snel drogende lijm op de niet-zelfklevende zijde van de film en laat de lijm drogen. Om te beginnen met de montage van de flowkamer verkrijgt u een drie millimeter dikke PEG biotin PEG gefunctionaliseerde gefuseerde kwartsschuif met inlaat- en uitlaatgaten. Breng de met spuitlijm beklede zijde van het plafondfilm aan op de gefunctionaliseerde zijde van de schuif, waarbij het kanaal wordt uitgelijnd met de inlaat- en uitlaathaken.
Verwarm de schuif gedurende één minuut op een heetplaat tot 80 graden Celsius. Druk de film gedurende 30 seconden op de schuif met behulp van een extra microscoopglaasje om de druk gelijkmatig te verdelen. En laat de montage vervolgens één minuut afkoelen.
Verwijder het beschermende velletje dat de kleefstof bedekt. Plaats een dekglas op de blootliggende kleefstof om de flowkamer te vormen. Verwarm de kamer gedurende één minuut tot 80 graden Celsius.
Druk het dekglas gedurende 30 seconden op de kleefstof om de kamer te verzegelen en laat de geassembleerde kamer afkoelen. Breng een druppel glycerol aan op het prisma-oppervlak voordat u de flowkamer over het prisma plaatst. Monteer de flowkamer in een houder voor een meerkleurige prisma-type TIRF-microscoop.
Verbind de inlaat- en uitlaatbuizen wanneer u klaar bent. Om te beginnen met het configureren van het instrument voor de drie-kleurmeting opent u de software van de electron multiplying CCD-camera, stelt u de EMCCD-sensor in op de laagst mogelijke temperatuur. Stel de verticale verschuivingssnelheid van de camera in op 3,3 microseconden, kies normale verticale klokspanning, stel de horizontale read-outsnelheid in op 17 Millihertz bij 16 bit, de voorversterkingsversterking op drie en het niveau van de elektronenvermenigvuldigerversterking op 1000.
Kies externe verwervingstriggering. Stel de belichtingstijd in op 70 milliseconden. En de duur van de filmopname op 750 verwervingscycli.
Maak een nieuwe map voor de meetbestanden. Schakel automatisch opslaan in de EMCCD-software in en stel het filmframe-bestandsformaat in op TIFF. Stel het pad voor automatisch opslaan in op de nieuw gemaakte map.
Open vervolgens de software die de acousto-optische afstembare filter bestuurt, de laserbesturingssoftware en de triggersoftware die de lasers, de AOTF, de optische sluiters en de camera's synchroniseert. Gebruik de AOTF om het laservermogen aan te passen tot ongeveer drie milliwatt voordat u het prisma binnengaat. Laad het triggerpatroon dat alle apparaten synchroniseert voor de wisselende laserexcitatie en monteer vervolgens de steekproefhouder in het instrument.
Plaats het uiteinde van de inlaatbuis in een microcentrifugebuisje met het experimentbuffer. Verbind de uitlaatbuis met een spuitpomp ingesteld op trekmodus. Spoel de kamer met 150 microliter buffer.
Focus de CCD-camera op de gefunctionaliseerde interface, aligneer de excitatiebundels en verbleken fluorescente verontreinigingen. Stroom vervolgens 300 microliter van een 0,25 milligram per milliliter oplossing van deglycosyleerd avidine en buffer in de kamer en incubeer gedurende één minuut. Spoel ongebonden deglycosyleerd avidine uit de kamer met buffer.
Stroom vervolgens 300 microliter buffer met een BSA-concentratie van 0,5 milligram per milliliter door de kamer om oppervlaktefunctionalisatiedeficiënten te blokkeren. Laad vervolgens de flowkamer met 150 microliter porties van biotinylering van fluorescent gelabelde Hsp90 in BSA bevattende buffer bij toenemende Hsp90-concentraties tot voldoende oppervlaktedichtheid is bereikt. Was ongebonden eiwit uit de kamer met 300 microliter BSA bevattende buffer.
Laad 150 microliter van een 25 nanomolair oplossing van gelabelde AMP-PMP en BSA bevattende buffer in de kamer en incubeer gedurende vijf minuten. Herhaal het laden en incuberen eenmaal. Gebruik vervolgens een Piezo-stepper om de steekproefkamer loodrecht op de excitatiebundel te verplaatsen om het gezichtsveld naar wens te wijzigen.
Pas indien nodig de beeldscherpstelling aan. Start de camera-opnames in de camerasoftware door op de knop "signaal opnemen" te klikken, zoals getoond. Start de excitatie-acquisitiecycli in de triggersoftware om de gegevensverwerving te starten.
Om te beginnen met de gegevensanalyse, opent u de analysesoftware en importeert u de opgenomen films van de twee camera's. Klik op "sporen zoeken" om de fluorescentie-intensiteitssporen te bepalen die overeenkomen met potentiële enkele moleculen. Bereken voor elk molecuul de som van alle sporen van die plek met dezelfde excitatiekleur.
Evalueer de intensiteitsprofielen in alle kanalen op een ongeveer vlakke plateau in de gezamenlijke ruwe intensiteit en een enkele verblekingsstap voor alle excitatiekleuren. Zoek naar gecorreleerd gedrag in de juiste detectiekanalen en het optreden van rode fluorescentie in het spoor. Als aan alle criteria is voldaan, slaat u de fluorescentiesporen op voor verdere analyse.
Alleen het aangegeven molecuul voldoet aan de criteria in dit voorbeeld. Sluit sporen uit die geen vlakke plateaus hebben, die knippergebeurtenissen vertonen in plaats van anticorrelatie of die meerdere verblekingsstappen hebben. Sporenselectie is een cruciale stap in alle enkelmolecuultechnieken.
