Name: Met behulp van 3 Single-molecuul FRET te bestuderen de correlatie van eiwitinteractie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Leer hoe u driedimensionale single-molecule FRET gebruikt om eiwitdynamiek en gecorreleerde interacties zoals coöperativiteit te bestuderen. Deze methode maakt kwantitatieve analyse van complexe eiwitcomplexen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt gefinancierd door de Duitse Research Foundation (INST 39/969-1) en de Europese Onderzoeksraad door de ERC subsidieovereenkomst n. 681891.

1. installatie en vereisten
<ol><li>Voer de Multi-Color smFRET metingen op een prisma-type TIRFM. Een beschrijving van een twee-kleur setup zoals een JoVE publicatie wordt gegeven referentie12.<ol>
<li>Bouw een multi kleur TIRFM. Een algemene lay-out wordt toegelicht in 9.</li>
		<li>Gebruik, omschakelbaar, diode gepompte vaste toestand continu wave lasers, die het gebruik van mechanische luiken in de excitatie-paden overbodig.</li>
		<li>Dienst een asymmetrische, langwerpige prisma waardoor de rug reflectie van de lichtbundel van de excitatie van de achterkant te voeren van de doelstelling.</li>
		<li>Gebruik 2-inch Achromatische asferische gesmolten siliciumdioxide lenzen in de detectie-paden die zoveel licht mogelijk te verzamelen en te voorkomen dat auto-fluorescentie en aberraties, bijvoorbeeld verstoringen in regio's van uit het midden van de afbeelding.</li>
		<li>Elk pad detectie richten op de chip van de EMCCD met een aparte lens. Het is hierdoor optimaal richten van elk kanaal detectie. Let op: Klasse 3B lasers worden gebruikt in de TIRFM. Dit betekent dat ze gevaarlijk zijn als het oog direct wordt blootgesteld, maar diffuse reflecties niet schadelijk zijn. Naleving van laser veiligheidsmaatregelen volgens lokale overheidsvoorschriften voordat het systeem wordt bediend.</li>
	</ol>
</li>
	<li>De correctiefactoren voor setup en fluorophore eigenschappen vooraf met behulp van dsDNA monsters te bepalen.<ol>
<li>Gebruik één hoge-FRET dsDNA monster voor elke kleurstof in combinatie met de acceptor met de langste golflengte van excitatie (voor de voorgestelde installatie: Atto488-Atto647N, Atto550-Atto647N, Atto594-Atto647N). Zorg ervoor dat het DNA is bovendien gewijzigd met een biotine.</li>
		<li>Verdunnen van het monster, tot 5 nM met TNM buffer (5 mM Tris pH 7.5, 5 mM NaCl, 20 mM MgCl2) en 2 mM Trolox (gebruik deze buffer ook voor meting).</li>
		<li>Immobiliseren de dsDNA als beschreven voor het Hsp90 in stappen 2.5 en 2.7.</li>
		<li>Bereken de correctiefactoren voor zichtbare lekkage (lk) en schijnbare gamma (ag) van single-molecuul sporen die aantonen dat een acceptor bleken gebeurtenis.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Construeer een stroom kamer die is een sandwich van een PEG/Biotine-PEG speciaal kwarts dia, een dunne film die is lijm aan beide zijden, en een cover slip. Zie referentie9voor detail protocollen voor het reinigen van de quartz dia's en passiveren.<ol>
<li>Gebruik dik (3 mm) kwarts dia's om meetkundig te voorkomen dat de collectie van laserlicht verspreid op de quartz-glycerol-kwarts-interface tussen het prisma en de dia matiemaatschappij kwarts.</li>
		<li>Gebruik een dun (40 µm) afdichting van de film die wordt bespoten met lijm op de niet-klevende kant. De dunne film verkleint de afstand tussen de moleculen oppervlak-ingeschrevenen en de doelstelling. Verwarmen tot 80 ° C en druk op.</li>
		<li>Plaats een cover slip op de top. Verwarmen tot 80 ° C en druk op. Een daling van glycerol gebruiken bij het plaatsen van de kamer van de stroom over de prism. Opmerking: De materialen van het prisma, evenals de kwarts dia's en de glycerol zijn index-matched.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Express Hsp90 van Saccharomyces cerevisiae in de vorm van twee één cysteïne punt mutanten op de posities D61 of Q385. Het toevoegen van een C-terminal spiraalsnoer-spoel motief om te voorkomen dat dimeer dissociatie bij picomolar concentraties. De mutant eiwitten afzonderlijk label en de monomeren om te verkrijgen heterodimers aangeduid met Atto488 op aminozuur positie 61 en Atto550 bij aminozuur positie 3859uit te wisselen.</li>
</ol>2. meting
<ol><li>Start de software van de camera en de imaging parameters instellen zoals hieronder aangegeven:<ol>
<li>Stel de temperatuur van de sensor koeling zo laag mogelijk (-95 ° C met externe waterkoeling) als u wilt verkleinen van het donkere huidige lawaai.</li>
		<li>Gebruik van de camera-instellingen die zijn geoptimaliseerd voor single-molecuul opname: 3.3 µs verticale schuif snelheid, spanning van de normale verticale klok, 17 MHz 16-bits horizontaal gelezen, pre amplificatie winst 3, winst van electron multiplier 1.000.</li>
		<li>Stel het genereren van de acquisitie aan "Externe" en de belichtingstijd aan 70 ms. Record films met een lengte van 750 overname cycli. Opmerking: De kamer licht als uitschakelen om te voorkomen dat de verzadiging van de EMCCD-sensor is het verwerven van de camera.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Maak een map op de lokale SSD voor de meting. In de software instellingen ga naar de < Auto-Save > renner < Auto-opslaan > inschakelen en kies bestandsindeling "Tiff" voor de verwerving van de film. Selecteer de map op de SSD als locatie voor automatisch opslaan.</li>
	<li>Start de software die besturingselementen de akoestisch-optische afstembare filter (AOTF), de software die regelt de werking van de lasers en de trigger-software die de lasers, AOTF synchroniseert, rolluiken in het pad van de detectie en camera's. Aanpassen van de kracht van de laser met de AOTF (ca. 3 mW alvorens het prisma) en laadt u de juiste triggering patroon.</li>
	<li>Monteren van de monsterhouder met het prisma en de stroom kamer, hechten buis, plaats van de inlaat-buis in een kopje microcentrifuge en de uitlaat buizen verbinden met een spuitpomp. De kamer met ongeveer 150 µL buffer leegmaken, sluiten de excitatie lichtbundel, en focus. Bleekmiddel elke fluorescerende verontreinigingen op het oppervlak door langzaam bewegen langs het volledige detectiebereik van de dia met een kracht van de laser van ongeveer 10 mW voor alle lasers. Dit duurt ongeveer 1 uur. Opmerking: als niet anders vermeld, de gebruikte buffer bevat 40 mM HEPES pH 7.5, 150 mM KCl, en 10 mM MgCl2.</li>
	<li>Leegmaken van ongeveer 300 µL van een NeutrAvidin-oplossing (0,25 mg/mL in buffer) in de kamer en incubeer gedurende 1 min. Flush uit niet-afhankelijke NeutrAvidin met buffer en flush ongeveer 300 µL van een BSA-oplossing (0,5 mg/mL in buffer) door de kamer. Opmerking: Dit blok resterende oppervlakte functionalization gebreken door aspecifieke adsorptie van BSA naar de oppervlakte.</li>
	<li>Immobiliseren van het monster door het laden van de kamer van de stroom met ongeveer 150 µL van het biotinyleerd en het label van Hsp90 bij stijgende concentraties (verdund in buffer + 0,5 mg/mL BSA) totdat een voldoende oppervlakte dichtheid wordt bereikt, die is meestal het geval bij een concentratie van 5-10 pM. Niet-afhankelijke eiwitten met buffer van ongeveer 300 µL + 0,5 mg/mL BSA wassen.</li>
	<li>Flush in 150 µL van 25 nM AMP-PNP * in buffer + 0,5 mg/mL BSA. Laat het Incubeer gedurende 5 minuten en herhaal deze stap eenmaal om ervoor te zorgen correct nucleotide concentratie. Opmerking: Voor experimenten in het bijzijn van de extra, labelloze AMP-PNP, ook toevoegen 250 µM AMP-PNP.</li>
	<li>Beginnen met de data-acquisitie. Voor een juiste hoeveelheid gegevens krijgt ongeveer 20 films die duurt ongeveer 1,5 uur.<ol>
<li>Verplaatst de positie van de monsterkamer loodrecht op de straal van de excitatie met een piëzo-stepper te veranderen van het gezichtsveld.</li>
		<li>Pas de focus met de z-piezo die de hoogte van de doelstelling, bepaalt indien nodig. Dit moeten niet te vaak wanneer de meting-kamer zonder helling is gemonteerd.</li>
