Name: Een geïntegreerd Platform voor het toewijzen van de genoom-brede van chromatine Staten met behulp van High-throughput ChIP-sequencing in Tumor weefsels (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Leer een geoptimaliseerd high-throughput ChIP-sequencing protocol voor chromatintoestandanalyse in bevroren tumorweefsels en kankercellijnen. Deze methode verbetert de efficiëntie van epigenetisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Marcus Coyle, Curtis Gumbs, SMF kern op MDACC voor sequencing ondersteuning. Het werk in dit artikel beschreven werd gesteund door subsidies van de NIH grant (CA016672) aan SMF Core en NCI awards (1K99CA160578 en R00CA160578) aan K. R.

<ol><li>Rao, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+map+of+the+human+genome+at+kilobase+resolution+reveals+principles+of+chromatin+looping%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping.</a> Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).</li>
<li>Hnisz, D., Day, D. S., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulated+Neighborhoods%3A+Structural+and+Functional+Units+of+Mammalian+Gene+Control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Insulated Neighborhoods: Structural and Functional Units of Mammalian Gene Control.</a> Cell. 167 (5), 1188-1200 (2016).</li>
<li>Dixon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topological+domains+in+mammalian+genomes+identified+by+analysis+of+chromatin+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions.</a> Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).</li>
<li>Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+long-range+interaction+landscape+of+gene+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The long-range interaction landscape of gene promoters.</a> Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SMARCB1-mediated+SWI%2FSNF+complex+function+is+essential+for+enhancer+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">SMARCB1-mediated SWI/SNF complex function is essential for enhancer regulation.</a> Nat Genet. 49 (2), 289-295 (2017).</li>
<li>Hnisz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+proto-oncogenes+by+disruption+of+chromosome+neighborhoods%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods.</a> Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).</li>
<li>Jäger, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capture+Hi-C+identifies+the+chromatin+interactome+of+colorectal+cancer+risk+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Capture Hi-C identifies the chromatin interactome of colorectal cancer risk loci.</a> Nat Commun. 6, 6178(2015).</li>
<li>Krijger, P. H., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+disease-associated+gene+expression+in+the+3D+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (12), 771-782 (2016).</li>
<li>Mansour, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogene+regulation.+An+oncogenic+super-enhancer+formed+through+somatic+mutation+of+a+noncoding+intergenic+element%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Oncogene regulation. An oncogenic super-enhancer formed through somatic mutation of a noncoding intergenic element.</a> Science. 346 (6215), 1373-1377 (2014).</li>
<li>Weischenfeldt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pan-cancer+analysis+of+somatic+copy-number+alterations+implicates+IRS4+and+IGF2+in+enhancer+hijacking%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Pan-cancer analysis of somatic copy-number alterations implicates IRS4 and IGF2 in enhancer hijacking.</a> Nat Genet. 49 (1), 65-74 (2017).</li>
<li>Herz, H. M., Hu, D., Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/molecular-cell/abstract/S1097-2765(14)00205-6">Enhancer malfunction in cancer.</a> Mol Cell. 53 (6), 859-866 (2014).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17320507">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128 (4), 693-705 (2007).</li>
<li>Tan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+67+histone+marks+and+histone+lysine+crotonylation+as+a+new+type+of+histone+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of 67 histone marks and histone lysine crotonylation as a new type of histone modification.</a> Cell. 146 (6), 1016-1028 (2011).</li>
<li>Strahl, B. D., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+language+of+covalent+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The language of covalent histone modifications.</a> Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).</li>
