Name: Engineering Golden fluorescentie door selectieve druk opneming van niet-canonieke aminozuren en eiwit analyse door massaspectrometrie en fluorescentie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Ontdek hoe je een goudkleurig fluorescent eiwit produceert via selectieve druk opneming van niet-canonieke aminozuren in E. coli. Deze methode biedt nieuwe mogelijkheden voor synthetische biologie en eiwitengineering.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Duitse Research Foundation (Cluster van Excellence "verenigen concepten in katalyse) T.F. en N.B. en door het federale ministerie van onderwijs en Wetenschappen (goedgekeurd programma"HSP 2020", TU-WIMIplus Project SynTUBio) naar F.-J.S.

1. de transformatie van Trp-auxotrofe E. coli
<ol><li>Chemisch transformeren of electrocompetent cellen (50 µL) van een stam van de Trp-auxotrofe E. coli , bv. ATTC 49980 (WP2, mutant afgeleid van E. coli stam B/R22), met 1 µL van een 1 ng/µL waterige oplossing van het pQE - 80 L His6-ECFP-plasmide met warmte schok of electroporation, respectievelijk. Raadpleeg de JoVE Science Education Database23,24 voor meer informatie. Opmerking: De expressie vector pQE - 80L His6-ECFP codeert een N-terminaal 6 x zijn-gelabeld ECFP21 gedreven door een bacteriële T5 promotor met lac operator. Het draagt verder een AmpR selectie marker en een colE1 oorsprong van replicatie (de pQE - 80 L vector ruggengraat reeks vindt u op: https://www.qiagen.com/mx/resources/resourcedetail?id=c3b71572-4d82-4671-a79b-96357fe926d1&lang=en & autoSuggest = true). De theoretische molecuulgewicht van het eiwit van de wild-type His6-ECFG (na chromofore rijping25) is 28303.92 Da. De vertaalde doel eiwit volgorde is als volgt (zijne-tag onderstreept, vector-afgeleide reeksen in vet): MRGSHHHHHHGSMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTWGVQCFSRYPDHMK QHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYISHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNIEDGS VQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK.
</li>
	<li>Plaat getransformeerde cellen op LB-agar platen (tabel 1) aangevuld met 10 g/L glucose, 100 µg/mL ampicilline en Incubeer de platen bij 37 ° C's nachts.</li>
</ol>2. recombinant eiwit expressie
<ol><li>
Overnachting cultuur van E. coli ATCC 49980 pQE - 80 L His6-ECFP
	<ol>
<li>Bereiden van 5 mL van LB medium (tabel 1; aangevuld met 10 g/L glucose, 100 µg/mL ampicilline) in een steriele 14 mL polystyreen cultuur buis voor aërobe groei en inoculeren met een afzonderlijk kolonie van een met behulp van een steriele Pipetteer tip of inoculatie lus agarplaat. Opmerking: Gebruik van kolonies van vers getransformeerde cellen wordt aanbevolen. De platen met bacteriële kolonies (uit stap 1.2.) kunnen worden achtergelaten bij 4 ° C voor meerdere dagen.</li>
		<li>Incubeer de cellen bij 37 ° C in een roteerschudapparaat op 200-250 rpm's nachts.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Expressie van wild-type ECFP
	<ol>
<li>Inoculeer 10 mL verse LB medium (tabel 1; aangevuld met 10 g/L glucose, 100 µg/mL ampicilline) met 100 µL van de overnachting cultuur in een 100 mL conische kolf. Incubeer de kolf bij 37 ° C in een roteerschudapparaat bij 200 omwentelingen per minuut. Opmerking: Optioneel, deze stap kan worden uitgevoerd in 10 mL NMM19 medium (tabel 1) aangevuld met 100 µg/L ampicilline en 0,5 mM L-tryptofaan (anderzijds indool kan worden gebruikt).</li>
		<li>Meten van de extinctie op 600 nm (OD600) elke 20 min. bij voorkeur gemeten celdichtheid door bepaling van de extinctie bij 600 nm (OD600) in een spectrofotometer een cuvet met een weglengte van 1 cm. altijd uitvoeren een verwijzing meting met behulp van het bijbehorende kweekmedium. Verdun de monsters en meng de monsters goed te verkrijgen van een meting waarde van 0.1-0.8 en vervolgens wordt berekend OD600 met behulp van de verdunningsfactor. Voor meer informatie, gelieve te verwijzen naar eerdere publicatie 26.</li>
		<li>Bij het bereiken van een600 OD-waarde van 0.5-0.8 (ongeveer 2-3 uur na de inenting), neemt u monster "before inductie" voor SDS-PAGE (polyacrylamide-gel-elektroforese van natrium dodecyl sulfaat, stap 4).</li>
		<li>Doel eiwituitdrukking veroorzaken door de vloeibare cultuur tot 0.5 mM IPTG (isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, vanaf 1 M stockoplossing) aan te passen en Incubeer het bij 30 ° C in een roteerschudapparaat bij 200 omwentelingen per minuut gedurende 4-8 uur. Opmerking: Cyaan fluorescente proteïnen zijn gewoonlijk uitgedrukt bij temperaturen onder de 37 ° C27.</li>
		<li>Monster genomen "na expressie" voor SDS-pagina (stap 4.).</li>
		<li>Oogst de bacteriecellen door centrifugeren voor 10 min op 5.000 x g- en 4 ° C.</li>