		<li>Voorbereiden van de opname van de camera's door te drukken op < nemen signaal > in de camerasoftware en start de excitatie/acquisitie-cycli met gebruik van de knop < Start > in de trigger-software. Hiermee start u de overname van de intensiteit van de fluorescentie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Een chatbox registratie uitvoeren door de eerste opname van een film met fluorescerende kralen dat fluorescentie emissie in het spectraal bereik van alle kanalen van de detectie van de installatie weergeven. Vervolgens kraal posities in de kalibratie-film door te zoeken naar de helderste plekken ontdekken en bepalen dat de centrale positie van een Gaussiaan passen bij het profiel van de intensiteit. Sla de coördinaten van de kralen die zijn gevonden in alle kanalen en passen zowel de verschuiving van de toewijzing in x - en y-richting met een 2D veelterm van graad drie9.</li>
</ol>3. selectie van Single-molecuul sporen
<ol><li>Data-analyse wordt gedaan met in-house scripts met Igor Pro. Laad alle noodzakelijke scripts door "iniTIRF.ipf" te openen en selecteer het juiste type van experiment. Opmerking: In de volgende < knop > klikbare elementen in het menu of de gebruikersinterface aangeeft. Functieaanroepen worden aangegeven tussen aanhalingstekens, bijvoorbeeld "Print"Hello World"". Deze opdrachten kunnen worden geplakt op de opdrachtregel van Igor Pro (zonder de omsluitende citaten).</li>
	<li>Zorg ervoor dat de parameters voor de detectie chatbox registratie worden geladen.</li>
	<li>De GUI te starten door te klikken op < smFRET nieuwe | Analyse GUI >.</li>
	<li>Laad de films (dat wil zeggen, de volgorde van frames met 512 x 512 pixels opgeslagen als 16-bits TIFF stapels) die houdt van de intensiteit in de respectieve kanalen. Dit doen door op de knop van de < Load Film > en selecteren van de bestanden van de zogenaamde "meester" en "slave" camera's een na de andere.</li>
	<li>De posities van potentiële afzonderlijke moleculen identificeren door te zoeken naar de helderste plekken in de som van de eerste vijf frames in een bepaalde detectie-kanaal. Bereken de overeenkomende posities in alle andere kanalen voor detectie van het kanaal in kaart brengen. Voor het verkrijgen van de fluorescentie intensiteit trace, som van de intensiteit van een pixel vierkant rond de centrale positie voor elk frame. Doe dit door op de knop < vinden sporen > in de GUI. Opmerking: De lengte van de zijde van het plein (in pixel) wordt gegeven door: 2 * < som Pxs > + 1.</li>
	<li>Voor elke molecuul, een gezamenlijke rauwe intensiteit trace te berekenen als de som van alle sporen van deze plek met dezelfde excitatie kleur. Evalueren van het profiel van de intensiteit van de molecule in alle kanalen voor de volgende criteria:<ol>
<li>Een ongeveer vlakke plateau in de gezamenlijke rauwe intensiteit en een enkele bleken stap voor alle excitatie kleuren, anticorrelated gedrag in de kanalen van de passende detectie, opsporing van rode fluorescentie (met vermelding van de FRET naar een afhankelijke AMP-PNP *) ten minste eenmaal binnen de overtrekken en geen meerdere stappen in de rode fluorescentie, die op de aanwezigheid van twee AMP-PNP wijzen * gebonden aan één Hsp90 dimeer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sla de sporen van de fluorescentie van de spot voor verdere analyse als deze criteria is voldaan. Dit doen door het selecteren van het spoor met de cursor en drukt u op de knop < opslaan > in de grafiek "tijdlijnen". Handmatig controleren de sporen van de intensiteit in alle drie detectie kanalen na blauwe excitatie voor ongeveer 200 moleculen per film.</li>
</ol>4. berekening van de gedeeltelijke fluorescentie sporen
<ol><li>Alle sporen van de intensiteit van de fluorescentie voor een van de opgeslagen moleculen weergeven Kunt de cursors in de grafiek selecteren tijdsbereik.</li>
	<li>Selecteer een tijdsinterval waar alle fluorophores al zijn gebleekt. De gemiddelde achtergrond intensiteit is berekend op basis van dit bereik en afgetrokken van het spoor van de intensiteit in elk kanaal. Doe dit door op de knop < achtergrond > te drukken.</li>
	<li>Selecteer de FRET efficiëntie bereik, waar ten minste beide de kleurstoffen aan Hsp90 (Atto488 en Atto550) aanwezig zijn. Zorg ervoor om uit te sluiten van de sporen die een knipperende gebeurtenis bevatten (Zie figuur 3B). Deze gebeurtenissen worden gekenmerkt door een intensiteit van de fluorescentie drop-in in één kanaal zonder begeleidende verhoging van andere kanalen.</li>
	<li>Bereken de PF -sporen. Doe dit door op de knop < PF Calc >. De vooraf gedefinieerde correctiefactoren voor zichtbare lekkage (lk) en schijnbare gamma (ag) worden toegepast op de ruwe intensiteit om te corrigeren voor foto-fysieke en instellen van eigenschappen.</li>
</ol>5. bevolking selectie en 3D Histogram montage
<ol><li>Verwijderen van moleculen die een lage signaal-/ ruisverhouding in de sporen van de PF weergeven. Moleculen die hoger zijn dan het interval [-1; 2] in elk spoor van de PF voor meer dan 10% van de frames worden verwijderd uit de gegevensset. Dit doen door het uitvoeren van "RemoveTracesLowSNR()" van het opdrachtvenster.</li>
	<li>Bereken weggegooid 2D projecties van de PF -gegevens. Uitzetten <img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq12.jpg"> </img>over <img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq13v2.jpg"> en <img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq14.jpg"> over <img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq13v2.jpg"> in het bereik [-0,5; 1.5] met een resolutie van 100 x 100 opslaglocaties. Om dit te doen, uit te voeren:<ol>
<li>"HistFret2D ("r_b","r_g", binHist = 100)"</li>
		<li>"HistFret2D ("r_b","g_b", binHist = 100); MoveWindow 553,5, 42,5, 1055.25, 508.25"</li>
	</ol>
</li>
	<li>Het bepalen van de relatieve bevolking van elke te onderscheiden staat in de 2D projecties.<ol>
<li>De juiste grafiek naar de voorgrond brengen en uitvoeren van "panelHist2DCount()".</li>
		<li>Druk op de knop < Init > en tekenen van een veelhoek vrije-hand rond de piek.</li>
		<li>Klik op de knop < telling >. Het aantal gegevenspunten in de veelhoek en het totale aantal gegevenspunten in de projectie worden afgedrukt in het opdrachtvenster.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiden van een 3D histogram van de PF -gegevens door te voeren "HistFret3D ("g_b","r_b","r_g")".</li>
	<li>Normaliseren van de 3D histogram naar een integraal van 1. Voer de volgende handelingen uit:<ol>
<li>"NewDataFolder/S fit0"</li>
		<li>"Duplicaat/O:: FRET: Hist3D, Hist3D"</li>
		<li>"Variabele /G div = sum(Hist3D)*(DimDelta(Hist3D,0)) ^ 3"</li>
		<li>"Hist3D / = div; Print div"</li>
	</ol>
</li>
	<li>Initiële parameters voor de 3D Gaussiaans passen en bereiden van noodzakelijke gegevensstructuren bieden.<ol>
<li>Uitvoeren van de "Gauss3D_initParam(); W_coef_old bewerken'.</li>
		<li>De Braziliaanse bevolking toevoegen aan het einde van de parameter-vector.</li>
		<li>Uitvoeren van de "Gauss3D_prepareFit()." Opmerking: W_coef_old is een vector die in het bezit van de oorspronkelijke parameters voor de pasvorm. Dit betekent dat per lidstaat <img alt="Equation 15" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq15.jpg"> en de Braziliaanse bevolking, die aan het einde van de vector wordt samengevoegd. Zorg ervoor dat de covariantie matrix symmetrisch is.</li>
	</ol>
</li>
	<li>De som van S 3D Gaussian functies aan het 3D histogram van de PF , met S is het aantal te onderscheiden Staten passen.<ol>
<li>Uitvoeren van de "do3D()." Dit kan duren een uur of meer op een normale kantoor-PC, afhankelijk van de kwaliteit van de oorspronkelijke parameters.</li>
		<li>Uitvoeren van de "postprocessFitMultiGauss3D(); evalFitMultiGauss3D(); W_coef bewerken'.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Het fit resultaat weergegeven. Voor elk van de twee 2D projecties, gebruikt u de volgende opdrachten:<ol>
<li>"contourPF3D_new(0); contourPF3D_new(1); contourPF3D_new(2); contourPF3D_new(3); contourPF3D_new(4)"</li>
		<li>"contourPF3D_colorize()"</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. kinetische analyse met 3D Ensemble HMM
<ol><li>Een ensemble HMM uitvoeren om uit te pakken van de kinetische gegevens voor te bereiden. Een HMM is geoptimaliseerd uit alle moleculen in de gegevensset. Gebruik de informatie die is verkregen in de vorige stap definiëren de positie en de breedte van elke staat in de 3D-ruimte van de PF .<ol>