<li>Ernst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+and+analysis+of+chromatin+state+dynamics+in+nine+human+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types.</a> Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).</li>
<li>Consortium, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li>
<li>Rivera, C. M., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(13)01148-3">Mapping human epigenomes.</a> Cell. 155 (1), 39-55 (2013).</li>
<li>Stergachis, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+fate+and+cellular+maturity+encoded+in+human+regulatory+DNA+landscapes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Developmental fate and cellular maturity encoded in human regulatory DNA landscapes.</a> Cell. 154 (4), 888-903 (2013).</li>
<li>Xie, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenomic+analysis+of+multilineage+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Epigenomic analysis of multilineage differentiation of human embryonic stem cells.</a> Cell. 153 (5), 1134-1148 (2013).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+diversity+during+lineage+commitment+of+human+blood+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transcriptional diversity during lineage commitment of human blood progenitors.</a> Science. 345 (6204), 1251033(2014).</li>
<li>Saeed, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+programming+of+monocyte-to-macrophage+differentiation+and+trained+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Epigenetic programming of monocyte-to-macrophage differentiation and trained innate immunity.</a> Science. 345 (6204), 1251086(2014).</li>
<li>Bernstein, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NIH+Roadmap+Epigenomics+Mapping+Consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The NIH Roadmap Epigenomics Mapping Consortium.</a> Nat Biotechnol. 28 (10), 1045-1048 (2010).</li>
<li>Roadmap Epigenomics, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analysis+of+111+reference+human+epigenomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Integrative analysis of 111 reference human epigenomes.</a> Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).</li>
<li>Ernst, J., Kellis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChromHMM%3A+automating+chromatin-state+discovery+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">ChromHMM: automating chromatin-state discovery and characterization.</a> Nat Methods. 9 (3), 215-216 (2012).</li>
<li>Feng, J., Liu, T., Qin, B., Zhang, Y., Liu, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+ChIP-seq+enrichment+using+MACS%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Identifying ChIP-seq enrichment using MACS.</a> Nat Protoc. 7 (9), 1728-1740 (2012).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18798982">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biol. 9 (9), R137(2008).</li>
<li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li>
<li>O'Neill, L. P., VerMilyea, M. D., Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+characterization+of+the+early+embryo+with+a+chromatin+immunoprecipitation+protocol+applicable+to+small+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Epigenetic characterization of the early embryo with a chromatin immunoprecipitation protocol applicable to small cell populations.</a> Nat Genet. 38 (7), 835-841 (2006).</li>
<li>Dahl, J. A., Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Q2ChIP%2C+a+quick+and+quantitative+chromatin+immunoprecipitation+assay%2C+unravels+epigenetic+dynamics+of+developmentally+regulated+genes+in+human+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Q2ChIP, a quick and quantitative chromatin immunoprecipitation assay, unravels epigenetic dynamics of developmentally regulated genes in human carcinoma cells.</a> Stem Cells. 25 (4), 1037-1046 (2007).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allelic+reprogramming+of+the+histone+modification+H3K4me3+in+early+mammalian+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Allelic reprogramming of the histone modification H3K4me3 in early mammalian development.</a> Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).</li>
<li>Dahl, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+histone+H3K4me3+domains+in+mouse+oocytes+modulate+maternal-to-zygotic+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Broad histone H3K4me3 domains in mouse oocytes modulate maternal-to-zygotic transition.</a> Nature. 537 (7621), 548-552 (2016).</li>
<li>Shen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H3K4me3+epigenomic+landscape+derived+from+ChIP-Seq+of+1%2C000+mouse+early+embryonic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">H3K4me3 epigenomic landscape derived from ChIP-Seq of 1,000 mouse early embryonic cells.</a> Cell Res. 25 (1), 143-147 (2015).</li>
