Zuivering van hepatocyten en sinusvormige endotheliale cellen van lever muis perfusie
12 februari 2018
Het doel van dit protocol is te verkrijgen van hoge levensvatbaarheid en hoog rendement van hepatocyten en sinusoïdale endotheliale cellen van lever. Dit wordt bereikt door zoogdierlevercellen de lever met een type IV collagenase oplossing via de portal ader, gevolgd door differentiële centrifugeren hepatocyten en sinusoïdale endotheliale cellen te verkrijgen.
Het algemene doel van deze procedure is om een succesvolle muisleverperfusie uit te voeren om de zuivering van specifieke levercelpopulaties van belang te faciliteren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het gebied van hepatologie over hoe de functies van specifieke levercelpopulaties binnen in vitro of in vivo assays kunnen worden ondersteund. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de grote hoeveelheid hepatocyten in sinusoidale endotheelcellen die uit elke lever kunnen worden verkregen.
Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat het essentieel is om de kleur en vorm van een optimaal verteerde lever te zien om de celviabiliteit te behouden. Om de portale aderkatheter te plaatsen, gebruikt u eerst de achterkant van een pincet om de darmen naar de rechterkant van de muisbuikholte te verplaatsen, waardoor de portale ader wordt blootgelegd, en gebruikt u gebogen pincet om een 20 centimeter stuk polyesternaaigaren onder de portale ader tussen de lever en de superieure pancreato-duodenale ader te schuiven. Gebruik de pincet om het garen voorzichtig naar de andere kant van het dier te trekken, zodat het onder de portale ader is gecentreerd.
En knoop een losse overheadknoop rond de portale ader. Plaats het gebogen pincet onder de ader en trek voorzichtig al het weefselmateriaal naar de staart om de ader recht te trekken. Plaats vervolgens de afschuining van een katheternaald omhoog en evenwijdig aan het onderste deel van de portale ader nabij het pincet, en prik voorzichtig de ader met de naald.
Wanneer de afschuining in het lumen van de ader is, trekt u de veerbelaste naald terug en blijft u de palmer-katheter door de ader duwen totdat de afschuining zich dicht bij het veneuze vertakte gebied bevindt. Nadat u de knoop om de katheter hebt vastgezet, stelt u onmiddellijk de peristaltiekpomp in op vier millimeter per minuut en verbindt u het mannelijke uiteinde van de slang met het vrouwelijke uiteinde van de katheter, op welk punt u de levertak zou moeten gaan zien. Snijd de aorta abdominalis voor drainage.
Gebruik afdektape om de slang op de onderlaag te immobiliseren. Gebruik de schaar om de buikhuid verticaal te snijden om afvoer van bloed en perfusievloeistof mogelijk te maken. Knijp vervolgens een paar keer in het afvoerbloedvat met de rechte pincet om de lever op te blazen, om ervoor te zorgen dat al het bloed is uitgedreven, en perfuseer de lever met PBS totdat het leverweefsel verkleurt.
Om de hepatocyten te oogsten, verandert u eerst de uitlaatslang van de literfles met PBS naar een 125 milliliter fles, die buffer twee bevat, aangevuld met collagenase-4. Wanneer de collagenase de lever bereikt, knijpt u kort maar stevig in het afvoerbloedvat om druk op te bouwen en laat u de verteringsbuffer alle lobben van de lever vullen. Laat het vat los voordat de buffer door het bindweefsel rond de lever barst.
En laat de buffer door de lever perfunderen totdat het hele volume door het weefsel is gestroomd. Plaats vervolgens een kristalliserende schaal met 10 milliliter buffer een naast de muis en gebruik rechte pincet en schaar om de lever naar de schaal over te brengen. Breng de schaal over naar een steriele weefselkweekkap en gebruik, met behulp van steriele techniek, de lever om de capsule af te pellen.
Schud voorzichtig de cellen van het leverweefsel en giet de resulterende celoplossing door een 100-micronfilter in een 50 milliliter conische buis. Spoel vervolgens de leverresten van het filter met meer buffer een. Wanneer de lever eruit ziet alsof er geen cellen meer in zitten, zeef de getrokken filtraat door een 40-micronfilter in een tweede 50-milliliterbuis en verzamel de cellen door centrifugatie.