<li>Initialiseren van de gebruikersinterface van HMM (< HMM | Init HMM >) en kiest u het juiste aantal staten (in het geval van de Hsp90 gegevens betekent dit < NumStates > = 5), aantal dimensies van het ingangssignaal (< NumDims > = 3), en het type van de input (< Input Type > = "FRET 3D bgr").</li>
	</ol>
</li>
	<li>Optimaliseren van de parameters van de HMM door te laten van de software die de waarschijnlijkheid van de HMM convergeren (uitvoeren "prepENS_CONVERGE_gB(GetDataFolder(1),-14)") totdat de wijziging in de transitie matrix ten opzichte van de vorige iteratie kleiner is dan een drempelwaarde (10-14 voor de som van de absolute verandering voor de waarschijnlijkheid van elke overgang). Dit levert de MLE voor de waarschijnlijkheid van de overgang in ongeveer een uur op een normale kantoor-PC.</li>
	<li>Herhaal de selectie van de bevolking, Gaussiaans montage en de HMM optimalisatie voor subsets van de gegevens (bijvoorbeeld 75% van de volledige gegevensset). Als de volledige gegevensset werd samengevoegd uit verschillende experimenten, herhaalt u de optimalisatie ook voor elk van de enkele experimenten. Analyse van deelverzamelingen vliegvergunningen schatten van de onzekerheid van de selectie handmatige bevolking en de variabiliteit in de gegevensset.</li>
	<li>Bereken de CI voor de overgang waarschijnlijkheden, die verslag over de heterogeniteit van de gegevensverzameling en de precisie van de HMM uitbrengen.<ol>
<li>Een ruwe schatting van de CI-grenzen krijgen door het uitvoeren van "cd $(wortel: path3Dimport +"HMM"); loop_getCI_estimate_limits()."</li>
		<li>Bereken de exacte grenzen van het CI door uit te voeren:</li>
		<li>"loop_getCI_HMM_converge(1)"</li>
		<li>"CIresults_conv_new()"</li>
		<li>"cd:: HMM_CIresult; reportCI_conv()"</li>
		<li>"cd:: cmp_CI_conv; CI_plot2 ("HMM", doAppend = 0) "</li>
	</ol>
</li>
	<li>De beschikbare kinetische informatie ter vereenvoudiging van de interpretatie te condenseren.<ol>
<li>Informatie verzamelen over de tijd een gelabelde nucleotide blijft gebonden aan Hsp90. Dit doen door het instorten van de staten die zijn gebonden aan de AMP-PNP * (dat wil zeggen, S1, S2 en S3, zie ook Figuur 2) en compileren van de nadruktijd tijd histogram. Uitvoeren van de "cd $(wortel: path3Dimport +"HMM"); collapse_states_get_DT({0,1,1,1,0}) ", die combineert desgenen van Staten S0 en S4 evenals S1, S2en S3.</li>
		<li>De meetfrequenties uittreksel uit het Viterbi pad voor elke staat van belang en het resulterende Nadruktijd tijd histogram voor verschillende experimentele voorwaarden vergelijken. Uitvoeren van de "plot_collapsed_DT_Hist (wDTo_01110_record1)."</li>
		<li>Voor een meer gedetailleerd beeld, samenvouwen staten die hebben verschillende PF maar zijn functioneel identiek aan het verlichten van de verdere data-analyse, bijvoorbeeldin het geval van een 3 experiment met gelabelde Hsp90 nucleotide, Staten S2 en S 3 kan worden samengevouwen. Uitvoeren van de "collapse_states_get_DT({0,1,2,2,4})."</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Nooren, I. M. A., Thornton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Diversity of protein-protein interactions.</a> EMBO J. 22 (14), 3486-3492 (2003).</li>
<li>Marsh, J. A., Teichmann, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+dynamics%2C+assembly%2C+and+evolution+of+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Structure, dynamics, assembly, and evolution of protein complexes.</a> Annu Rev Biochem. 84, 551-575 (2015).</li>
<li>Henzler-Wildman, K., Kern, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+personalities+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamic personalities of proteins.</a> Nature. 450 (7172), 964-972 (2007).</li>
<li>Hohng, S., Joo, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Three-Color+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Three-Color FRET.</a> Biophys J. 87 (2), 1328-1337 (2004).</li>
<li>Person, B., Stein, I. H., Steinhauer, C., Vogelsang, J., Tinnefeld, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlated+movement+and+bending+of+nucleic+acid+structures+visualized+by+multicolor+single-molecule+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ChemPhysChem%22%5BJournal%5D)">Correlated movement and bending of nucleic acid structures visualized by multicolor single-molecule spectroscopy.</a> ChemPhysChem. 10 (9-10), 1455-1460 (2009).</li>
<li>Lee, J., Lee, S., Ragunathan, K., Joo, C., Ha, T., Hohng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+four-color+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Single-molecule four-color FRET.</a> Angew Chem Int Ed. 49 (51), 9922-9925 (2010).</li>
<li>Ratzke, C., Berkemeier, F., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+protein+90%27s+mechanochemical+cycle+is+dominated+by+thermal+fluctuations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Heat shock protein 90's mechanochemical cycle is dominated by thermal fluctuations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (1), 161-166 (2012).</li>
<li>Ratzke, C., Hellenkamp, B., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four-colour+FRET+reveals+directionality+in+the+Hsp90+multicomponent+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Four-colour FRET reveals directionality in the Hsp90 multicomponent machinery.</a> Nat Commun. 5, 4192(2014).</li>
<li>Götz, M., Wortmann, P., Schmid, S., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Multicolor+Single-Molecule+FRET+Approach+to+Study+Protein+Dynamics+and+Interactions+Simultaneously%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">A Multicolor Single-Molecule FRET Approach to Study Protein Dynamics and Interactions Simultaneously.</a> Methods Enzymol. 581, 487-516 (2016).</li>
<li>Yengo, C. M., Berger, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+anisotropy+and+resonance+energy+transfer%3A+Powerful+tools+for+measuring+real+time+protein+dynamics+in+a+physiological+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence anisotropy and resonance energy transfer: Powerful tools for measuring real time protein dynamics in a physiological environment.</a> Curr Opin Pharmacol. 10 (6), 731-737 (2010).</li>
<li>Wortmann,P ,, Götz M,, Hugel T , <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+Nucleotide+Binding+in+Hsp90+and+Its+Regulation+by+Aha1%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Cooperative Nucleotide Binding in Hsp90 and Its Regulation by Aha1.</a> Biophys J. 113, 1711-1718 (2017).</li>
<li>Dörfler, T., Eilert, T., Röcker, C., Nagy, J., Michaelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Information+from+Single-molecule+FRET+Experiments+Using+the+Fast+Nano-positioning+System%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System.</a> J Vis Exp. (120), e54782(2017).</li>
<li>Stephanopoulos, N., Francis, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choosing+an+effective+protein+bioconjugation+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Choosing an effective protein bioconjugation strategy.</a> Nature chemical biology. 7 (12), 876-884 (2011).</li>
<li>Sánchez-Rico, C., Voith von Voithenberg, L., Warner, L., Lamb, D. C., Sattler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Fluorophore+Attachment+on+Protein+Conformation+and+Dynamics+Studied+by+spFRET+and+NMR+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%28Weinheim+an+der+Bergstrasse%2C+Germany%29%22%5BJournal%5D)">Effects of Fluorophore Attachment on Protein Conformation and Dynamics Studied by spFRET and NMR Spectroscopy.</a> Chemistry (Weinheim an der Bergstrasse, Germany). , (2017).</li>
<li>Roy, R., Hohng, S., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+single-molecule+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical guide to single-molecule FRET.</a> Nat Methods. 5 (6), 507-516 (2008).</li>
<li>Lee, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-color+alternating-laser+excitation+of+single+molecules%3A+monitoring+multiple+interactions+and+distances%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Three-color alternating-laser excitation of single molecules: monitoring multiple interactions and distances.</a> Biophys J. 92 (1), 303-312 (2007).</li>