<li>Flanagin, S., Nelson, J. D., Castner, D. G., Denisenko, O., Bomsztyk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microplate-based+chromatin+immunoprecipitation+method%2C+Matrix+ChIP%3A+a+platform+to+study+signaling+of+complex+genomic+events%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Microplate-based chromatin immunoprecipitation method, Matrix ChIP: a platform to study signaling of complex genomic events.</a> Nucleic Acids Res. 36 (3), e17(2008).</li>
<li>Nelson, J. D., Denisenko, O., Sova, P., Bomsztyk, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16397291">Fast chromatin immunoprecipitation assay.</a> Nucleic Acids Res. 34 (1), e2(2006).</li>
<li>Lerdrup, M., Johansen, J. V., Agrawal-Singh, S., Hansen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+interactive+environment+for+agile+analysis+and+visualization+of+ChIP-sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An interactive environment for agile analysis and visualization of ChIP-sequencing data.</a> Nat Struct Mol Biol. 23 (4), 349-357 (2016).</li>
<li>Afgan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Galaxy+platform+for+accessible%2C+reproducible+and+collaborative+biomedical+analyses%3A+2016+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update.</a> Nucleic Acids Res. 44 (W1), W3-W10 (2016).</li>
<li>Blecher-Gonen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+chromatin+immunoprecipitation+for+genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions+and+epigenomic+states%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-throughput chromatin immunoprecipitation for genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions and epigenomic states.</a> Nat Protoc. 8 (3), 539-554 (2013).</li>
<li>Tang, M. <a target="_blank" href="https://zenodo.org/record/819971#.WilfHUtrxZ0">pyflow-ChIPseq: a snakemake based ChIP-seq pipeline.</a> Zenodo. , (2017).</li>
<li>Koster, J., Rahmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snakemake--a+scalable+bioinformatics+workflow+engine%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Snakemake--a scalable bioinformatics workflow engine.</a> Bioinformatics. 28 (19), 2520-2522 (2012).</li>
<li>Ramirez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((deepTools2%3A+a+next+generation+web+server+for+deep-sequencing+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis.</a> Nucleic Acids Res. 44 (W1), W160-W165 (2016).</li>
<li>Bailey, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+guidelines+for+the+comprehensive+analysis+of+ChIP-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Practical guidelines for the comprehensive analysis of ChIP-seq data.</a> PLoS Comput Biol. 9 (11), e1003326(2013).</li>
<li>Fiziev, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+Epigenomic+Analysis+Reveals+Chromatin+States+Associated+with+Melanoma+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Systematic Epigenomic Analysis Reveals Chromatin States Associated with Melanoma Progression.</a> Cell Rep. 19 (4), 875-889 (2017).</li>
<li>Liu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+chromosomal+domains+of+histone+modification+patterns+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Broad chromosomal domains of histone modification patterns in C. elegans.</a> Genome Res. 21 (2), 227-236 (2011).</li>
<li>Egelhofer, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assessment+of+histone-modification+antibody+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An assessment of histone-modification antibody quality.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).</li>
<li>Rai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+Roles+of+RNF2+in+Melanoma+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Dual Roles of RNF2 in Melanoma Progression.</a> Cancer Discov. , (2015).</li>
<li>Cotney, J. L., Noonan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+with+fixed+animal+tissues+and+preparation+for+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation with fixed animal tissues and preparation for high-throughput sequencing.</a> Cold Spring Harb Protoc. (2), 191-199 (2015).</li>
<li>Cejas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+from+fixed+clinical+tissues+reveals+tumor-specific+enhancer+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation from fixed clinical tissues reveals tumor-specific enhancer profiles.</a> Nat Med. 22 (6), 685-691 (2016).</li>
</ol>

