Therapie testen in een sferoïde gebaseerde 3D cel cultuur Model voor hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom

Het algemene doel van deze in vitro-methode is om de driedimensionale celcultuur-sferoïden te genereren die het testen van huidige standaard of experimentele therapieregimes voor plaveiselcelcarcinoom van het hoofd en de hals mogelijk maken. Deze methode helpt ons om de driedimensionale tumorgroei van kankercellen in de hals en nek te begrijpen wanneer ze worden blootgesteld aan bestraling of chemo-bestraling. Er dient te worden opgemerkt dat het hanteren van primaire tumorcellen moeilijk is en niet altijd leidt tot betrouwbare driedimensionale sferoïdvorming.

Sabina Schwenk-Zieger, een technicus uit ons laboratorium, zal de procedure demonstreren. Terwijl u primaire cellen uit een tumorspecimen gebruikt, plaatst u het specimen op een geschikt en sterieel oppervlak en snijdt u het grondig met een steriele, eenmalige scalpel in zeer kleine stukjes. Na voldoende mechanische scheiding van het primaire weefsel, brengt u het over in een flesje met collageenase 1 en 2 en incubeert u het gedurende één uur op 37 graden Celsius.

Zeef vervolgens het mengsel door een 70 micrometer Falcon celstrainer en was de suspensie met HBSS. Na succesvolle scheiding en daaropvolgende wassing, brengt u de suspensie die één tot twee miljoen cellen bevat over in een T75 celcultuurflacon om tot subconfluency te groeien bij 37 graden Celsius gedurende maximaal tien dagen. Bevestig onder een microscoop de groei van tumorcellen.

Tel de cellen in cultuur. Gebruik een 96-wellplaat met ultra-lage aanhechting met holle ronde bodems, zaai 5.000 primaire tumorcellen, of 1.000 tot 2.000 cellen van een intermediaire cellijn, in 200 tot 300 microliters medium in de putjes. Vervolgens kweekt u de cellen bij 37 graden Celsius.

Voer elke dag een mediumverversing uit. Let erop dat u de sferoïd niet met de pipette aspireert tijdens het verversen van het medium. Kweek de sferoïds totdat de driedimensionale sferoïdvormige celconglomeraten worden waargenomen.

Houd er rekening mee dat u de putjes met onregelmatige of meerdere sferoïdvorming uitsluit van verder onderzoek. Vervolgens verandert u het medium in medium met chemotherapeutische middelen en/of monoklonale antilichamen in de gewenste concentraties. Voeg Cisplatin toe in de concentraties van 2,5, vijf of 10 micromolair of 5-Fluorouracil op 30 micromolair.

Bij deze procedure meet u de sferoïdgrootte na digitale fotodocumentatie op dag zes, dag 10 en dag 16 met een grafische software. Na centrifugatie van de plaat bij 520g gedurende 2,5 minuten, verwijdert u het supernatant. Was vervolgens de cellen met 1x PBS en centrifugeert u de plaat opnieuw, gevolgd door het verwijderen van het supernatant.

Voeg vervolgens 100 microliters enzymatische celdetacheringsoplossing toe aan elke fles om de sferoïds te laten oplossen. Incubeer vervolgens de plaat gedurende acht minuten bij 37 graden Celsius. Controleer onder de microscoop of de sferoïds succesvol zijn opgelost.

Voeg 100 microliters DMEM toe. Centrifugeer vervolgens de plaat bij 520g gedurende 2,5 minuten. Vervolgens verwijdert u het supernatant en suspendeert u de cellen in 100 microliters DMEM.

Vervolgens, indien nodig, voert u een commercieel verkrijgbare colorimetrische proliferatietest uit en leest u de test in een ELISA-lezer. Alle cellijnen konden betrouwbare sferoïds genereren met verschillen in grootte en tijd van uitlezing. Primaire cellen vormden reproduceerbare sferoïds in ultra-lage aanhechtingsplaten.

De Ki-67-kleuring onthult de periferie van de cultuur die veel hogere proliferatiesnelheden vertoont dan centrale cellen, wat de nutriëntenverdeling in solide mucosale tumoren nabootst die vaak necrotische kernen vertonen. Hierbij wordt het effect van verschillende chemotherapeutische middelen en bestraling op sferoïdgrootte getoond. Bestraling met twee gray voorafgaand aan behandeling met Cisplatin, leidde tot een significante afname van de sferoïdgrootte in vergelijking met Cisplatin alleen.

Met verdere ontwikkeling van het genereren van sferoïds uit primaire menselijke cellen, is dit hoe het concept van therapietesten zou kunnen worden geïmplementeerd. Sferoïds zouden worden gegenereerd na tumorbiopsie en vervolgens getest op moleculaire kenmerken en therapiegevoeligheid. We waren in staat om een protocol te ontwikkelen om reproduceerbare sferoïds te genereren uit celsuspensies voor zowel cellijnen als primaire menselijke tumorcellen.

Deze multimodaal test is voldoende gevoelig om kleine verschillen tussen groepen te identificeren. In de toekomst zou de test kunnen worden gebruikt om eerst de individuele respons op standaard en experimentele therapieprotocollen te beoordelen. Ten tweede, karakteriseer verder de tumorcellen van verse specimens.

En ten derde, correleer de therapierespons met moleculaire patronen. Het gebruik van primaire cellen en de vorming van sferoïds zou de behoud van zoveel mogelijk kenmerken van in vivo tumorgroei mogelijk maken in combinatie met een kosteneffectieve test voor het bestuderen van individuele therapierespons.