<li>Kapanidis, A. N., Lee, N. K., Laurence, T. A., Doose, S., Margeat, E., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-aided+molecule+sorting%3A+analysis+of+structure+and+interactions+by+alternating-laser+excitation+of+single+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-aided molecule sorting: analysis of structure and interactions by alternating-laser excitation of single molecules.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (24), 8936-8941 (2004).</li>
<li>Hohlbein, J., Craggs, T. D., Cordes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternating-laser+excitation%3A+single-molecule+FRET+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">Alternating-laser excitation: single-molecule FRET and beyond.</a> Chem Soc Rev. 43 (4), 1156-1171 (2014).</li>
<li>Hellenkamp, B., Wortmann, P., Kandzia, F., Zacharias, M., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidomain+structure+and+correlated+dynamics+determined+by+self-consistent+FRET+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Multidomain structure and correlated dynamics determined by self-consistent FRET networks.</a> Nat Methods. 14, 174-180 (2017).</li>
<li>Rabiner, L. R. <a target="_blank" href="http://www.cs.ubc.ca/~murphyk/Software/HMM/rabiner.pdf">A tutorial on hidden Markov models and selected applications in speech recognition.</a> Proc IEEE. 77 (2), 257-286 (1989).</li>
<li>Fink, G. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFink%2C+GA+%22Markov+Models+for+Pattern+Recognition%22">Markov Models for Pattern Recognition</a>. , Springer London. London. (2014).</li>
<li>Giudici, P., Ryden, T., Vandekerkhove, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Likelihood-Ratio+Tests+for+Hidden+Markov+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Biometrics%22%5BJournal%5D)">Likelihood-Ratio Tests for Hidden Markov Models.</a> Biometrics. 56 (3), 742-747 (2000).</li>
<li>Visser, I., Raijmakers, M. E. J., Molenaar, P. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confidence+intervals+for+hidden+Markov+model+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Math+Stat+Psychol%22%5BJournal%5D)">Confidence intervals for hidden Markov model parameters.</a> Br J Math Stat Psychol. 53 (2), 317-327 (2000).</li>
<li>McKinney, S. A., Joo, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Single-Molecule+FRET+Trajectories+Using+Hidden+Markov+Modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Analysis of Single-Molecule FRET Trajectories Using Hidden Markov Modeling.</a> Biophys J. 91 (5), 1941-1951 (2006).</li>
<li>Bronson, J. E., Fei, J., Hofman, J. M., Gonzalez, R. L., Wiggins, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+Rates+and+States+from+Biophysical+Time+Series%3A+A+Bayesian+Approach+to+Model+Selection+and+Single-Molecule+FRET+Data%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Learning Rates and States from Biophysical Time Series: A Bayesian Approach to Model Selection and Single-Molecule FRET Data.</a> Biophys J. 97 (12), 3196-3205 (2009).</li>
<li>Greenfeld, M., Pavlichin, D. S., Mabuchi, H., Herschlag, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Analysis+Research+Tool+%28SMART%29%3A+an+integrated+approach+for+analyzing+single+molecule+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Analysis Research Tool (SMART): an integrated approach for analyzing single molecule data.</a> PLoS ONE. 7 (2), e30024(2012).</li>
<li>Schmid, S., Götz, M., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Analysis+beyond+Dwell+Times%3A+Demonstration+and+Assessment+in+and+out+of+Equilibrium%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Analysis beyond Dwell Times: Demonstration and Assessment in and out of Equilibrium.</a> Biophys J. 111 (7), 1375-1384 (2016).</li>
<li>Taipale, M., Jarosz, D. F., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSP90+at+the+hub+of+protein+homeostasis%3A+emerging+mechanistic+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">HSP90 at the hub of protein homeostasis: emerging mechanistic insights.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (7), 515-528 (2010).</li>
<li>Trepel, J., Mollapour, M., Giaccone, G., Neckers, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+dynamic+HSP90+complex+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting the dynamic HSP90 complex in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 10 (8), 537-549 (2010).</li>
<li>Wayne, N., Bolon, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimerization+of+Hsp90+is+required+for+in+vivo+function.+Design+and+analysis+of+monomers+and+dimers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Dimerization of Hsp90 is required for in vivo function. Design and analysis of monomers and dimers.</a> J Biol Chem. 282 (48), 35386-35395 (2007).</li>
<li>Ali, M. M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+an+Hsp90-nucleotide-p23%2FSba1+closed+chaperone+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of an Hsp90-nucleotide-p23/Sba1 closed chaperone complex.</a> Nature. 440 (7087), 1013-1017 (2006).</li>
<li>Southworth, D. R., Agard, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species-dependent+ensembles+of+conserved+conformational+states+define+the+Hsp90+chaperone+ATPase+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Species-dependent ensembles of conserved conformational states define the Hsp90 chaperone ATPase cycle.</a> Mol Cell. 32 (5), 631-640 (2008).</li>
<li>Blanchard, S. C., Kim, H. D., Gonzalez, R. L., Puglisi, J. D., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tRNA+dynamics+on+the+ribosome+during+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">tRNA dynamics on the ribosome during translation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12893-12898 (2004).</li>
<li>Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Oxygen+Scavenging+System+for+Improvement+of+Dye+Stability+in+Single-Molecule+Fluorescence+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments.</a> Biophys J. 94 (5), 1826-1835 (2008).</li>
<li>Swoboda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+oxygen+scavenging+for+photostability+without+pH+drop+in+single-molecule+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Enzymatic oxygen scavenging for photostability without pH drop in single-molecule experiments.</a> ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).</li>
<li>Rognoni, L., Stigler, J., Pelz, B., Ylänne, J., Rief, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+force+sensing+of+filamin+revealed+in+single-molecule+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dynamic force sensing of filamin revealed in single-molecule experiments.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (48), 19679-19684 (2012).</li>
<li>Okumus, B., Wilson, T. J., Lilley, D. M. J., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+encapsulation+studies+reveal+that+single+molecule+ribozyme+heterogeneities+are+intrinsic%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Vesicle encapsulation studies reveal that single molecule ribozyme heterogeneities are intrinsic.</a> Biophys J. 87 (4), 2798-2806 (2004).</li>
<li>Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jp012016x">Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy.</a> J Phys Chem B. 105 (48), 12165-12170 (2001).</li>
<li>Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zero-mode+waveguides+for+single-molecule+analysis+at+high+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Zero-mode waveguides for single-molecule analysis at high concentrations.</a> Science. 299 (5607), 682-686 (2003).</li>
<li>Panaretou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+binding+and+hydrolysis+are+essential+to+the+function+of+the+Hsp90+molecular+chaperone+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">ATP binding and hydrolysis are essential to the function of the Hsp90 molecular chaperone in vivo.</a> EMBO J. 17 (16), 4829-4836 (1998).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