Alleen sporen die aan goed gedefinieerde criteria voldoen, mogen worden geselecteerd. Hier zijn deze criteria anticorrelatie, enkele verblekingsstappen en vlakke plateaus. Toon vervolgens de opgeslagen moleculen één na de ander en één set intensiteitssporen en selecteer een tijdsinterval
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het verkrijgen van driekleurige single-molecule FRET (smFRET)-gegevens en het analyseren hiervan met behulp van een 3D ensemble Hidden Markov Model. Deze methode stelt onderzoekers in staat om kinetische informatie te extraheren uit complexe eiwitsystemen, met een focus op coöperativiteit en gecorreleerde interacties.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Biofysica
- Kwantitatieve biologie
Achtergrond
- Het begrijpen van proteïnedynamiek is van cruciaal belang in de biologie.
- Gecorreleerde interacties en coöperativiteit zijn sleutelaspecten van de proteïnefunctie.
- Single-molecule technieken bieden inzicht in deze dynamiek.
- Dit protocol is van toepassing op biologisch relevante systemen.
Doel van de studie
- Om de dynamiek van complexe eiwitsystemen kwantitatief te bestuderen.
- Om gecorreleerde interacties en coöperativiteit in eiwitten te onderzoeken.
- Om de toepassing van dynamische multicolor smFRET te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Assemblage van een flowkamer met gebruik van een PEG-biotine gefunctionaliseerde slide.
- Toepassing van spuitlijm voor het afdichten van de kamer.
- Gebruik van driekleuren-smFRET voor gegevensverzameling.
- Analyse van gegevens met een 3D ensemble Hidden Markov Model.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle extractie van kinetische informatie uit eiwitsystemen.
- Demonstratie van coöperativiteit en gecorreleerde interacties.
- Validatie van het protocol voor gebruik in complexe biologische systemen.
- Bijdrage aan het begrip van eiwitdynamica.
Conclusies
- Het protocol biedt een robuuste methode voor het bestuderen van proteïnedynamica.
- Het vergroot het begrip van complexe interacties in proteïnen.
- Deze benadering kan worden toegepast op diverse biologische onderzoeksvragen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Driekleuren single-molecule FRET (smFRET) met analyse via een 3D Hidden Markov-model maakt kwantitatieve dissectie van gecorreleerde proteïne-interacties en conformationele dynamiek op single-molecule niveau mogelijk. Deze benadering biedt mechanische risicoreductie en voorspellende zekerheid voor complexe proteïnesystemen, wat belangrijke inflection points ondersteunt bij vroege ontdekking en target-validatie. Het vermogen van de methode om coöperativiteit en de volgorde van moleculaire gebeurtenissen op te lossen, is direct relevant voor biopharma R&D-portfolio's die gericht zijn op biologische targets met meerdere componenten.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt directe observatie van gecorreleerde eiwitinteracties en coöperativiteit in functionele cycli mogelijk.
- Ondersteunt mechanische risicoreductie door onderscheid te maken tussen meerdere conformationele en bindingsstaten.
- Levert kwantitatieve kinetische parameters voor functionele validatie van targets.
- Faciliteert de triage van targets op basis van dynamische interactieprofielen.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Stelt gevalideerde, kwantitatieve read-outs vast voor multi-state proteïnesystemen.
- Verbetert de reproduceerbaarheid van assays door middel van strikte selectie van traceringen en criteria voor statusscheiding.
- Ondersteunt downstream screening door robuuste detectie van interactieveranderingen mogelijk te maken.
- Maakt hergebruik van het platform mogelijk voor diverse proteïnecomplexen die multi-color FRET-analyse vereisen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Stemmen overeen met ziekterelateerde systemen waarbij de dynamiek van eiwitcomplexen de functie aanstuurt.
- Maakt continuïteit mogelijk van ontdekking naar preklinische validatie door mechanisch inzicht te bieden in regulatoire interacties.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling op basis van kwantitatieve kinetische gegevens.
- Faciliteert de afstemming van biomarkers wanneer gecorreleerde eiwittoestanden gekoppeld zijn aan functionele uitkomsten.
Integratie van Pipeline en Workflow
Deze methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van vroege mechanistische studies tot lead-identificatie en preklinisch onderzoek naar proteïnecomplexen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door gecorreleerde moleculaire gebeurtenissen te ontrafelen.
- Screening: Levert kwantitatieve, reproduceerbare resultaten voor assay-ontwikkeling en evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Levert kinetische snelheden, staatspopulaties en betrouwbaarheidsintervallen voor een robuuste vergelijking van experimentele condities.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt mechanistische bevindingen met ziekterelateerde eiwitsystemen, indien van toepassing.
- Enterprise Hergebruik: Biedt een herbruikbaar analytisch kader voor diverse multi-eiwitcomplexen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanische ambiguïteit in studies naar eiwitinteracties.
- Operationele waarde: Standaardiseert de data-acquisitie en analyse voor multi-color smFRET-experimenten.
- Strategische waarde: Maakt betere go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiëntie mogelijk door het verschaffen van kwantitatieve kinetische inzichten.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en voortgang van complexe biologische targets.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in fluorescentie op enkelmolecuulniveau en geavanceerde data-analyse.
- Vereist gespecialiseerde instrumentatie, waaronder multicolor TIRF-microscopie en EMCCD-camera's.
- Vereist strikte standaardisatie tussen teams voor de selectie van traces en de toewijzing van toestanden.
- Aanpassing kan nodig zijn voor verschillende eiwitsystemen of labelingsstrategieën.
- Praktische beperkingen omvatten signaal-ruisverhoudingsbeperkingen en de noodzaak van robuuste statistische modellering.