Giet het non-parenchymale cel- en dode hepatocytenbevattende supernatant in één beweging in een nieuwe 50-milliliterbuis op ijs, om het pellet te behouden en het pellet op te schorten in 40 milliliter verse buffer een voor de volgende centrifugatie. Om de sinusoidale endotheelcellen te isoleren, centrifugeert u de supernatanten die non-parenchymale cellen bevatten. Trek de celsuspensies in een enkele nieuwe 50-milliliter conische buis en breng het totaalvolume op tot 35 milliliter.
Verzamel de getrokken cellen door centrifugatie en gebruik een 25 milliliter pipette om voorzichtig de bovenste 25 milliliter van de non-parenchymale celbevattende supernatant in een nieuwe 50-milliliter conische buis op ijs over te brengen. Voeg 25 milliliter vers medium toe aan de buis en schud het pellet opnieuw op voor een tweede centrifugatie en supernatantverwijdering. Centrifugeer vervolgens het supernatant en voeg 15 milliliter van een 50% Percoll-oplossing toe aan een nieuwe 50-milliliterbuis.
Gebruik een pipetter ingesteld op de laagste uitblaassnelheid om 20 milliliter 25% Percoll bovenop de 50% Percoll-oplossing te leggen en suspendeer de non-parenchymale cellen in 10 milliliter vier graden Celsius medium. Leg de cellen voorzichtig op de Percoll-oplossing. En scheid de cellen door dichtheidsgradiëntcentrifugatie.
Aspireer vervolgens de eerste 30 milliliter oplossing en gebruik een plastic vijf-milliliter transferpipet om de sinusoidale endotheel- en Kupffer-cellen die zich op de interfase van de 25 tot 50% dichtheidsgradiëntoplossing bevinden, in een nieuwe 50-milliliter conische buis te verzamelen. Was de cellen met 50 milliliter medium en schud het pellet opnieuw op terwijl u de zijkanten van de buisbodem spoelt in 12 milliliter warm medium. Om de sinusoidale endotheelcellen van de Kupffer-cellen te scheiden, brengt u de celsuspensie over in een polystyreen petrischaal in een bevochtigde weefselkweekincubator gedurende acht minuten.
Aan het einde van de incubatie, gebruikt u een 25-milliliter pipette om het supernatant te aspireren en gebruikt u het supernatant om de schaal te spoelen met de pipetter ingesteld op de laagste snelheid om de resterende sinusoidale endotheelcellen te verzamelen. Breng vervolgens de sinusoidale endotheelcellen over in een nieuwe 50-milliliterbuis. Verzamel vervolgens de cellen door centrifugatie voor hun heropschort en platering in collageen gecoate celkweekschalen.
Scannende elektronenmicrosco
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor het uitvoeren van leverperfusie bij muizen om hoge opbrengsten van hepatocyten en sinusoidale endotheelcellen te isoleren. De techniek omvat het perfunderen van de lever met een collagenase-oplossing en het gebruik van differentiële centrifugatie om specifieke levercelpopulaties te zuiveren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Hepatologie
- Celbiologie
- In vitro-assays
Achtergrond
- Het begrijpen van levercelfuncties is cruciaal voor hepatologisch onderzoek.
- De isolatie van specifieke levercellen helpt bij het bestuderen van hun rollen in diverse assays.
- Een hoge viabiliteit en opbrengst van cellen zijn essentieel voor het succes van het experiment.
- Visuele beoordeling van de leverdigestie is belangrijk voor het behoud van de celintegriteit.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor het isoleren van hepatocyten en sinusoidale endotheelcellen.
- Om het begrip van levercelfuncties in onderzoek te verbeteren.
- Om een gedetailleerd protocol te bieden voor onderzoekers in dit vakgebied.
Gebruikte methoden
- Perfusie van de lever met een collagenase-oplossing via de vena portae.
- Differentiële centrifugatie om celpopulaties te scheiden.
- Dichtheidsgradiëntcentrifugatie voor verdere zuivering van sinusoidale endotheelcellen.
- Visuele inspectie en zorgvuldige behandeling om de levensvatbaarheid van de cellen te waarborgen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van hepatocyten en sinusoidale endotheelcellen.