We presenteren de experimentele procedure om gegevens van de drie kleuren smFRET voor een complexe eiwit stelsel en een stapsgewijze beschrijving van de analyse van deze metingen te verkrijgen. Deze aanpak biedt de unieke mogelijkheid om de correlatie tussen meerdere interactie sites of conformationele wijzigingen direct te beoordelen.
Om geschikte Multi-Color single-molecuul gegevens op eiwitten te verkrijgen is het belangrijk om te voeren reproduceerbare metingen op een laag geluidsniveau. D...

Veel eiwitten vervullen hun functie in dynamische complexen met andere moleculen, gemedieerd door conformationele veranderingen en voorbijgaande verenigingen over een brede waaier van tijdschalen1,2,3. Gekoppeld aan een externe energiebron (bijvoorbeeld ATP) deze dynamische interacties kunnen leiden tot directionaliteit in een functionele cyclus en uiteindelijk het onderhouden van de niet-evenwichts steady-state in een cel, een voorwaarde voor het leven.
Om volledig te begrijpen deze moleculaire machines, is een statische beschrijving geleid door structurele studies niet voldoende. Daarnaast is het essentieel te beschikken over kennis van de onderliggende kinetische model en te bepalen van de kinetische snelheidsconstanten. Verschillende bestaande methoden toestaan onderzoekers bestuderen de dynamiek van binaire interacties tussen twee moleculen van belang, bijvoorbeeld oppervlakte plasmon resonantie, ontspanning methoden met een spectroscopische uitlezing (bijvoorbeeld sprong of gestopt-flow technieken), en nucleaire magnetische resonantie. Hun toepasbaarheid is echter in de meeste gevallen beperkt tot eenvoudige tweestaten-systemen (bijvoorbeeld een gebonden en een niet-afhankelijke staat) als gevolg van de gemiddeld die inherent zijn aan bulk experimenten. In gevallen waar meer Staten of tussenproducten zijn betrokken, opleveren zij alleen een complex mengsel van de snelheidsconstanten. Single-molecuul methoden zoals optische of magnetische pincet of twee kleuren smFRET, d.w.z. een donor en één acceptor fluorophore, met een oppervlak-geïmmobiliseerd steekproef kunnen de snelheidsconstanten herstellen voor alle conformationele wijzigingen waargenomen. Echter wanneer het gaat om interacties op het gebied van meer dan één binding site, deze methoden beperkt blijven en de informatie over de wisselwerkingen mogelijk correlatie van de twee (of meer) zal alleen bereikbaar zijn via indirecte conclusies uit een aantal experimenten.
Multi kleur smFRET4,5,6,7,8,9 biedt de mogelijkheid te bestuderen van de interactie tussen deze componenten direct, in real-time en onder in de buurt van de fysiologische omstandigheden10. Hierdoor kan een te onderzoeken bijvoorbeeld de conformatieafhankelijke binding van een ligand of een ander eiwit8,-9,11. De hier gepresenteerde algemene benadering is om de expressie gebrachte eiwitten van belang op specifieke posities, één eiwit hechten aan het oppervlak van de meting-kamer, en het bijhouden van de intensiteit van de fluorescentie na verloop van tijd op een prisma-type TIRFM (voor details zie 9 label , 12). de ruimtelijke nabijheid van de verschillende kleurstoffen kan vervolgens worden bepaald uit de energie-overdracht tussen hen. Labelen van strategieën kan variëren van eiwit tot proteïne (herzien in 13) en richtsnoeren om te voorkomen dat artefacten in smFRET metingen bestaan14.
Aangezien de kleurstof van een donor energie in verschillende acceptor kleurstoffen in een multi kleur smFRET experiment overbrengen kan, is de relatieve positie van alle kleurstoffen niet toegankelijk vanaf excitatie van een kleurstof alleen15,16. Maar deze methode biedt in combinatie met afwisselende laser excitatie (ALEX17en gerecenseerd in 18) alle spatio-temporele informatie bij sub tweede en sub nanometer resolutie.
In principe, hoge resolutie structurele informatie kan worden bereikt door gebruik te maken van de afstanden tussen kleurstof berekend op basis van de combinatie van alle fluorescentie intensiteiten in een multi kleur smFRET experiment met ALEX. Echter richten hier we ons op staat identificatie en scheiding, evenals de winning van kinetische modellen, waar meerdere kleuren smFRET onontbeerlijk. Wanneer "alleen" structuurbepaling door triangulatie is gewenst, kunnen een aantal eenvoudiger twee kleuren smFRET experimenten met hoge signaal-/ ruisverhouding uitgevoerde12,19.
We gebruiken de gedeeltelijke fluorescentie (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq1.jpg">) als een proxy voor de energie-overdracht tussen twee fluorophores7. De PF is berekend op basis van de fluorescentie intensiteit analoog aan de efficiëntie van de FRET van een experiment van twee kleuren:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq2.jpg">
Waar, <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq3v2.jpg"> is de intensiteit in emissie kanaal em na excitatie met kleur ex, en c is de acceptor met de langste golflengte. Detectie kanalen vertegenwoordigen dezelfde positie in de monsterkamer maar record verschillende spectrale reeksen van de fluorescentie-licht. Dezelfde id voor excitatie en emissie in dit protocol worden gebruikt (dat wil zeggen, "blauw", "groene" en "rode").
De gemeten fluorescentie-intensiteiten hangen vanwege experimentele tekortkomingen van niet alleen op de energie-overdracht, maar ook op fluorophore en setup-eigenschappen. Met het oog op het spuitrendement waar energie tussen twee fluorophores, de gemeten intensiteiten moeten worden gecorrigeerd. De volgende procedure is gebaseerd op referentie9. Correctiefactoren voor zichtbare lekkage (lk, dat wil zeggen, de detectie van fotonen van een fluorophore in een kanaal voor een andere kleurstof aangewezen) en schijnbare gamma (ag, dat wil zeggen, de fluorescentie quantumrendement van de kleurstof en de de efficiëntie van de detectie van het kanaal) single-molecuul sporen die aantonen dat een accepteerder bleken gebeurtenis worden verkregen.
De lekkage van de kleurstof van de donor in elk mogelijk acceptor kanaal is berekend op basis van alle gegevenspunten in de sporen van de opgenomen fluorescentie waar de acceptor kleurstof gebleekt maar de donor is nog steeds TL (<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq4.jpg">):
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq5.jpg">
De mediaan van de lekkage histogram wordt gebruikt als de schijnbare lekkage factor. Na correctie voor lekkage, wordt de schijnbare gamma factor bepaald door de dezelfde set van sporen. Het wordt berekend door de verandering van fluorescentie in de acceptor kanaal door de verandering van fluorescentie in het kanaal van de donor bij het bleken van de acceptor kleurstof:
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq6.jpg">
Waarbij c staat weer voor de detectie-kanaal voor de acceptor met de langste golflengte. De mediaan van de resulterende verdeling wordt gebruikt als de schijnbare correctiefactor.
De gecorrigeerde intensiteiten in elk kanaal worden verkregen door:
<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq7.jpg">
De PF wordt dan berekend volgens:
<img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq8.jpg">
Verschillende bevolkingsgroepen kunnen worden gescheiden in de multi-dimensionale ruimte overspannen door de PF-s. De positie en de breedte van elke staat wordt bepaald door het aanbrengen van de gegevens met multi-dimensionale Gaussian functies. Latere optimalisatie van één wereldwijde HMM gebaseerd op alle sporen van de PF biedt een kwantitatieve beschrijving van de waargenomen kinetiek. Zelfs kleine veranderingen van de tarieven zijn waarneembaar.
HMMs bieden een manier van afgeleid van een staatsmodel uit een collectie van luidruchtige tijd sporen. Het systeem wordt beschouwd als in één van een reeks van discrete, verborgen frames op een bepaald moment en de eigenlijke observatie (dat wil zeggen, de emissie) is een probabilistische functie van deze verborgen staat20. In het geval van TIRFM smFRET gegevens, kan de emissie waarschijnlijkheden bik per staat ik worden gemodelleerd door continue Gaussian waarschijnlijkheid dichtheid functies. Bij regelmatig verdeelde discrete tijd punten, kunnen overgangen van de ene naar een andere staat optreden volgens de overgang waarschijnlijkheid dat tijd-invariant is en hangt alleen af van de huidige status. De overgang matrix A bevat deze overgang waarschijnlijkheden eenij tussen alle verborgen frames. De verdeling van de begintoestand <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq9.jpg"> geeft de staatspecifieke waarschijnlijkheid <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq10.jpg"> voor het eerste punt van de tijd van een spoor van de tijd. Met behulp van een maximaal-kans aanpak, kunnen deze parameters worden geoptimaliseerd om het best beschrijven de gegevens met de vooruit-achteruit en Baum-Welch algoritmen20,21. Dit levert de maximale waarschijnlijkheid schatters (MLE). Ten slotte kan de volgorde van de staat die waarschijnlijk geproduceerd het traject van opmerkingen met de Viterbi algoritme worden afgeleid. In tegenstelling tot andere HMM analyses van smFRET gegevens24,25,26 wij gebruiken niet de HMM als een louter "glad" van de gegevens, maar de kinetische staatsmodel uittreksel uit de gegevensset zonder de noodzaak voor het aanbrengen van de nadruktijd histogrammen27. HMM analyse wordt gedaan met in-house scripts met Igor Pro. Tenuitvoerlegging van de gedragscode is gebaseerd op referentie21. Wij bieden een software kit en voorbeeldige gegevens op onze website om te volgen van de punten 5 en 6 van dit protocol (https://www.singlemolecule.uni-freiburg.de/software/3d-fret). Volledige software is beschikbaar op aanvraag.
Tijd van punten in het gegevens met PF < -1 of PF > 2 in elk kanaal detectie de minimale uitstoot kans voor alle Staten (10-200) zijn toegewezen. Hiermee voorkomt u dat kunstmatige overgangen op deze gegevenspunten.
De parameters voor de emissie waarschijnlijkheid worden verkregen van de pasvorm van de 3D histogram van de PF met Gaussiaans functies zoals beschreven in stap 5.7. Deze parameters worden vast gehouden tijdens de optimalisatie van de HMM.
In de gepresenteerde benadering, zijn de begintoestand distributie vector en de transitie matrix wereldwijd gebruikt om te beschrijven het hele ensemble van sporen. Zij zijn bijgewerkt op basis van alle N -moleculen van de gegevensset volgens referentie27.
Startparameters voor de distributie van de oorspronkelijke toestand worden bepaald uit 2D projecties van de PF -histogram (stap 5.3) en de waarschijnlijkheid van de overgang zijn ingesteld op 0.05 met uitzondering van de waarschijnlijkheid om te verblijven in dezelfde staat, die zodanig zijn gekozen dat is de kans op een bepaalde toestand laten genormaliseerd naar eenheid.
Een waarschijnlijkheid profiling methode wordt gebruikt om betrouwbaarheidsintervallen (CIs) voor alle overgang tarieven21,22, die dienen als zinvolle schattingen voor hun onzekerheid. Voor de berekening van de grenzen van de CI voor een bepaald tempo, is de kans op overgang van belang op een andere waarde dan de MLE bevestigd. Dit levert de test model λ'. Een waarschijnlijkheid verhouding (LR) test van de kans op <img alt="Equation 16" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq16.jpg"> gezien de gegevensset 0 wordt uitgevoerd volgens:
<img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq11.jpg">
De betrouwbaarheid van 95% gebonden voor de parameter wordt bereikt wanneer LR 3.841, de 95% kwantiel van een x2 overschrijdt-verdeling met een mate van vrijheid22,23.
De kracht van de methode is aangetoond door middel van de Hsp90. Deze overvloedige eiwit is gevonden in bacteriën en eukaryoten, en maakt deel uit van de cellulaire stress reactie28. Het is een veelbelovende drug doelwit van kanker behandeling29. Hsp90 is een homodimer met één nucleotide-bindende zak op het N-terminaal gebied van elke subeenheid30. Het kunt overgangen tussen ten minste twee wereldwijd verschillende conformaties, één gesloten en één N-terminal open, V-vormige conformatie19,31,32ondergaan. De dimeric aard vraag direct de van de wisselwerking tussen de twee nucleotide bandplaatsen in Hsp90.
In het volgende, bieden wij een stapsgewijze protocol voor de data-acquisitie en de analyse van een experiment van de drie kleuren smFRET op gist Hsp90 en nucleotide. De conformatieafhankelijke binding van fluorescently geëtiketteerde AMP-PNP (AMP-PNP *, een niet-hydrolyseerbare analoog van ATP) wordt geanalyseerd. De toepassing van de beschreven procedure toelaat de studie van de nucleotide-bindende en tegelijkertijd de conformationele veranderingen van Hsp90 en daardoor onthult de Allosterie tussen de twee nucleotide-bindende zakken van Hsp90.