		<li>Verwijder het supernatant door decanteren en bevriezen van de cel pellets bij-20 ° C of -80 ° C tot doel eiwitreiniging.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
SPI voor de productie van GdFP
	<ol>
<li>Inoculeer 10 mL van NMM19 medium (tabel 1) aangevuld met 100 µg/mL ampicilline, 15 µM tryptofaan en 10 µL van overnachting cultuur in een 100 mL conische kolf en de cultuur kolf 's nachts bij 30 ° C in een roteerschudapparaat op 200 rpm uit te broeden. Opmerking: Een verscheidenheid van chemisch gedefinieerde media voor teelt van E. coli en SPI is beschikbaar. Naast NMM gebruikt hierin, MOPS middellange28, glucose-minerale zouten middellange29, Davis minimaal middellange30, M9 minimaal middellange31, of GMML32 kan worden gebruikt.</li>
		<li>De volgende dag, meten OD600 elke 30 minuten, totdat de waarde alleen door minder dan 0,05 meer dan 30 min verandert. De waarde van het plateau moet ongeveer 1. Opmerking: Afwijkingen door ± 0,3 eenheden zijn aanvaardbaar. Afhankelijk van de bacteriële stam en medium gebruikt, kan de concentratie van de oorspronkelijke tryptofaan (stap. 2.3.1) aanpassing nodig.</li>
		<li>Neemt monster "before inductie" voor SDS-pagina (stap 4.).</li>
		<li>Oogst de bacteriecellen door centrifugeren voor 10 min op 5.000 x g- en 4 ° C. Verwijder het supernatant door decanteren.</li>
		<li>Resuspendeer de cellen in 10 mL NMM19 medium met 100 µg/mL ampicilline in een 100 mL conische kolf en 4-amino-indole toevoegen om een eindconcentratie van 1 mM met behulp van de stockoplossing van 50 mM. Blijven de incubatie gedurende 30 minuten bij 30 ° C in een roteerschudapparaat bij 200 omwentelingen per minuut. Opmerking: Deze stap wordt aanbevolen vanwege de lage chemische stabiliteit van ampicilline en zorgt voor een cellulaire opname van 4-amino-indool.</li>
		<li>Doel eiwituitdrukking veroorzaken door toevoeging van IPTG aan een eindconcentratie van 0.5 mM 1 M papier en Incubeer het monster 's nachts bij 30 ° C in een roteerschudapparaat bij 200 omwentelingen per minuut. Opmerking: Cyaan fluorescente proteïnen zijn gewoonlijk uitgedrukt bij temperaturen onder de 37 ° C27.</li>
		<li>De volgende dag, meten OD600.</li>
		<li>Monster genomen "na expressie" voor SDS-pagina (stap 4.).</li>
		<li>Oogst de bacteriecellen door centrifugeren voor 10 min op 5.000 x g- en 4 ° C en weggeworpen door decanteren.</li>
		<li>In het geval dat een dergelijk vaartuig niet gebruikt werd voor centrifugeren, breng de pellet cel in een 50 mL conische polystyreen buis met behulp van een spatel. De cel pellet bij-20 ° C of -80 ° C tot doel eiwitreiniging bevriezen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. target eiwitreiniging via geïmmobiliseerdet metaalion affiniteitchromatografie (IMAC)
<ol><li>
Lysis van de bacteriële cel
	<ol>
<li>Ontdooi de cel pellet op ijs voor 10-20 min.</li>
		<li>Resuspendeer de pellet cel in een 50 mL conische polystyreen buis met behulp van 5 mL ijskoud bindende buffer (tabel 1) op het ijs.</li>
		<li>Voeg 20 µL van 50 mg/mL lysozym, 20 µL van 1 mg/mL DNase ik 20 µL van 1 mg/mL RNase A. Sluit de buis, meng zachtjes door 5 keer omkeren, en houden op ijs gedurende 30 minuten. Opmerking: Gedeeltelijke cel onderbreking optreedt als gekatalyseerd door lysozym.</li>
		<li>Lyse de cellen door sonification met behulp van een echografie homogenizer tip met behulp van drie cycli van 3 min in een polystyreen tube van 15 mL afgekoeld door slush ijs met 2 s voor pulse, 4 s van pauze en 45% amplitude. Opmerking: U kunt ook hogedruk homogenisering kan worden gebruikt, bijv., 20 cycli bij 14.000 psi. Eventueel verdunnen met behulp van bindende buffer te bereiken van het volume van de minimale instrument. Eiwit extractievloeistoffen kunnen bovendien worden gebruikt voor de verstoring van de cel. Zie materialen tabel voor voorbeelden.</li>
		<li>Centrifugeer het monster gedurende 30 minuten bij 15.000-18.000 x g, 4 ° C.</li>
		<li>Breng de bovendrijvende substantie in een verse buis en noteer het vloeibare volume.</li>
		<li>Filtreer de oplossing door een 0,45 µm spuit-filter door middel van een 5 mL kunststof Luer lock spuit en een Polyvinylideenfluoride (PVDF) syringe filter.</li>
		<li>Neemt monster "lysate" voor SDS-pagina (stap 4.).</li>
		<li>Resuspendeer cel puin pellet in ddH2O (gelijk volume als voormalige lysate).</li>
		<li>Nemen monster "pellet" voor SDS-pagina (stap 4.).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
IMAC zuivering
	<ol>
<li>Gebruik een 1 mL voorverpakt of zelf Lunchpakket IMAC FPLC (snelle proteïne-vloeistofchromatografie) kolom volgens de instructies van de fabrikant. Bindende buffer (tabel 1) voor kolom evenwichtsinstelling alsook wat betreft de wassen stap die volgt nadat de cel lysate is toegepast op de kolom gebruiken.</li>