Auteurs verklaren geen conflicten.

Dit protocol beschrijft een complete en uitgebreide high-throughput ChIP-seq module voor genoom-brede toewijzing van chromatine Staten in menselijke tumor weefsels en cellijnen. In een ChIP-seq-protocol is een van de belangrijkste stappen antilichamenspecificiteit. Hier, illustreert deze methode immunoprecipitation voorwaarden voor de beschreven zes histone modificaties, die allemaal zijn ChIP-rang en eerder zijn gevalideerd in onze en andere laboratoria42,44<sup...

Het merendeel van de zoogdieren genoom (98-99%) bestaan uit noncoding opeenvolging, en deze nocoding gebieden bevatten regelgevende elementen bekend om deel te nemen bij het beheersen van genexpressie en1,2van de organisatie van de chromatine. In een normale cel is de specifieke vergadering van genomic DNA in gecomprimeerde chromatine structuur essentieel voor de ruimtelijke organisatie, de regelgeving en de precieze timing van de verschillende DNA-geassocieerde processen3,-4,5. In een kankercel maar kunnen chromatine wijzigingen door aberrant Epigenetische mechanismen leiden tot onjuiste organisatie van de structuur van de chromatine, met inbegrip van toegang tot de regelgevende elementen, chromosomale looping systemen en gen expressie patronen6, 7,8,9,10.
Ondanks de recente vooruitgang, hebben we beperkte begrip van epigenetische veranderingen die gekoppeld aan de progressie van de tumor of therapeutische respons zijn. De epigenome bestaat uit een matrix van wijzigingen, met inbegrip van Histon merken en methylation van DNA, die gezamenlijk een dynamische staat vormen (hierna: chromatine staat) die inbreuk op gen expressie netwerken en andere processen essentieel voor het behoud van maakt cellulaire identiteit. Onlangs, wijzigingen in de versterkers is aangetoond in meerdere maligniteiten door het bestuderen van H3K27Ac profielen11. Hoewel dergelijke studies inzicht geven in de correlatie van geïsoleerde epigenetische merken, meer dan 100 epigenetische aanpassingen geweest geïdentificeerde12,,13 zonder duidelijk begrip van hun biologische rol en onderlinge afhankelijkheid. Bovendien, er is een nog groter aantal mogelijke combinatorische patronen van deze histone en DNA wijzigingen, en het is deze combinatorische patronen - niet afzonderlijke wijzigingen - die epigenetische Staten14 dicteren. Vandaar, is er grote behoefte vast te stellen van wijzigingen in deze Staten chromatine tijdens de progressie van kanker of reacties op therapie. Grondige kennis van epigenome veranderingen in kanker heeft gedeeltelijk is achtergebleven als gevolg van technische (bv . generatie van grootschalige gegevens uit kleine hoeveelheid klinisch materiaal/enkele cellen) en analytische (bijvoorbeeld algoritmen te definiëren Combinatorische Staten) uitdagingen. Daarom is er dringend behoefte voor robuuste hoge gegevensdoorvoer methoden voor profilering groot aantal Histon wijziging merken uit klinisch materiaal en gemakkelijk te implementeren computationele benaderingen te voorspellen combinatorische patronen die zal vergemakkelijken bepaling van de epigenetische staten verschillende stadia van tumorvorming en therapeutische weerstand is gekoppeld. Verder gegevens beschikbaar van recente epigenome profiling studies15,16,17,18,19,20,21, 22,23 in normale weefsels en cellijnen kan worden geïntegreerd met de chromatine profielen van tumoren voor verdere inzichten in epigenome bijdrage aan tumor biologie.
Chromatine profilering is een krachtig hulpmiddel voor de identificatie van de globale bindende patronen van verschillende chromatine wijzigingen15,24geworden. In de afgelopen jaren is de ChIP-seq uitgegroeid tot de "gouden standaard" voor de studie van DNA-eiwit interactie op een wereldwijde schaal25,26,27. Voor elke ChIP-seq-experiment zijn er kritische stappen nodig zijn voor het succes, met inbegrip van de verwerking van het weefsel en scheiding, determing optimale ultrasoonapparaat voorwaarden, determing optimale antilichaam concentratie voor neerslag, bibliotheek voorbereiding, verwerking van de gegevens van de post sequencing en downstream-analyse. Elk van deze stappen bevatten belangrijke kwaliteitscontrole controleposten en wanneer samen genomen, zijn van cruciaal belang voor het correct identificeren van potentiële doelen voor functionele validering. Door middel van innovatie in deze stappen, hebben verschillende voorafgaande studies ontwikkeld methodologieën voor het uitvoeren van ChIP of ChIP-Seq van kleine hoeveelheid weefsels28,29,30,31,32 . Verder, hebben sommige studies voorgesteld protocollen voor high-throughput ChIP experimenten gevolgd door PCR gebaseerd kwantificatie33,34. Tot slot, sommige platformen publiekelijk beschikbaar analyse voor ChIP-Seq gegevens zijn nu beschikbaar, zoals Easeq,35 en36van de Galaxy. Echter, een geïntegreerd platform voor het uitvoeren van ChIP-Seq in een high-throughput mode in combinatie met een computationele pijpleiding voor het uitvoeren van interne mark evenals chromatin staat analyses heeft ontbroken.
Dit protocol beschrijft een complete en uitgebreide ChIP-seq workflow voor genoom-brede toewijzing van chromatine Staten in de weefsels van de tumor en cellijnen, met gemakkelijk te volgen richtsnoeren omvat alle van de stappen die nodig zijn voor een succesvolle experiment. Door het aannemen van een high-throughput methode beschreven door Blecher-Gonen et al. 37, dit protocol op tientallen monsters parallel kan worden uitgevoerd en is met succes toegepast op kanker cellijnen en menselijke tumoren zoals melanoom, dikke darm, prostaat en glioblastoma multiforme. We tonen de methodologie voor zes kern histone modificaties die belangrijke onderdelen van de epigenetische regelgevende landschap in menselijke melanoom cellijnen en tumor monsters vertegenwoordigen. Deze wijzigingen omvatten H3K27ac (enhancers), H3K4me1 (actief en klaar enhancers), H3K4me3 (initiatiefnemers), H3K79me2 (getranscribeerd regio's), H3K27me3 (polycomb onderdrukking), en H3K9me3 (hétérochromatique onderdrukking). Deze merken kunnen alleen of in combinatie worden gebruikt voor identificatie van functioneel verschillende chromatine staten vertegenwoordigt zowel de actieve als de repressieve domeinen.