<table><tbody><tr><td>Setup</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>vibration-damped optical table&nbsp;&nbsp;</td><td>Newport, Irvine, CA, USA</td><td>RS2000</td><td></td></tr><tr><td>OBIS 473nm LX 75mW LASER</td><td>Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td><td>1185052</td><td></td></tr><tr><td>OBIS 532nm LS 50mW LASER</td><td>Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td><td>1261779</td><td></td></tr><tr><td>OBIS 594nm LS 60mW LASER</td><td>Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td><td>1233470</td><td></td></tr><tr><td>OBIS 637nm LX 140mW LASER</td><td>Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td><td>1196625</td><td></td></tr><tr><td>laser control unit</td><td>Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td><td>1234465</td><td>Scientific Remote</td></tr><tr><td>aspheric telescope lenses</td><td>Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA</td><td></td><td>d=25.4mm, f=50mm and f=100mm</td></tr><tr><td>CF ex1</td><td>AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany</td><td>ZET 473/10</td><td>cleanup filter excitation</td></tr><tr><td>CF ex2</td><td>AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany</td><td>ZET 532/10</td><td>cleanup filter excitation</td></tr><tr><td>CF ex3</td><td>AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany</td><td>ZET 594/10</td><td>cleanup filter excitation</td></tr><tr><td>CF ex4</td><td>Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA</td><td>FL635-10</td><td>cleanup filter excitation</td></tr><tr><td>DM ex1</td><td>AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany</td><td>ZQ594RDC</td><td>dichroic mirror excitation</td></tr><tr><td>DM ex2</td><td>AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany</td><td>570DCXR</td><td>dichroic mirror excitation</td></tr><tr><td>DM ex3</td><td>AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany</td><td>ZQ491RDC</td><td>dichroic mirror excitation</td></tr><tr><td>AOTFnC-Vis</td><td>AA Opto-Electronic, Orsay, France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lambda;/4 plate</td><td>Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA</td><td>AQWP05M-600</td><td></td></tr><tr><td>CFI Apo TIRF 100x</td><td>Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA</td><td></td><td>high-NA objective</td></tr><tr><td>piezo focus positioner MIPOS 250 CAP</td><td>piezosystem jena GmbH, Jena, Germany</td><td></td><td>Piezo Controller NV 40/1 CLE</td></tr><tr><td>piezo stepper</td><td>Newport, Irvine, CA, USA</td><td>PZA12</td><td>PZC200-KT NanoPZ Actuator Kit</td></tr><tr><td>achromatic aspheric lenses</td><td>Qioptiq Photonics GmbH &amp; Co. KG, Göttingen, Germany</td><td>G322-304-000</td><td>d=50mm, f=200mm</td></tr><tr><td>adjustable optical slit</td><td>Owis GmbH, Staufen i. Br., Germany</td><td>27.160.1212</td><td>max. aperture 12 x 12 mm</td></tr><tr><td>DM det1</td><td>AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany</td><td>T 600 LPXR</td><td>dichroic mirror detection</td></tr><tr><td>DM det2</td><td>AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany</td><td>H 560 LPXR superflat</td><td>dichroic mirror detection</td></tr><tr><td>DM det3</td><td>AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany</td><td>HC BS R635</td><td>dichroic mirror detection</td></tr><tr><td>BP det1</td><td>AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany</td><td>525/40 BrightLine HC</td><td>bandpass filter detection</td></tr><tr><td>BP det2</td><td>AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany</td><td>586/20 BrightLine HC</td><td>bandpass filter detection</td></tr><tr><td>BP det3</td><td>AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany</td><td>631/36 BrightLine HC</td><td>bandpass filter detection</td></tr><tr><td>BP det4</td><td>AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany</td><td>700/75 ET Bandpass</td><td>bandpass filter detection</td></tr><tr><td>optical shutters detection</td><td>Vincent Associates, Rochester, NY, USA</td><td>Uniblitz VS25S2T0&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD iXon Ultra 897</td><td>Andor Technology Ltd, Belfast, Northern Ireland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>digital I/O card, PCIe-6535</td><td>National Instruments, Austin, Texas, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>syringe pump</td><td>Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA</td><td>PHD22/2000</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Flow chamber</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>quartz slides</td><td>G. Finkenbeiner Inc, Waltham, MA, USA</td><td></td><td>Spectrosil2000, h=3mm</td></tr><tr><td>TEGADERM film</td><td>3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany</td><td>1626W</td><td>10 x 12cm</td></tr><tr><td>spray adhesive</td><td>3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany</td><td>Photo Mount 050777</td><td></td></tr><tr><td>glycerol</td><td>Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany</td><td>Immersol G</td><td></td></tr><tr><td>immersion oil</td><td>OLYMPUS EUROPA SE &amp; CO. KG, Hamburg, Germany</td><td>IMMOIL-F30CC</td><td></td></tr><tr><td>prism</td><td>Vogelsberger Quarzglastechnik GmbH, Hauzenberg, Germany</td><td></td><td>Suprasil1</td></tr><tr><td>aluminium prism holder</td><td></td><td></td><td>custom built</td></tr><tr><td>hollow setscrews</td><td>Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA</td><td></td><td>with custom drilling</td></tr><tr><td>Tygon S3 E-3603 tubing</td><td>neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany</td><td>2-4450</td><td>ACF00001</td></tr><tr><td>PTFE tubing</td><td>Bohlender GmbH, Grünsfeld, Germany</td><td>S1810-08</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Sample</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>yeast Hsp90 D61C, Q385C_biotin</td><td></td><td></td><td>UniProt ID P02829</td></tr><tr><td>Maleimide derivatives of Atto488, Atto550</td><td>ATTO-TEC GmbH, Siegen, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AMP-PNP*</td><td>Jena Bioscience, Jena, Germany</td><td></td><td>&gamma;-[(6-Aminohexyl)-imido]-AMP-PNP-Atto647N</td></tr><tr><td>Fluospheres</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>F8764</td><td>amine-modified, 0.2 &mu;m, yellow-green fluorescent</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Andor Solis</td><td>Andor Technology Ltd, Belfast, Northern Ireland</td><td></td><td>version 4.30</td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>National Instruments, Austin, Texas, USA</td><td></td><td>version 2012, 32bit; misc. hardware control</td></tr><tr><td>MDS control software</td><td>AA Opto-Electronic, Orsay, France</td><td></td><td>version 2.03a</td></tr><tr><td>Coherent Connection</td><td>Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td><td></td><td>version 3