		<li>Verzamelen en bundelen eluaat breuken met GdFP die kunnen worden geïdentificeerd door zichtbaar licht gouden kleur. Opmerking: Optioneel, de doel-eiwit kan worden geëlueerd met behulp van een lineaire imidazool verloop (0-250 mM) met behulp van een geautomatiseerd FPLC systeem.</li>
		<li>Bepaal de concentratie van de eiwitten met behulp van de literatuur waarde uitsterven-coëfficiënt op 466 nm (ɛ466 nm = 23.700 M-1 cm-1)33 met elutie buffer als referentie. Raadpleeg voor meer informatie over de procedure, eerdere publicatie26.</li>
		<li>Neem monster "eluaat" voor SDS-pagina, en gebruik van 1-10 µg eiwit per rijstrook in geval van Coomassie-kleuring. Opmerking: SDS steekproef bedragen kunnen variëren naargelang de kleuringstechniek en kleurstof gevoeligheid.</li>
		<li>Dialyze een aliquoot gedeelte van het eluaat breuken tegen dialyse buffer of MS buffer met behulp van een membraan met een molecuulgewicht cutoff (MWCO) van 5.000-10.000. Bereiden dialyse membraan volgens de instructies van de fabrikant. Dialyze een 1 mL monster driemaal tegen 100 mL buffer voor ten minste 2 uur. Raadpleeg voor meer informatie over deze procedure, eerdere publicatie34.</li>
		<li>Voor opslag, bevriezen eiwitSteekproef in dialyse buffer bij-80 ° C. Opmerking: Aliquots moet stabiel gedurende ten minste 6 maanden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. SDS-pagina de bereiding van de monsters van E. coli hele cel Extract
<ol><li>Overdracht van een gelijkwaardig aan 1 OD600 mL celsuspensie = 1 afhanging (bv. 500 µL van OD600= 2) in een tube van 1,5 mL microcentrifuge.</li>
	<li>Het oogsten van de cellen door gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, 5000 x g centrifugeren. Verwijder het supernatant door pipetteren.</li>
	<li>Voeg 80 µL van ddH2O en 20 µL van 5 x SDS laden kleurstof buffer (tabel 1) naar de cel pellet en meng door pipetteren.</li>
	<li>Het denatureren van de cellen door verhitting tot 95 ° C gedurende 5 minuten in een water-bad of warmte-blok. Vervolgens koelen de monsters tot op kamertemperatuur.</li>
	<li>Gebruik 10 µL voor SDS-pagina Coomassie gebeitste volgens eerdere publicatie35. Opmerking: SDS steekproef bedragen kunnen variëren naargelang de kleuringstechniek en kleurstof gevoeligheid.</li>
</ol>5. intact eiwit massa analyse door krachtige vloeibare chromatografie (HPLC) gekoppeld aan Electrospray ionisatie Time-of-flight massaspectrometrie (LC-ESI-TOF-MS)
Opmerking: HPLC verloop, instellingen en buffers kunnen variëren afhankelijk van de scheiding tussen kolom en instrument gebruikt. Zie materialen tabel voor voorbeeldige apparatuur.
<ol><li>Bepalen de eiwitconcentratie uit een monster dialyzed tegen MS buffer zoals eerder beschreven (stap 3.2.3.) met MS buffer (Zie materialen tabel) als referentie.</li>
	<li>Verdun de eiwitSteekproef tot 0,1 mg/mL met behulp van MS buffer voor een eindvolume van 80 µL, Meng door zorgvuldige pipetteren, breng de oplossing kwantitatief over in een MS autosampler flacon met inzetglas en sluit deze met een cap. Het verwijderen van luchtbellen door flicking de flacon.</li>
	<li>Vul een tweede autosampler flesje zonder Glasfront (buffer leeg) met 1 mL van MS buffer.</li>
	<li>Het toestaan van het instrument om op te warmen. Kalibreren van het instrument uit te voeren. Ervoor te zorgen dat voldoende hoeveelheid vloeibare chromatografie-grade oplosmiddelen beschikbaar zijn (> 100 mL).</li>
	<li>Een lineaire 20 min HPLC verloop van 5% tot 80% buffer een (0,1% mierenzuur in ddH2O), in combinatie met buffer B Program (0,1% mierenzuur in acetonitril).</li>
	<li>HPLC beginnen bij een stroom van 0.3 mL/min en wacht totdat de kolom druk stabiel is.</li>
	<li>Instellen van een autosampler geïnjecteerde volume van 5 µL voor de LC-ESI-TOF-MS methode, een composities maken voor een leeg draaien gevolgd door een monster run en toewijzen van de overeenkomstige autosampler flacon posities. De composities worden uitgevoerd.</li>
	<li>Na voltooiing van de composities, open het gegenereerde gegevens voorbeeldbestand. Een celbereik selecteren in het huidige perceel (TIC) van de totale ion voor deconvolutie en deconvolute van het spectrum van de MS met behulp van de maximale entropie deconvolutie algoritme. Opmerking: Afhankelijk van de experimentele omstandigheden, andere soorten kan optreden van niet-gerijpt FP of buffer ion adducten.</li>
</ol>6. fluorescentie levensduur metingen en verval-geassocieerde Spectra (DAS) van GdFP
Opmerking: Voor de instrumentatie van time-resolved Fluorescentiespectroscopie, Raadpleeg Tabel van materialen voor voorbeeldige apparatuur. Extinctie, alsmede fluorescentie excitatie en emissie spectra van fluorescente proteïnen kan ook worden opgenomen met behulp van laboratorium UV/Vis- en fluorescentie spectrofotometers.
