Een geïntegreerd Platform voor het toewijzen van de genoom-brede van chromatine Staten met behulp van High-throughput ChIP-sequencing in Tumor weefsels

Het algemene doel van dit protocol is om op een onbevooroordeelde manier combinatorische chromatine-toestandspatronen in tumorweefsels en kankercellijnen te identificeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het veld van kanker-epigenetica, zoals hoe een dor histone-modificatietoestand kan bijdragen aan tumorontstaan. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat meerdere histone-modificaties, evenals meerdere monsters, zowel tegelijkertijd als efficiënt kunnen worden verwerkt.

Los eerst handmatig 50 milligram melanoomweefsel en twee milliliter Hank's Balanced Salt Solution of HBSS op met behulp van een steriele scheermesjes. Snijd het weefsel gedurende ongeveer vijf minuten in een steriele weefselkweekschaal in stukken van drie of vier millimeter. Breng de weefseloplossing over in een dissociatorbuis en voeg nog eens acht milliliter HBSS toe.

Dissocieer het weefsel verder, met behulp van een dissociator, totdat het gehomogeniseerd is. Kruis vervolgens het weefsel door 200 microliter 16% formaldehyde per drie milliliter HBSS toe te voegen. Schud het mengsel met een mixer gedurende exact 10 minuten op 37 graden Celsius bij 10 omwentelingen per minuut.

Na het verwijderen van het monster uit de incubator, voeg 200 microliter tumorale glycine per drie milliliter monster toe en schud het mengsel gedurende vijf minuten op 37 graden Celsius bij 10 omwentelingen per minuut. Centrifugeer het monster gedurende vijf minuten bij 934 keer g op vier graden Celsius met behulp van een tafelcentrifuge. Verwijder na voltooiing het supernatant en voeg vijf milliliter ijskoud PBS toe.

Centrifugeer vervolgens het monster opnieuw gedurende vijf minuten bij 934 keer g en verwijder het supernatant. Voeg 300 microliter ChIP-oogstbuffer met proteaseremmers toe per 50 milligram weefsel en lyseeer de monsters gedurende 30 minuten op ijs. Terwijl de cellen worden gelyseerd, zet de waterbad-disruptor en het geassocieerde koelsysteem aan en laat de temperatuur vier graden Celsius bereiken.

Plaats de sonicatorbuis in de waterbad-disruptor en soniceer het melanoomweefsel gedurende 60 cycli van 30 seconden aan en 30 seconden uit om chromatinefragmenten van 200 tot 600 basenparen te verkrijgen. Voor acht milligram melanoomweefsel, incubeer drie microgram van elk histone-antilichaam met 20 microliter eiwit g magnetische kralen en 100 microliter bindingsremmingsbuffer gedurende twee uur bij vier graden Celsius met rotatie, met behulp van een buisrevolutie. Verdun het monster na sonicatie vijf keer met ChIP-dilutiebuffer om de SDS-concentratie te verlagen tot 0,1%. Nadat de incubatie van het antilichaam en de eiwit g magnetische kralen voltooid is, verwijder de ChIP-dilutiebuffer en suspendeer de kralen opnieuw in 240 microliter verse buffer.

Plaats vervolgens 20 microliter aliquots van de kralen in 12 afzonderlijke buizen, die elk voor een afzonderlijk weefselmonster zullen worden gebruikt. Verdeel het sonicera materiaal gelijkmatig over de eiwit g kralen met specifiek antilichaam en roteren de buizen gedurende een nacht bij vier graden Celsius met behulp van een buisrevolutie. Breng de antilichaam-eiwit-oplossing op de ochtend na omgekeerde cross-linking over naar een 96-wellsplaat en plaats deze op een magnetisch statief.

Laat de kralen minimaal 30 seconden aan hechten, verwijder het supernatant en was de kralen vijf keer met 150 microliter ijskoud RIPA-wasbuffer met behulp van een multikanaalspipet. Beweeg de magneet gedurende 30 seconden per wasbeurt continu en verwijder vervolgens het supernatant.

Na de wasstappen, voeg een elutiebuffer-mastermix toe, die 44 microliter directe elutiebuffer, één microliter Rnase en vijf microliter protenase k per chip bevat en breng het monster in voor omgekeerde cross-linking. Incubeer de monsters gedurende vier uur bij 37 graden Celsius, vier uur bij 50 graden Celsius en acht tot zestien uur bij 65 graden Celsius met behulp van een PCR-thermocyclus. Plaats de monsters op de volgende ochtend terug op de magneet en breng het supernatant over naar een nieuwe 96-wells PCR-plaat die het aminogeprecipiteerde DNA bevat.

Voeg 2,3 x paramagnetische kralen toe aan de oplossing en pipet voorzichtig 25 keer op en neer met behulp van een multikanaalspipet. Incubeer vervolgens gedurende vier minuten bij kamertemperatuur. Plaats de monsters vervolgens terug op de magneet en incubeer gedurende nog eens vier minuten bij kamertemperatuur.

Verwijder na het weggooien van het supernatant 150 microliter 70% ethanol aan de monsters en incubeer gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur zonder de kralen te storen. Na het drogen van de kralen, verwijder de monsters van de magneet en voeg 30 microliter 10 millimolair traceal toe. Meng door 25 keer te pipetten.

Na incubatie van de monsters bij kamertemperatuur, plaats ze terug op de magneet en incubeer gedurende nog eens vier minuten bij kamertemperatuur. Breng 20 microliter van elk monster over naar een nieuwe 96-wellsplaat voor bibliotheekvoorbereiding. Na PCR-amplificatie, verwijder de monsters en breng het totale volume naar 100 microliter met behulp van nucleusvrij water.

Voer dubbelzijdige paramagnetische grootteselectie uit door eerst 55 microliter kralen aan elk monster toe te voegen en 25 keer te mengen met een pipet. Incubeer vervolgens gedurende vier minuten bij kamertemperatuur. Plaats de monsters terug op de magneet en incubeer gedurende nog eens vier minuten bij kamertemperatuur om grote fragmenten op de kralen te verkrijgen die ongeschikt zijn voor sequencing.

Na incubatie, breng het supernatant over naar een nieuwe 96-wells PCR-plaat. Voeg nog eens 25 microliter paramagnetische kralen toe en meng door 25 keer te pipetten en incubeer gedurende vier minuten bij kamertemperatuur zonder de magneet. Na incubatie bij kamertemperatuur, plaats de monsters terug op de magneet en incubeer gedurende vier minuten bij kamertemperatuur.

Verwijder vervolgens het supernatant. Laat de monsters op de magneet staan en voeg 150 microliter 70% ethanol toe en incubeer gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur zonder de kralen te storen. Verwijder