met behulp van 3 single-molecuul fret te bestuderen de correlatie van eiwitinteractie

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Single-molecuul Förster resonance energieoverdracht (smFRET) is een veel gebruikte biofysische techniek te bestuderen van de dynamiek van biomoleculen geworden. Voor veel moleculaire machines in een cel eiwitten hebben om op te treden samen met partners van de interactie in een functionele cyclus te vervullen van hun taak. De uitbreiding van twee-kleur naar multi smFRET maakt het mogelijk om gelijktijdig sonde meer dan één interactie of conformationele verandering. Dit niet alleen voegt een nieuwe dimensie aan smFRET experimenten, maar het biedt ook de unieke mogelijkheid te rechtstreeks bestuderen de opeenvolging van gebeurtenissen en te detecteren gecorreleerde interacties bij gebruik van een geïmmobiliseerdet monster en een totale interne reflectie fluorescentie Microscoop (TIRFM). Daarom is Multi-Color smFRET een veelzijdig instrument voor het bestuderen van biomoleculaire complexen op een kwantitatieve manier en in een voorheen onhaalbaar detail.
We laten hier zien hoe te overwinnen van de bijzondere uitdagingen voor meerdere kleuren smFRET experimenten op eiwitten. Presenteren wij gedetailleerde protocollen voor het verkrijgen van de gegevens en voor het extraheren van de kinetische gegevens. Het gaat hierbij om trace selectiecriteria, scheiding van staat en het herstel van de Braziliaanse trajecten van de luidruchtige gegevens met behulp van een 3D ensemble verborgen Markov Model (HMM). Vergeleken met andere methoden, is de kinetische gegevens niet hersteld van de nadruktijd tijd histogrammen, maar rechtstreeks vanuit de HMM. Het kader van maximale kans laat ons tot het kritisch evalueren de kinetische model en zinvolle onzekerheden voor de tarieven.
Door het toepassen van onze methode op de warmte schok eiwit 90 (Hsp90), kunnen we ontwarren van de nucleotide-bindende en de mondiale conformationele veranderingen van het eiwit. Dit kan we direct de Allosterie tussen de twee nucleotide-bindende zakken van de Hsp90-dimeer observeren.