<ol><li>
Golflengte-resolved fluorescentie levensduur meting van GdFP
	<ol>
<li>Bereiden van 2 mL van een 1 µM oplossing van GdFP door verdunning in PBS buffer (tabel 1) met een pH van 7. Vul de oplossing in een 1 cm kwarts cuvette.</li>
		<li>Ps-gepulseerde 470 nm laser voor monster excitatie en de 488 nm emissie long pass filter installeren en aanpassen van 600 L/mm raspend van het tijd - en golflengte-gecorreleerde één foton tellen36 (TWCSPC) detector voor verwerving van het regime van de golflengte 500-700 nm.</li>
		<li>Verwerven fluorescentie emissie met een snelheid van de graaf van ongeveer 200 x 103 fotonen/s tot ongeveer 103 punten worden verzameld in het maximum van de overname van de fluorescentie decay bochten met één foton tellen software.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Meting van de instrumentale reactie functie37 (IRF)
	<ol>
<li>Vervang de monster Cuvet met een 1 cm kwarts cuvette gevuld met 1 g/L Coloïdale siliciumdioxide (/g ~ 220 m2) in PBS buffer met een pH van 7. Opmerking: De silica schorsing is opgesteld op basis van een waterige suspensie van 400 g/L.</li>
		<li>488 nm emissie long pass filter en invoegen grijs filters aan te passen het tempo van de detector van de TWCSPC tot onder 100 x 103 graven/s met graaf verwijderen.</li>
		<li>Aangepast rooster voor de verwerving van 470 nm fotonen in kanaal 8 van de 16-kanaals TWCSPC detector.</li>
		<li>Verwerven de IRF tot ongeveer 10 x 10,3 punten worden verzameld in de maximale emissie.</li>
		<li>Convert fluorescentie decay krommen en IRF naar ASCII-gegevensbestanden met global passend38 programma.</li>
		<li>Gedrag Global passen volgens een model van een som van drie exponentiële componenten met levensduur als gekoppelde parameters.</li>
		<li>Perceel verval gekoppeld spectra (DAS) als amplitude distributies van verval van de afzonderlijke componenten in afhankelijkheid van de golflengte software van de analyse van de gegevens.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Om te bereiken zeer hoge efficiëntie van de opneming van de ncAA, berust de SPI auxotrophy gebaseerde methode op het gebruik van metabolisch gemanipuleerde gastheer cellen, die zijn niet in staat voor het synthetiseren van de bijbehorende natuurlijke tegenhanger van de ncAA. Voor E. colizijn dergelijke stammen beschikbaar. Zelfs de gelijktijdige integratie van meerdere ncAAs in hetzelfde eiwit is haalbaar met behulp van de multiauxotrophic stammen. De residu-specifieke wijze van vervanging en de chemische repertoire wordt beperkt tot soortgelijke chemische analogen kan worden gezien als nadelen. Een groot aantal eiwit varianten kan echter worden geproduceerd zoals het natuurlijke bacteriële vertaling apparaat talrijke aminozuur-analogen tolereert. Bijvoorbeeld, kan meer dan 50 ncAAs in eiwitten met behulp van in vitro vertaling, ongeveer 73% van alle codonen van de genetische code beschikbaar te zijn voor hertoewijzing40worden opgenomen. SPI kunnen bovendien ook efficiënte multisite etikettering van de target eiwit41. In principe de SPI-methodologie is niet beperkt tot E. coli, maar kan werken in een willekeurige andere host en voor elk van de canonieke 20 aminozuren, mits auxotrofe stammen en gedefinieerde teelt media beschikbaar zijn. Bijvoorbeeld, zijn twee methionine analogen, azidohomoalanine (Aha) en homopropargylglycine (Hpg), commercieel beschikbaar en worden gebruikt voor het labelen van proteïnen en proteomes in verschillende organismen. Aha kan bovendien worden geproduceerd intracellulair en vervolgens opgenomen in eiwit42. Deze ncAA is vooral geschikt voor bioorthogonal vervoegingen zoals Klik chemie zoals ontwikkeld door Tirrel en collega's: plant bijvoorbeeld in weefsel van Arabidopsis thaliana, Bombyx mori larven43, Drosophila cellen44, larvale zebrafish45 evenals zoogdiercellen met inbegrip van neuronen46, eiwitten kunnen worden voorzien van Aha47,48. Trp-analogen zijn ook met succes opgenomen in antimicrobiële peptiden in Trp-auxotrofe Lactococcus lactis stammen49. SPI is ook handig voor het gebied van Xenobiology50,51, die onderzoekt de alternatieven voor de fundamentele chemische samenstelling van het leven. Bijvoorbeeld, werd gebaseerd op vorige kunstwerken op E. coli52 en B. subtilis53, een stam E. coli ontwikkeld onlangs door een evolutionaire strategie met selectieve druk om te gebruiken in plaats van thienopyrrole indool, resulterend in Proteoom bestrijkende vervanging van tryptofaan door thienopyrrole-alanine in de genetische code54. In het algemeen, het canonieke aminozuur Trp, die is gecodeerd door een enkele triplet (UGG), presenteert een veelbelovende doelwit voor Eiwittechnologie toe te schrijven aan de rijke facetten van indool chemie, die talrijke chemische variaties biedt. Onlangs, en als een alternatief voor SPI gebaseerde integratie, een roman die SCS platform staat te nemen Trp-analogen site-specifically in zowel de bacteriële en de eukaryote gastheren is gemeld55. Dit verbreedt verder de werkset van in vivo ncAA gebaseerde Eiwittechnologie, met inbegrip van de wijziging van de spectrale eigenschappen.