<table><tbody><tr><td>ChIP-grade H3K4me1 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab8895</td><td></td></tr><tr><td>ChIP-grade H3K27ac antibody</td><td>Abcam</td><td>ab4729</td><td></td></tr><tr><td>ChIP-grade H3K4me3 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab8580</td><td></td></tr><tr><td>ChIP-grade H3K79me2 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab3594</td><td></td></tr><tr><td>ChIP-grade H3K27me3 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab6002</td><td></td></tr><tr><td>ChIP-grade H3K9me3 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab8898</td><td></td></tr><tr><td>1M Tris HCl, pH 8.0</td><td>Teknova</td><td>T1080</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma - Life Sciences</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74255</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746460</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Calbiochem</td><td>492016-100ML</td><td></td></tr><tr><td>1% TWEEN-20</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>BSA - IgG-free</td><td>Sigma - Life Sciences</td><td>A2058-5G</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibo</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS C tube</td><td>GentleMACS</td><td>120-008-466</td><td>disassociation tube</td></tr><tr><td>16% Formaldehyde</td><td>Peierce</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>miniProtease inhibitor&nbsp;</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11836153001</td><td>protease inhibitor tablets</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>10009D</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor NGS tubes 0.65 mL</td><td>Diagenode</td><td>C30010011</td><td>sonication tubes</td></tr><tr><td>DynaMag - 96 Side Skirted</td><td>Invitrogen</td><td>120.27</td><td>96-well magnetic stand</td></tr><tr><td>TE buffer</td><td>Promega</td><td>V6231</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Invitrogen</td><td>12091021</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Invitrogen</td><td>100005393</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63882</td><td>paramagnetic beads</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Qubit ds DNA High Sensitivity Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td>high sensitivity DNA reagents</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit</td><td>New England BioLabs</td><td>E7645L</td><td>DNA Library Prep Kit</td></tr><tr><td>Nuclease-free water</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>High sensitivity D1000 ScreenTape</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5584</td><td>high sensitivity DNA reagents</td></tr><tr><td>High sensitivity D1000 reagents</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5585</td><td>high sensitivity DNA reagents</td></tr><tr><td>Multiplex Oligos (Index primers- Set 1)</td><td>New England BioLabs</td><td>E7335L</td><td>Multiplex Oligos&nbsp;</td></tr><tr><td>Multiplex Oligos (Index primers- Set 2)</td><td>New England BioLabs</td><td>E7500L</td><td>Multiplex Oligos&nbsp;</td></tr><tr><td>TapeStation 4200</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2991AA</td><td>high sensitivity DNA electropherogram instrument</td></tr><tr><td>Bioruptor Pico sonication device&nbsp;</td><td>Diagenode</td><td>B01060001</td><td>water bath disruputor</td></tr><tr><td>Mixer</td><td>Nutator</td><td>421105</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1851196</td><td>PCR Thermal cycler</td></tr><tr><td>Water Bath</td><td>Fisher Scientific</td><td>2322</td><td></td></tr><tr><td>Multichannel Pipet</td><td>Denville</td><td>1003123</td><td></td></tr><tr><td>Tube Revolver</td><td>Thermo-Scientific</td><td>88881001</td><td></td></tr><tr><td>96-Well Skirted Plate</td><td>Eppendorf</td><td>47744-110</td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-12R Centrifuge&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>A99464</td><td>benchtop centrifuge</td></tr><tr><td>Centrifuge 5424</td><td>Eppendorf</td><td>22620461</td><td>tabletop centrifuge</td></tr><tr><td>Optical tube strips (8x Strip)</td><td>Agilent Technologies</td><td>401428</td><td></td></tr><tr><td>Optical tube strip caps (8x strip)</td><td>Agilent Technologies</td><td>401425</td><td></td></tr><tr><td>Loading Tips, 10 Pk</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5599</td><td></td></tr><tr><td>IKA MS3 vortex</td><td>IKA</td><td>3617000</td><td>vortex</td></tr></tbody></table>