- Hoge celviabiliteit en opbrengst bereikt via de beschreven methode.
- Duidelijke visualisatie van de micro-anatomie van de lever via scanning elektronenmicroscopie.
- Het protocol biedt een kader voor toekomstige hepatologiestudies.
Conclusies
- Het protocol is effectief voor het isoleren van levercelpopulaties.
- Een hoge opbrengst en levensvatbaarheid van de cellen ondersteunen hun gebruik in onderzoek.
- De methode kan bijdragen aan vooruitgang in het begrip van de leverbiologie.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Dit protocol maakt een betrouwbare isolatie van primaire hepatocyten en sinusoidale endotheelcellen uit muizenlever mogelijk, wat een fysiologisch relevant systeem biedt voor het bestuderen van leverspecifieke drugmetabolisme en toxiciteit. De methode ondersteunt vroege discovery door hoogrendement, levensvatbare cellen te leveren voor in vitro assays die bijdragen aan targetvalidatie en lead-optimalisatie. Door ischemie-reperfusieschade te minimaliseren via catheterisatie van de vena portae, wordt de reproduceerbaarheid van gegevens in discovery- en preklinische workflows verbeterd.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Biedt een ziekterelevant systeem voor het onderzoeken van hepatische target-interactie en padmodulatie in vitro.
- Operationele waarde: Levert consistente hepatocytenopbrengsten voor functionele assays waarmee mechanistische hypothesen worden gede-riskt.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Maakt de preparatie van gezuiverde sinusoidale endotheelcellen mogelijk voor co-cultuurmodellen die de voorspelbaarheid van assays verbeteren.
- Operationele waarde: Ondersteunt gestandaardiseerde celisolatie voor schaalbare screeningsplatforms die de effecten van verbindingen op sinusoidale signalering in de lever beoordelen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Biedt een translationeel, op biomarkers afgestemd systeem voor het bestuderen van leverspecifieke medicijnreacties voorafgaand aan in vivo testen.
- Operationele waarde: Faciliteert continuïteit van ontdekking naar preklinische evaluatie door het leveren van goed gekarakteriseerde primaire levercellen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm en ondersteunt de vroege biologie tijdens de lead-identificatie door gevalideerde primaire hepatocyten te leveren voor ADME/Tox-screening en mechanistische studies.
- Discovery Biology: Maakt hypothesetoetsing van levertargets mogelijk met behulp van primaire cellen die in vivo-achtige functionaliteit behouden.
- Screening: Levert reproduceerbare hepatocyt- en SEC-preparaten voor kwantitatieve screening van verbindingen in metabole en inflammatoire pathways.
- Analytics: Genereert levensvatbare cellysaten en gekweekte cellen voor biochemische readouts zoals enzymactiviteit, cytokinerelase en barrière-integriteit.
- Translationeel Onderzoek: Ondersteunt preklinische continuïteit door cellen te leveren die de murine leverbiologie weerspiegelen voor targetvalidatiestudies.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbare isolatieworkflow voor het genereren van consistente levercelpreparaten over meerdere projecten heen.
Operationele & Bedrijfsmatige Impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij de validatie van levergerelateerde targets door het gebruik van primaire, fysiologisch relevante cellen.
- Operationele waarde: Waarborgt standaardisatie en reproduceerbaarheid via een goed gedefinieerd perfusie- en centrifugatieprotocol.
- Strategische waarde: Vermindert uitval in een laat stadium door het verbeteren van de vroege detectie van lever-gemedieerde risico's.
- Impact op portfolio: Maakt risico-geïnformeerde prioritering van verbindingen mogelijk op basis van de resultaten van assays met hepatische cellen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in muischirurgie en vasculaire catheterisatie voor een succesvolle toegang tot de poortader.
- Is afhankelijk van perfusiepompen, centrifuges en steriele weefselkweekfaciliteiten voor de celverwerking.
- Maakt standaardisatie van collagenase-digestietijden en buffercondities tussen verschillende operators noodzakelijk.
- Omvat overwegingen voor aanpassing bij het toepassen van het protocol op verschillende muizenstammen of leeftijden.
- Wordt beperkt door de technische uitdaging van poortadercatheterisatie bij kleinere muizen (18–25 g), wat de doorvoer kan beïnvloeden.