Naast het gebruik van auxotrofe expressie hosts vereist het SPI-protocol strikte gisting voorwaarden, zowel in termen van doel expressie timing en de samenstelling van het medium om ncAA opneming hoogrenderende en doel eiwit opbrengst te bereiken 56. teelt wordt uitgevoerd met behulp van chemisch gedefinieerde minimale media, die in wezen bevatten naast grote zouten van de bronnen van stikstof (ammoniumzout) en koolstof (D-glucose), vitaminen en sporenelementen. Hoewel niet strikt vereist in het ontbreken van verdere auxotrophies, de resterende aminozuren (20 -n, als n aminozuren worden vervangen) worden vaak toegevoegd ter bevordering van de bacteriegroei57. Tijdens een eerste groeifase voor inductie van doel eiwit expressie, worden de n -canonieke aminozuren worden vervangen toegevoegd in het beperken van de concentraties. Cellulaire groei gaat door tot de gerichte essentiële aminozuren zijn uitgeput, zo experimenteel aangegeven door een stationaire OD600. Vervolgens wordt het kweekmedium vervangen door verse medium dat ontbreekt het verarmd aminozuur en bevat de ncAA in overvloedige concentraties. Voor de ribosomal opname van tryptofaan-analogen zoals in dit protocol, wordt een analoge indool gevoed, die intracellulair wordt geconverteerd naar de corresponderende tryptofaan afgeleide door tryptofaan synthase58. Vervolgens wordt doel eiwit expressie veroorzaakt. In dit stadium zijn de cellen dicht bij het einde van logaritmische groei, zoals een evenwicht tussen totale celaantal en fitness. Zoals de aanwezigheid en de opneming van de canonieke amino tot wild-type eiwitproductie leiden zou, is het essentieel om ervoor te zorgen dat het essentiële aminozuur volledig vóór inductie uitgeput is. Ook is het verplicht om de onderzoeken van de efficiëntie van ncAA opneming in het doel-eiwit, vaak door massaspectrometrie. In geval van substantiële aanwezigheid van het canonieke aminozuur, de teelt voorwaarden moeten worden aangepast, bijvoorbeelddoor een wijziging van de concentratie van de essentiële amino acid(s) voor de initiële groeifase of de duur van de laatste. In het geval van de activiteit van de lage jaarlijkse activiteitenverslagen naar de ncAA kunnen de overexpressie van het endogene enzym of co uitdrukking van een verschillende jaarlijkse activiteitenverslagen, oftewel actiever naar de ncAA, transiënte59.
Het canonieke aminozuur Trp is begiftigd met drie opmerkelijke functies: (i) de natuurlijke overvloed in eiwitten is laag; (ii) de biofysische en chemische eigenschappen uniek zijn (bv., het is meestal de dominante oorsprong van de intrinsieke fluorescentie van eiwitten en peptiden), en (iii) het draagt bij aan een verscheidenheid van biochemische interacties en functies met inbegrip van Π-stapelen, H-binding en catie-π interacties. Al deze functies zijn radicaal veranderd op Trp → 4-amino-Trp vervanging GdFP. Beyond twijfel, het ontwerp van een "gouden" klasse van avGFPs is een opmerkelijk voorbeeld voor engineering op maat autofluorescent eiwitten. Met verschillende spectrale eigenschappen, kan de FPs naar bepaalde spectrale windows via mutagenese en ncAA opneming worden afgestemd. In het geval van GdFP, wordt dit bereikt door een eenvoudige chemische uitwisseling H → NH2 in het kader van de ring van de indool opgenomen in de ECFP chromofore triade treft. Figuur 5 toont de effecten van ncAA integratie binnen de chromofore. De invoering van de elektron-doneren groep afkomstig uit 4-amino-indool (intracellulair geconverteerd naar 4-amino-Trp) kan een verscheidenheid van mesomeric structuren die een gestabiliseerde geëxciteerde toestand verklaren kunnen. Spectroscopically, haar uitgebreide Stokes shift en rood-verschoven fluorescentie uitstoot het gevolg zijn van deze verschillende eigenschappen van het uitgebreide geconjugeerd systeem. Zoals gemeld eerder, de verbeterde intramoleculaire gratis overdracht binnen de GdFP chromofore is inherent gevoelig voor pH (figuur 4B) en vergezeld gaat van een grotere verandering in dipoolmoment tussen de S0 grond en S1 opgewonden staat ten opzichte van ECFP33. Als alternatieve elektron-doneren groepen, kunnen tryptofaan analogen rekening houdend met een indool-ring vervangen door hydroxy groepen worden gebruikt, zoals gerapporteerd in een vergelijkende studie met de model eiwit barstar41.