een geïntegreerd platform voor het toewijzen van de genoom-brede van chromatine staten met behulp van high-throughput chip-sequencing in tumor weefsels

An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues

Histon modificaties vormen een belangrijk onderdeel van de epigenome en spelen een belangrijke regelgevende rol bij het bepalen van de transcriptionele status van geassocieerde loci. Daarnaast is de aanwezigheid van specifieke wijzigingen gebruikt om te bepalen van de positie en de identiteit niet-coderende functionele elementen zoals versterkers. In de afgelopen jaren, chromatine immunoprecipitation, gevolgd door sequentiebepaling van volgende generatie (ChIP-seq) uitgegroeid tot een krachtig hulpmiddel bij het bepalen van de genoom-brede profielen van individuele histone modificaties. Echter is het steeds duidelijker dat de combinatorische patronen van chromatine wijzigingen, hierna aangeduid als de chromatine-Staten, de identiteit en aard van de bijbehorende genomic locus bepalen geworden. Daarom, werkstromen bestaande uit robuuste high-throughput methodologieën voor profilering van een aantal Histon wijziging merken, evenals de computationele analyses pijpleidingen staat (HT) behandeling van myriaden ChIP-Seq profiling datasets, nodig zijn voor alomvattende bepaling van epigenomic Staten in groot aantal monsters. De HT-ChIP-Seq werkstroom gepresenteerde bestaat uit twee modules: 1) een experimenteel protocol voor profilering van de verschillende histone modificaties van kleine hoeveelheden tumor monsters en cellijnen in een 96-Wells-formaat; en 2) een computationele data analyse pijpleiding die combineert bestaande instrumenten om te berekenen zowel individueel merk bezetting en combinatorische chromatine staat patronen. Beide modules vergemakkelijken samen gemakkelijk verwerken van honderden ChIP-Seq monsters in een snelle en efficiënte manier. De werkstroom hier gepresenteerd wordt gebruikt voor het afleiden van chromatine staat patronen uit 6 Histon mark profielen in melanoom tumoren en cellijnen. Globaal, presenteren we een uitgebreide ChIP-seq workflow die kan worden toegepast op tientallen menselijke tumor monsters en cellijnen van de kanker te bepalen epigenomic afwijkingen in verschillende maligniteiten.

