Het combineren van kwantitatieve voedselinname-Assays en onder dwang activeren neuronen om te bestuderen van eetlust in Drosophila

Het algemene doel van deze procedure is om de voedselinname van volwassen Drosophila kwantitatief te meten, wat een middel biedt om de effecten van genetische manipulaties zoals thermogenetische en optogenetische activering van neuronen te evalueren. Deze metingen kunnen helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in het voedingsveld, zoals de neuromechanica van honger, verzadiging en eetlust. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het tegelijkertijd de voedselinname van meerdere groepen vliegen kwantificeert, waardoor het vooral nuttig is om abnormaal voedende vliegen te identificeren in genetische screenings.

Om te beginnen, verzamel benodigdheden om de buitencontainer voor te bereiden. Suspendeer 0,5 gram agarose en 50 milliliter dubbel gedestilleerd water. Verhit met frequent roeren, en kook om volledig op te lossen op een magnetische roerder met een verwarmingsplaat.

Wanneer de 1% agarose afkoelt tot ongeveer 60 graden Celsius, breng vijf milliliter over naar een lege buitencontainer en houd de container open totdat de agarose is afgekoeld tot kamertemperatuur om een agarosepad te verkrijgen. Voeg vervolgens 0,5 gram agarose toe aan 50 milliliter dubbel gedestilleerd water. Verhit met frequent roeren en kook om volledig op te lossen op een magnetische roerder met een verwarmingsplaat.

Wanneer de 1% agarose afkoelt tot ongeveer 60 graden Celsius, voeg 1,71 gram sucrose toe aan de agarose om 100 millimol sucrose te verkrijgen. Voeg 0,25 gram blauwe kleurstof toe aan de agaroseoplossing om 0,5% gewicht per volume gekleurd etiket voedsel te verkrijgen. Bereid vervolgens de binnencontainer voor.

Plaats de lege binnencontainers op een platte horizontale oppervlakte. Voeg vervolgens 750 microliter blauw gekleurd voedsel toe aan individuele voedselcontainers. Laat minimaal vijf minuten stollen.

Breng een gevulde binnencontainer over naar een voorbereide buitencontainer en plaats deze in het midden van de agarosepad. Bereid voedingskamers met kleurvrij voedsel voor achtergrondsubtraksie. Laat de voedingskamers 40 minuten open staan bij kamertemperatuur, totdat de wand van de buitencontainer vrij is van condens.

Voordat met gedragsexperimenten wordt begonnen, brengt u de voorbereide voedingskamers twee uur in evenwicht bij de experimentele temperatuur van 30 graden Celsius om ervoor te zorgen dat de temperatuur relatief uniform is in de voedingskamers. Om het voedingsproces te starten, brengt u voorzichtig 20 vliegen over van hun thuisviaal naar een voorverwarmde voedingskamer door zachtjes te tikken. Zet het voedingsproces door op 30 graden Celsius gedurende 60 minuten.

Stop met voeden door de voedingskamers 30 minuten lang te bevriezen bij min 80 graden Celsius. Breng voorzichtig 20 vliegen over van één viaal naar een voedingskamer door zachtjes te tikken. Plaats vervolgens de kamer zijwaarts op de verlichtingsopstelling.

Gebruik voor optogenetische manipulatie een array van oranje LED's als lichtstimulatiebron en bevestig een horizontale plexiglasplaat boven de LED's om de voedingskamers tijdens belichting te ondersteunen. Houd de opstelling in een incubator op 25 graden Celsius met 60% luchtvochtigheid. Stimuleer de genetische controlevliegen parallel met de Taotie-GAL4 UAS CsChrimson vliegen, maar in verschillende voedingskamers.

Vervolg het voedingsproces gedurende 60 minuten met achterste verlichting door het oranje licht. Bevriest vervolgens de voedingskamers gedurende 30 minuten bij min 80 graden Celsius. Nadat het voeden is gestopt, giet u alle 20 vliegen uit de voedingskamer op een stuk weegpapier.

Breng ze vervolgens over in een 1,5 milliliter buis met een zachte borstel. Voeg 500 microliter PBST toe aan de buis en homogeniseer de vliegen met behulp van een maalmolen op 60 hertz gedurende vijf seconden. Bevestig vervolgens voldoende homogenisatie door observatie wanneer er geen detecteerbare fragmenten van lichaamsdelen zijn.

Spin de buizen met homogenaten gedurende 30 minuten bij 1300 RPM om het puin te verwijderen. Na centrifugatie, brengt u 100 microliter supernatant over naar een putje van een 96-wells plaat. Om de verkeerde berekening van absorbenten te voorkomen die worden veroorzaakt door puin, neemt u voorzichtig de gebruikte buis uit de centrifuge en laat u voorzichtig het supernatant vallen zonder de pallet te verstoren.

Nadat alle monsters zijn geladen, plaatst u de plaat in een plate reader om de absorbenten van de monsters te meten bij 630 nanometer. De voedingsrespons werd gekwantificeerd door vliegen met detecteerbare kleurstof in de darm visueel te inspecteren en te scoren. Na activering van Taotie-neuronen, vertoonde ongeveer 58% van de Taotie dTRPA1 vliegen sterk voedingsgedrag. En 23% van deze vertoonde mild voedingsgedrag. Acuut geactiveerde Taotie-GAL4 neuronen door TRPA1 verhoogden dramatisch de voedselinname, wat suggereert dat de Taotie-GAL4 gelabelde neuronen deelnemen aan de regulatie van voedselinname van volwassen Drosophila. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de hoeveelheid voedselinname kunt kwantificeren na het manipuleren van de activiteit van neuronen om neuromechanismen van voedingscontrole bij volwassen Drosophila melanogaster te onderzoeken.