De absorptie en fluorescentie spectra van GdFP worden uitgebreid ten opzichte van ECFP en EGFP (Figuur 3 c en D). Homogene verbreding van de absorptie en fluorescentie bands is over het algemeen veroorzaakt door vibrationele modi in de chromofoor en, bovendien, koppeling van de chromofore aan verdere vibrationele modi aanwezig in de eiwit-60. De koppeling aan de lokale eiwit-omgeving wordt ondersteund door kosten gelokaliseerd op de chromofore. Omdat de structurele heterogeniteit van het eiwit leidt tot lokale variaties van het vibronic spectrum, dergelijke koppeling tussen de vibronic spectra van de chromofoor en de rest van het eiwit worden ondersteund door de verplaatsing van de lading en mesomeric staten zoals aangegeven in Figuur 5. Door deze koppeling ondersteunt ook de grote verschuiving van Stokes en noodzakelijkerwijs vermindert het quantumrendement van fluorescentie. In vergelijking met andere rood-verschoven FPs vertoont GdFP zelfs betere eiwitstabiliteit en een lage tendens voor aggregatie33,61,62. Het is niet alleen verschilt in kleur van andere FP-varianten, maar vertoont ook een aanzienlijk hogere thermostabiliteit en verbeterde coöperatie33vouwen. De intensiteit van de fluorescentie is ten minste 90% behouden bij verhitting tot 60 ° C, terwijl ECFP fluorescentie is teruggebracht tot ongeveer 30%. In eiwitten bijdragen aromatische aminozuren vaak aan netwerken van interagerende zijketens, die vaak een stabiliserende invloed op de tertiaire structuur van het eiwit hebben. avGFP herbergt zo'n kant keten netwerk, dat uit de chromofore zelf, als goed als Phe-165, zijne-148 en Tyr-145 bestaat. Deze zijketens zijn niet alleen heel stijf in de GdFP structuur33, maar bovenal vormen ze hydrofobe contacten met de chromofore. De meest opvallende nieuwe kenmerk geïdentificeerd in GdFP is dat de aminated chromofore meer proximale tot Phe-165. Deze interactie is een functie niet waargenomen in andere bekende avGFPs. Als de twee residuen 3.2-4.5 Å apart zijn, kunnen amino-aromatische interacties ook aanwezig zijn. Samen met de aminering-geïnduceerde resonantie te stabiliseren de chromofore, deze waarschijnlijk deze hydrofobe netwerk stabiliseren van aminozuren in een coöperatieve manier. Een meer doeltreffende intramoleculaire gratis overdracht mogelijk ondersteund door deze interacties in de geëxciteerde toestand ten opzichte van de grondtoestand van het chromofoor en het op zijn minst gedeeltelijk verantwoordelijk voor de 108 nm Stokes shift33,62 .
In rationele ontwerp van fluorophore eigenschappen, is een toename van de omvang van de gedelokaliseerd π-systeem voorspelde resulteren in een rood-verschoven excitatie golflengte. Deze vuistregel wordt nageleefd door de reeks van aminozuren in positie 66 leidt tot neutraal chromophores: Phe (λmax = 355 nm) < zijn (λma x= 386 nm) < Tyr (λmax = 395 nm) < Trp (λmax = 436 nm)63. In de natuur, is de uitbreiding van de chromofore van geconjugeerd systeem van pi-bindingen bereikt door verschillende strategieën. Voor DsRed vanaf Discosoma striata, is zij uitgebreid door de integratie van een extra amino zuur, dus verschuiven λmax naar 573 nm64. De chromofore van asFP595 (λmax = 595 nm) van Anemonia sulcata werd uitgebreid door een imino groep, uitbreiding van de π-systeem-65. Aangezien de chromofore van GdFP en andere avFPs van dezelfde grootte, moet een ander beginsel inhouden een emissie golflengte in het bereik van de uitgebreide DsRed en asFP595 chromophores. De diepe Stokes verschuiving van 108 nm wordt toegeschreven aan de aparte structuur van de GdFP chromofore, die een nieuwe fotofysische beginsel in het ontwerp van autofluorescent eiwitten onthult. Voorlopige berekeningen (zoals gerapporteerd in 62) is gebleken dat het dipoolmoment van het opgewonden statuswaarden chromofore van GdFP aanzienlijk groter dan in de grondtoestand, in tegenstelling tot de respectievelijke waarden van ECFP. Overwegende dat het dipoolmoment van GdFP van ~ 3 D (Debye) in de S0 Braziliaanse tot ~ 15 D in S1 stijgt, de verandering voor de ECFP chromofore was vrij gematigd (van ~ 4 D tot ~ 6 D). Dus, het unieke gouden fluorescentie van GdFP wordt veroorzaakt door aanzienlijke intramoleculaire gratis overdracht binnen de chromofore, waardoor het scala aan mogelijke mesomeric structuren (Zie Figuur 5) die het mogelijk voor de stabilisatie van de resonantie maken. Dit vermindert het energieniveau waaruit emissie plaatsvindt. Als gevolg van de ingrijpende veranderingen in het dipoolmoment op excitatie is de intramoleculaire gratis scheiding de belangrijkste reden voor de wijzigingen in het elektrostatische potentieel van het chromofore milieu. De omliggende eiwit matrix, beurtelings, aangepast aan de veranderingen in de ladingsverdeling na chromofore excitatie. De daaropvolgende structurele versoepeling verlaagt het energieniveau van de opgewonden chromofore, die de fluorescentie-spectrum naar de rode vanwege haar gratis overdracht karakter verschuift. Voor dezelfde reden, als gevolg van de grote Stokes shift en de verbeterde tarieven van radiationless processen, de fluorescentie quantumrendement van GdFP wordt verminderd in vergelijking met ECFP33.