Dit protocol staat de immunoprecipitation van bevroren tumor weefsels en cellijnen die op tientallen monsters in parallel met een hoge gegevensdoorvoer methode (figuur 1A)kunnen worden uitgevoerd. Chromatine fragmenten moeten variëren tussen ~ 200-1000 bps voor optimale immunoprecipitation. We hebben gemerkt dat de tijd die nodig is om dezelfde schuintrekken lengte verschilt voor verschillende weefsel en celtypes. Het succes van ChIP van klei...

Hier beschrijven we een geoptimaliseerde high-throughput ChIP-sequencing protocol en computationele analyses pijpleiding voor de bepaling van genoom-brede chromatine staat patronen uit bevroren tumor weefsels en cellijnen.

Een geïntegreerd Platform voor het toewijzen van de genoom-brede van chromatine Staten met behulp van High-throughput ChIP-sequencing in Tumor weefsels

Histone modifications constitute a major component of the epigenome and play important regulatory roles in determining the transcriptional status of ...

Het algemene doel van dit protocol is om op een onbevooroordeelde manier combinatorische chromatine-toestandspatronen in tumorweefsels en kankercellijnen te identificeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het veld van kanker-epigenetica, zoals hoe een dor histone-modificatietoestand kan bijdragen aan tumorontstaan. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat meerdere histone-modificaties, evenals meerdere monsters, zowel tegelijkertijd als efficiënt kunnen worden verwerkt.Los eerst handmatig 50 milligram melanoomweefsel en twee milliliter Hank's Balanced Salt Solution of HBSS op met behulp van een steriele scheermesjes. Snijd het weefsel gedurende ongeveer vijf minuten in een steriele weefselkweekschaal in stukken van drie of vier millimeter. Breng de weefseloplossing over in een dissociatorbuis en voeg nog eens acht milliliter HBSS toe.Dissocieer het weefsel verder, met behulp van een dissociator, totdat het gehomogeniseerd is. Kruis vervolgens het weefsel door 200 microliter 16% formaldehyde per drie milliliter HBSS toe te voegen. Schud het mengsel met een mixer gedurende exact 10 minuten op 37 graden Celsius bij 10 omwentelingen per

an-integrated-platform-for-genome-wide-mapping-chromatin-states-using

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

De Hi-C methode maakt het mogelijk onpartijdige, genoom-brede identificatie van chromatine interacties (1). Hi-C paren nabijheid ligatie en massaal parallelle sequencing. De resulterende gegevens kunnen worden gebruikt om de genomische architectuur studeren op meerdere schalen: eerste resultaten geïdentificeerd functies zoals chromosoom gebieden, scheiding van open en gesloten chromatine, en chromatine structuur op de megabase schaal.

Hi-C: een methode om de driedimensionale architectuur van genoom-onderzoek.

Chromatine Interactie Analyse door Gekoppeld-End Tag Sequencing (Chia-PET) is een methode...

Chromatine Interactie Analyse met gepaarde-End Tag Sequencing (Chia-PET) voor het in kaart brengen van chromatine Interacties en begrijpen Transcriptie Verordening

De combinatie van chromatine immunoprecipitatie en ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) kan identificeren en in kaart eiwit-DNA-interacties in een bepaald weefsel of cellijn. Geschetst is hoe je een hoge kwaliteit ChIP sjabloon voor de daaropvolgende sequencing, met ervaring met de transcriptiefactor TCF7L2 als een voorbeeld te genereren.

Generatie van hoge kwaliteit Chromatine immunoprecipitatie DNA Template voor High-throughput sequencing (ChIP-seq)

We beschrijven hier een platform dat comet assay detectie van DNA-schade met ongekende doorvoer toestaat. De inrichting patronen zoogdiercellen in een microarray en maakt parallelle verwerking van 96 monsters. De benadering maakt analyse van basisniveau DNA schade, blootstelling DNA schade en DNA herstel kinetiek.