Multi kleur smFRET metingen zorgen ervoor dat de directe correlatie tussen twee of meer afzonderlijke interactie sites. Dit maakt de techniek uniek zijn voor het onderzoeken van multi-component systemen, zoals eiwitcomplexen. We richten op de presentatie van een drie kleuren smFRET experiment hier, die als een illustratief voorbeeld fungeert.
De algemene workflow van de methode is afgebeeld in Figuur 1</stro...

Hier presenteren we een protocol om gegevens van de drie kleuren smFRET en haar analyse met een 3D ensemble verborgen Markov Model te verkrijgen. Met deze benadering kunnen wetenschappers kinetische informatie ophalen uit complexe eiwit systemen, met inbegrip van Allosterie of gecorreleerde interacties.

Met behulp van 3 Single-molecuul FRET te bestuderen de correlatie van eiwitinteractie

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Het algemene doel van deze procedure is om de dynamiek van complexe eiwitsystemen op een kwantitatieve manier te bestuderen, met een focus op gecorreleerde interacties zoals coöperativiteit. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van kwantitatieve biologie waarin eiwitcomplexen en hun dynamische interacties van centraal belang zijn. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het dynamisch multicolor single molecule FRET toepast op biologisch relevante systemen.Voorafgaand aan het samenstellen van de flowkamer snijdt u een flowkanaal in een 40 micron dikke transparante zelfklevende film, spuit snel drogende lijm op de niet-zelfklevende zijde van de film en laat de lijm drogen. Om te beginnen met de montage van de flowkamer verkrijgt u een drie millimeter dikke PEG biotin PEG gefunctionaliseerde gefuseerde kwartsschuif met inlaat- en uitlaatgaten. Breng de met spuitlijm beklede zijde van het plafondfilm aan op de gefunctionaliseerde zijde van de schuif, waarbij het kanaal wordt uitgelijnd met de inlaat- en uitlaathaken.Verwarm de schuif gedurende één minuut op een heetplaat tot 80 graden Celsius. Druk de film gedurende 30 seconden o

using-three-color-single-molecule-fret-to-study-correlation-protein

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Dit protocol wordt beschreven hoe u foto eiwit-eiwit interacties met behulp van een FRET-gebaseerde nabijheid assay.

Imaging eiwit-eiwit interacties In vivo</em

In this video, we describe the fluorescence anisotropy technique to study the interactions between the fluorophore-tagged Shwachman-diamond syndrome (SBDS) protein and the elongation factor-like 1 GTPase (EFL1). On incubating SBDS proteins with gradually increasing concentrations of EFL1, a steady increase in anisotropy is observed, indicating a successful interaction between the two proteins.

Fluorescence Anisotropy-Based Detection of Protein-Protein Interactions

Dit protocol beschrijft een kalibratie-vrije aanpak voor het kwantificeren van eiwit homo-oligomerisatie in vitro op basis van fluctuatiemarges Fluorescentiespectroscopie met behulp van commerciële licht scanning microscopie. De juiste overname-instellingen en de analysemethoden worden weergegeven.

Kalibratie-gratis In Vitro kwantificering van eiwit Homo-oligomerisatie met behulp van commerciële instrumentatie en Software van de analyse van de helderheid van gratis, Open Source

Dit protocol beschrijft een fluorescentie schommelingen spectroscopie gebaseerde aanpak om te onderzoeken van interacties tussen eiwitten bemiddelen cel interacties, d.w.z. eiwitten gelokaliseerd in cel kruispunten, rechtstreeks in levende cellen. Wij bieden gedetailleerde richtsnoeren op kalibreren van het instrument, data-acquisitie en analysemethoden, inclusief correcties mogelijk artefact bronnen.

Een fluorescentie schommelingen spectroscopie Assay voor eiwit-eiwitinteractie op cel contacten

Eiwit-eiwitinteractie zijn kritisch voor biologische systemen, en studies over de bindende kinetiek inzicht verwerven in de dynamiek en de functie van eiwitcomplexen. Beschrijven we een methode die kwantificeert de kinetische parameters van een eiwit complex met behulp van fluorescentie resonantie-energie-overdracht en de techniek gestopt-flow.

Met behulp van In Vitro fluorescentie Resonance Energy Transfer te bestuderen van de dynamiek van eiwitcomplexen op de tijdschaal van een milliseconde

We beschrijven hier een protocol om eiwit-eiwit interacties te karakteriseren tussen twee zeer verschillend uitgedrukte eiwitten in levende Pseudomonas aeruginosa met behulp van FLIM-FRET metingen. Het protocol omvat bacteriën stam constructies, bacteriën immobilisatie, beeldvorming en post-imaging data-analyse routines.

FLIM-FRET Metingen van eiwit-eiwit interacties in levende bacteriën.

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) tussen twee fluorofoormoleculen kan worden gebruikt voor het bestuderen van eiwitinteracties in de levende cel. Hier wordt een protocol gegeven over hoe FRET in levende cellen kan worden gemeten door het detecteren van gesensibiliseerde emissie van de acceptor en het blussen van het donormolecuul met behulp van confocale laserscanmicroscopie.

Beoordeling van eiwitinteracties in levende cellen met FRET-gesensibiliseerde emissie

Single molecule fluorescentie energieoverdracht is een methode die de tRNA-dynamiek volgt tijdens ribosomale eiwitsynthese. Door individuele ribosomen te volgen, worden inhomogene populaties geïdentificeerd, die licht werpen op mechanismen. Deze methode kan worden gebruikt om biologische conformatieveranderingen in het algemeen te volgen om dynamisch-functierelaties in vele andere complexe biosystemen te onthullen. Single molecule-methoden kunnen niet-snelheidsbeperkende stappen en laagbevolkte...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study van ribosoom eiwitsynthese

Hier presenteren we een methode om de vorming van ternaire complexen tussen drie eiwitpartners te visualiseren met behulp van fluorescerende gelabelde eiwitten door biFC-gebaseerde FRET-FLIM-assay. Deze methode is waardevol voor het bestuderen van eiwit-eiwitinteractiecomplexen in vivo.

Bepaling van de tripartiete interactie tussen twee monomeren van een MADS-box transcriptiefactor en een calciumsensoreiwit door BiFC-FRET-FLIM-assay

We presenteren een experimenteel protocol en data-analyseworkflow om live cell dual-color fluorescentie cross correlation spectroscopie (FCCS) uit te voeren in combinatie met Förster Resonance Energy transfer (FRET) om membraanreceptordynamica in levende cellen te bestuderen met behulp van moderne fluorescentielabeltechnieken.

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy om eiwit-eiwitinteractie en eiwitdynamica in levende cellen te bestuderen

Van veel intrinsiek ongeordende eiwitten is aangetoond dat ze deelnemen aan de vorming van zeer dynamische biomoleculaire condensaten, een gedrag dat belangrijk is voor tal van cellulaire processen. Hier presenteren we een op beeldvorming gebaseerde methode met één molecuul voor het kwantificeren van de dynamiek waarmee eiwitten met elkaar interageren in biomoleculaire condensaten in levende cellen.

Meting van de dynamiek van eiwitinteracties in biomoleculaire condensaten

Leer hoe u driedimensionale single-molecule FRET gebruikt om eiwitdynamiek en gecorreleerde interacties zoals coöperativiteit te bestuderen. Deze methode maakt kwantitatieve analyse van complexe eiwitcomplexen mogelijk.

Met behulp van 3 Single-molecuul FRET te bestuderen de correlatie van eiwitinteractie

Meer video's verkennen