De hoge quantumrendement en kleine Stokes verschuiving van ECFP en EGFP zijn meestal toegeschreven aan een rigide eiwit-omgeving van de chromofore, waardoor het aantal vrijheidsgraden en, bijgevolg, interne conversie naar de gunst van de radiatieve versoepeling van de geëxciteerde toestand 66. bijgevolg de moleculaire design van meer rigide ingesloten chromophores met verminderde koppeling naar het resterende eiwit matrix kan dienen als een gids voor het produceren van verder rood-verschoven GFP derivaten met hoge fluorescentie quantumrendement. Daarom, voor verdere engineering benaderingen voor de productie van rode-verschoven autofluorescent eiwitten, uitbreiding van het systeem van de π-elektronen en een stijve chromofore structuur met zwak koppelen aan het eiwit milieu is zeer wenselijk. Dergelijke wijzigingen kunnen ook worden ingevoerd rechtstreeks in GFP gebaseerde chromophores of door plaatsing van de gewenste ncAAs in de omgeving van chromofore.

Sinds de ontdekking van de groen fluorescente proteïne in de kwal Aequorea victoria (avGFP) in 19621 en de eerste heterologe expressie in 19942 in andere eukaryotische cellen, zijn fluorescente proteïnen van het GFP-familie geworden zeer waardevolle hulpmiddelen en doelen in de biowetenschappen. Uitgebreide genetische en moleculaire techniek opgenomen de aanpassing van de soortspecifieke codon gebruik, versnelling van vouwen, verbeterde rijping, verhoogde helderheid, preventie van oligomerisatie en afstemming van de spectrale en fotochemische eigenschappen inclusief de mogelijkheid om omkeerbaar photoswitch3,4,5,6. GFP dankt haar fluorescentie van haar 4-(p- hydroxybenzylidene) imidazolidin-5-one (HBDI) chromofoor. De laatste autocatalytically ontstaat uit de zogenaamde chromofore triade van aminozuren (Ser-65/Tyr-66/Glycine-67 in avGFP) na de vorming van een extra covalente binding binnen de ruggengraat van de peptide onder invloed van moleculaire zuurstof7. Het resoneert gestabiliseerde geconjugeerd systeem communiceert dynamisch met de moleculaire omgeving beschikbaar, zodat voor de absorptie in het zichtbare bereik en karakteristieke groene fluorescentie van deze proteïnen.
Binnen de chromofore godentrias is de aanwezigheid van een aromatisch aminozuur verplicht. Echter, de standaard aminozuur repertoire bestaat uit slechts vier aromatische residuen (zijn, Phe, Trp en Tyr). Dit houdt in dat conventionele mutagenese benaderingen om aanzienlijk meer varianten van het avGFP rood-verschoven ten opzichte van de meest rood-verschoven natuurlijke FPs zoals DsRed8 van Discosoma striata -coralimorphs of mKate/mNeptune9 van de zeeanemonen Entacmaea quadricolor. Dus, het far-red en nabij-infrarood gedeelte van het optisch spectrum boven 600 nm is dun vallende GFP varianten. Dit is natuurlijk een ernstige beperking voor fluorescentie microscopische benaderingen die vereisen spectrale demultiplexing van verschillende soorten van de fluorophore op hetzelfde moment. Bijvoorbeeld lange golflengte markeringen zijn ook nodig om het maken van het regime van de laag absorptie van huidweefsel tussen 700 en 1000 nm in instellingen voor diepe weefsel imaging10gebruiken.
Fluorescerende van avGFP afgeleide eiwitten zijn onderverdeeld in verschillende klassen op basis van de spectroscopische eigenschappen en chemische aard van hun chromophores11. Met haar triade Ser-65/Tyr-66/Glycine-67, de wild-type chromofore bestaat als een equilibrated mengsel tussen de neutrale, fenolische vorm (λmax = 395 nm, ε = 21.000 M-1cm-1) en de anionogene phenolate vorm (λmax = 475 nm, ε = 7100 M -1cm-1), en het emissiespectrum vertoont een één piek op 508 nm. De hydroxylgroep van Ser-65 is van cruciaal belang, aangezien het schenkt een H-obligatie te Glu-222 in de omgeving van chromofoor (afstand: 3,7 Å), dat bevordert de ionisatie van deze carboxylaat. Klasse ik wordt gekenmerkt door een chromofore anionogene phenolate, zoals in EGFP (Phe-64-Leu/Ser-65-Thr;max λ = 488 nm, ε = 35.600 M-1cm-1, λem = 509 nm). Als gevolg van de vervanging van de Ser-65-Thr(Ala,Gly), de 395 nm excitatie piek van het neutrale fenol-formulier wordt onderdrukt en de 470-475 nm piek van de anionactieve phenolate is vijf - tot zes keer uitgebreid en verschoven naar 490 nm. Klasse II bestaat uit eiwitten met een neutrale fenolische chromofore, zoals saffier-GFP. Hier, de vervanging van Thr-203-Ile bijna volledig onderdrukt de 475 nm excitatie, waardoor alleen de piek op 399 nm. Aangezien de anionogene chromofore niet naar behoren solvated zijn, is zijn neutrale vorm favoriet. Klasse III bestaat uit de "gele" fluorescerend varianten (EYFP; Ser-65-Gly/val-68-Leu/ser-72-Ala/thr-203-Tyr; Λmax ε = 514 nm, ε = 84, 600 M-1cm-1, λem = 527 nm) met π-stapelen interactie van een aromatische zijketen en de phenolate, zoals veroorzaakt door de Thr-203-His(Trp,Phe,Tyr) vervangingen, die leiden tot maximaal 20 nm rood-verschoven emissie-maxima (Thr-203-Tyr). Verdere substitutie (Gln-69-Lys) resulteert in een ander 1-2 nm red shift tot 529 nm, de meest rood-verschoven avGFP variant11bekend. De uitwisseling van de fenol voor een indool (Tyr-66-Trp) maakt klasse IV, zoals in de cyaan-belichting fluorescerende ECFP (Ser-65-Thr/Tyr-66-Trp; λmax1 = 434 nm, ε = 24,800 M-1cm-1; λmax2 = 452 nm, ε = 23,600 M-1cm -1 ; Λem1 = 477 nm, λem2 = 504 nm). De accommodatie van de omvangrijke indool is waarschijnlijk ingeschakeld door andere, compenserende mutaties. De ECFP excitatie en emissie-maxima vallen inbetween die van eiwitten met neutrale of anionogene chromophores. Klasse V eiwitten haven een imidazool in plaats van de fenol (Tyr-66-Hsi), bijv., blauw-belichting fluorescerende eiwitten zoals EBFP. Klasse VI wordt geproduceerd door een fenol-naar-fenyl uitwisseling ten gunste van de neutrale chromofore vorm uitsluitend, die bijgevolg tot de meest blauw-verschoven excitatie en uitstoot piek posities leidt (360 nm en 442 nm, respectievelijk).
