Eencellige Microfluidic analyse van Bacillus subtilis

Het algemene doel van deze microfluïdische experimentele set-up is om de langetermijnobservatie van individuele bacteriecellen mogelijk te maken onder constante, zeer gecontroleerde omgevingsomstandigheden. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van bacteriële fysiologie te beantwoorden, zoals wat zijn de langetermijnresponspatronen van individuele cellen op stress of hoe varieert een heterogene fenotype over een populatie met de tijd. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we individuele cellijnen kunnen observeren gedurende tientallen of zelfs honderden generaties, onder constante, uniforme en zeer gecontroleerde omgevingsomstandigheden.

Na het voorbereiden van PDMS-polymeer volgens het tekstprotocol, plaats een siliconen master op een stuk ongebroken aluminiumfolie in een polystyreen Petri-schaal. Giet het ontgaste PDMS-mengsel over de master tot een diepte van ongeveer vijf millimeter. Ontgas vervolgens de schaal gedurende ten minste 10 minuten.

Harden het PDMS in een oven bij 60 graden Celsius gedurende ten minste een uur en koel het af tot kamertemperatuur. Verwijder vervolgens het aluminiumfolie met de master en het uitgeharde PDMS van de plaat. Score voorzichtig en trek het aluminiumfolie van de achterkant van de master af.

Vervolgens moet u voorzichtig het PDMS van de master af pellen. Als wafel, bevat het meestal meerdere microfluïdische apparaten met licht verschillende afmetingen. Gebruik een schone, scherpe scalpel om een enkel apparaat op de juiste maat te snijden.

Plaats een stuk doorschijnend kantoortape over de gepatroneerde kant van het apparaat om de zichtbaarheid van de gepatroneerde functies te verbeteren. De inlaat- en uitlaatpoorten worden geïdentificeerd als cirkelvormige gebieden aan tegenovergestelde uiteinden van de zichtbare vloeistofkanalen. Draai het PDMS-apparaat met de patroonzijde naar beneden en gebruik een 0,75 millimeter biopsie-pons om door het apparaat te ponsen naar de gemarkeerde stippen.

Gooi vervolgens de ponsaties weg. Een pincet kan nodig zijn om de ponsaties uit het apparaat te verwijderen. Plaats het gereinigde en gedroogde dekglas en PDMS-apparaat in een zuurstofplasmareiniger en behandel het apparaat met de hier getoonde instellingen met plasma.

Direct nadat de plasmabehandeling is voltooid, verwijdert u het apparaat en het dekglas uit de plasmareiniger. Draai de PDMS om en plaats deze op het midden van het dekglas zodat de patroonzijde contact maakt met het glas. Zorg ervoor dat de voedingskanalen zijn uitgelijnd met de lange toegang van het dekglas.

Druk heel voorzichtig naar beneden om ervoor te zorgen dat de PDMS tegen het glas afdicht. Bak het geassembleerde apparaat in een oven bij 60 graden Celsius gedurende ten minste een uur. Controleer na het bakken handmatig of de PDMS aan het glas is gebonden door voorzichtig op een hoek van het apparaat te drukken.

Na het snijden van polymeerbuis volgens het tekstprotocol, monteer Y-verbindingen voor knijpkleppen, indien gebruikt, door twee centimeter lengte van flexibele siliconenbuis af te snijden en deze te bevestigen aan de bovenste baretten van de Y en een centimeter lengte van siliconenbuis aan de onderste barret van de Y. Snijd vervolgens 10 centimeter lengte van polymeerbuis en verbind deze aan het ene uiteinde met de schakelverbinding door ze in de een centimeter siliconenbuissegmenten op de onderste barret van de Y te steken. Verbind de buislengten aan het andere uiteinde met 21-gauge naalden die zijn verwijderd van hun plastic spuitadapters en ongeveer 90 graden gebogen zijn, ongeveer negen millimeter vanaf het naalduiteinde. Verbind 21-gauge stompe naalden aan het ene uiteinde van de buissegmenten die van de spuiten naar het schakelapparaat zullen lopen door de naalden in de buis in te steken. Plaats de andere uiteinden van elke buislengte in de siliconenbuissegmenten op de inlaatbaretten van de Y-verbindingen.

Na het vullen van spuiten met bacteriegroeimedium, aangevuld met BSA, volgens het tekstprotocol, verbindt u de geladen spuiten met de voorbereide 21-gauge naalden, bevestigt u deze aan de inlaatbuis en laadt u de spuiten in de spuitpompen. Spuit lucht uit de inlaatleidingen door de spuitpompen met een hoge stroomsnelheid te laten lopen en de spuitpompen verticaal te plaatsen, waarbij de spuiten worden getikt om luchtbellen naar boven te brengen. Zodra de lucht uit de spuit is gespoten, plaatst u de spuitpomp horizontaal en tikt of veegt u progressief de polymeerleidingen van de spuiten, omhoog door het schakelapparaat, om eventuele luchtbellen te ontdoen en te spoelen.

Herhaal dit proces voor de tweede bank van spuiten als u van medium wisselt. Nadat de luchtbellen zijn gespoeld, stelt u de fase-twee spuitpomp in op 1,5 microliter per minuut en zet u de stroom dan uit. Plaats kleine klemmen op de segmenten van flexibele buis op de tak van de Y-verbindingen die overeenstemmen met de tweede mediumfase en blijf de fase-één pomp laten lopen om het tweede medium stroomafwaarts van de Y-verbinding te spoelen.

Om het PDMS-apparaat te laden, begint u door voorzichtig lege, dunne gel-laadmicropipettipjes in de uitlaatgaten van het microfluïdische apparaat te plaatsen. Gebruik dunne gel-laadtips met de P200-micropipet en passiveer het apparaat door medium met één milligram per milliliter BSA in de inlaatgaten te injecteren, waarbij u de tips en de uitlaatgaten observeert om het vullen van de microfluïdische kanalen te controleren. Incubeer het apparaat op kamertemperatuur gedurende ongeveer vijf minuten.

Vervolgens, met behulp van vergelijkbare tips, laadt u elke kanaal met de opnieuw gesuspendeerde cellen met behulp van de tips in het uitlaatkanaal om de voortgang van de cellen door het apparaat te volgen. Verwijder voorzichtig de gel-laadtips uit de uitlaatgaten, werk een voor een om schade aan het apparaat te voorkomen. Centrifugeer het apparaat in een tafelcentrifuge in een geschikte rotoradapter bij ongeveer 6.000 keer g gedurende 10 minuten.

Controleer succesvolle