CometChip: Een High-throughput 96-Well Platform voor het meten van DNA-schade in Microarrayed menselijke cellen

Er wordt een geïntegreerd systeem beschreven voor gerichte next-generation sequencing van oncologische monsters. Dit cross-platform systeem is geoptimaliseerd voor tumorbiopsies van lage kwaliteit en lage hoeveelheid, past zich aan lage DNA-inputs aan, omvat goed gekarakteriseerde multi-variant controles en beschikt over een nieuwe variant caller die wordt geïnformeerd door kwantitatieve pre-analytische kwaliteitscontrolemaatregelen.

Integratie van Nat en droog Bench Processen Optimaliseert Gerichte next-generation sequencing van lage kwaliteit en lage hoeveelheid tumorbiopten

Nauwkeurige bepaling van eiwitbindende locaties in het genoom is belangrijk voor het begrijpen van genregulatie. Hier beschrijven we een genomische mapping methode die chromatine-immunogeprecipiteerd DNA behandelt met exonucleasevertering (ChIP-exo) gevolgd door sequencing met hoge doorvoer. Deze methode detecteert eiwit-DNA interacties met near base-pair mapping resolutie en hoge signaal-ruisverhouding bij zoogdierneuronen.

Hoge resolutie mapping van eiwit-DNA interacties in muis stamcel-afgeleide neuronen met behulp van chromatine immunoprecipitation-exonuclease (ChIP-Exo)

Dit artikel beschrijft een semiautomatiseerd, microschaal ChIP-Seq-protocol van DNA-regio's geassocieerd met een specifieke histonmodificatie (H3K27ac) met behulp van een ChIP-vloeistofhandlerplatform, gevolgd door bibliotheekvoorbereiding met behulp van tagmentatie. De procedure omvat controlebeoordeling voor kwaliteits- en kwantiteitsdoeleinden en kan worden toegepast op andere histonmodificaties of transcriptiefactoren.

Een semiautomatiseerde ChIP-Seq-procedure voor grootschalige epigenetische studies

ATAC-seq is een DNA-sequencingmethode die de hyperactieve mutant transposase, Tn5, gebruikt om veranderingen in chromatinetoegankelijkheid in kaart te brengen, gemedieerd door transcriptiefactoren. ATAC-seq maakt de ontdekking mogelijk van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan fenotypische veranderingen in kankercellen. Dit protocol schetst optimalisatieprocedures voor ATAC-seq in epitheelceltypen, waaronder kankercellen.

ATAC-Seq Optimalisatie voor Kanker Epigenetica Onderzoek

Genexpressie wordt gereguleerd door interacties van genpromotors met distale regulerende elementen. Hier beschrijven we hoe low input Capture Hi-C (liCHi-C) de identificatie van deze interacties in zeldzame celtypen mogelijk maakt, die voorheen niet meetbaar waren.

Een geïntegreerde workflow om de promotor-centrische spatio-temporele genoomarchitectuur in schaarse celpopulaties te bestuderen

Een geoptimaliseerd Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease gevolgd door next generation sequencing (CUT&amp;RUN-seq) protocol wordt beschreven voor neuro-endocriene kleincellige longkankercellijnen. Het maakt genoombrede mapping mogelijk van diverse histonmodificaties en transcriptiefactoren (bijv. E2F7) bindingsplaatsen om epigenetische en transcriptionele deregulatie in de SCLC-pathobiologie te onderzoeken.

Genoom-brede mapping van histonmodificaties en bindingsplaatsen voor transcriptiefactoren in neuro-endocriene kleincellige longkankercellijnen met behulp van CUT&amp;RUN

Leer een geoptimaliseerd high-throughput ChIP-sequencing protocol voor chromatintoestandanalyse in bevroren tumorweefsels en kankercellijnen. Deze methode verbetert de efficiëntie van epigenetisch onderzoek.

Een geïntegreerd Platform voor het toewijzen van de genoom-brede van chromatine Staten met behulp van High-throughput ChIP-sequencing in Tumor weefsels (Video) | JoVE Journal

Een geïntegreerd Platform voor het toewijzen van de genoom-brede van chromatine Staten met behulp van High-throughput ChIP-sequencing in Tumor weefsels

Meer video's verkennen