Klassieke plaats-geleide mutagenese is vooral geschikt voor de productie van roman avGFP chromofore varianten, door de permutatie van de 65-67 tripeptide en interactie residuen in het kader van de canonieke 20 aminozuren. Deze mogelijkheden kunnen verder worden uitgebreid wanneer niet-canonieke varianten van aromatische aminozuren worden ingevoerd tijdens ribosomal eiwit synthese12. In principe zijn er twee manieren om dit te bereiken. De eerste strategie is afhankelijk van de tolerantie van de substraat van het eiwit vertaling machines, met name van het aminoacyl-tRNA synthetases (aaRSs) naar verwante aminozuur-analogen. Om dit te bereiken met een hoog rendement, auxotrofe E. coli expressie zijn stammen die niet in staat zijn om de bijbehorende natuurlijke aminozuur te synthetiseren. Hierdoor is de vervanging van het laatste door het toevoegen van geschikte niet-canonieke aminozuren (ncAAs) of precursoren daarvan aan het kweekmedium. Deze strategie, ook bekend als selectieve druk opneming (SPI)13,14, kunt residu-specifieke vervangingen, die leiden wereldwijde opneming van de ncAA tot. De tweede strategie gebruikt stop codon suppressor tRNAs die belast zijn met de ncAA door ontworpen jaarlijkse activiteitenverslagen van enzymen. Dit resulteert in de readthrough van in-frame stop codonen en laat site-specific ncAA opneming. Bijgevolg leidt deze methode van stop codon onderdrukking (SCS) tot de uitbreiding van de genetische code15. Via mutagenese, een stop codon in het target-gen op de gewenste site geplaatst. In principe, SPI ook inzetbaar maken van recombinante peptides en proteïnen, rekening houdend met een unieke installatie van de ncAA, gezien het feit dat zeldzame canonieke aminozuren zoals BMO of Trp worden gekozen voor vervanging. Met Trp, SPI benaderingen is aangetoond dat ze werken met een grote verscheidenheid aan analogen inclusief 4 - F-, 5 - F - en 6-F-Trp, 7-aza-Trp, 4-OH - en 5-OH-Trp, alsmede 4- en 5-NH2- Trp of zelfs β (thienopyrrolyl) alanine derivaten16 ,17,18,19,20. SPI zou dus zeer gunstig voor het vervangen van aromatische aminozuren van GFP chromophores door niet-canonieke varianten de mogelijkheid om verdere spectra en Stokes verschuiving van deze FPs te verkennen. Wat betreft alle wijzigingen van de volgorde van de eiwitten, moet de verenigbaarheid met FP vouwen en chromofore rijping experimenteel worden getest.
Hierbij maken we gebruik van klasse IV ECFP21, die in plaats van de wild-type avGFP Tyr, een residu Trp binnen haar chromofore triade draagt. Met SPI, wordt dit Trp-66 (en Trp-57, het alleen andere Trp residu in ECFP) vervangen door de 4-amino-Trp. De aanwezigheid van de elektron-doneren aminogroep van 4-amino-Trp binnen de chromofore gunsten de stabilisatie van de resonantie van een geëxciteerde toestand veel rood-verschoven proton overdracht (ESPT) begiftigd met een 108 nm Stokes verschuiving. Deze "gouden" fluorescent proteïne (GdFP) vormt de variant met de grootste rode de verschuiving van de fluorescentie maximale (574 nm) onder alle avGFP afkomstige eiwitten. We beschrijven de methode van GdFP productie van de eiwitten door SPI en de protocollen voorzien in de verplichte analyse van de resulterende gemodificeerde eiwitten door massaspectrometrie. Verder laten we zien hoe de GdFP kan worden gebruikt en geanalyseerd in time-resolved fluorescentie spectroscopie benaderingen.

<table><tbody><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-aminoindole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>525022</td><td></td></tr><tr><td>acetonitrile</td><td>VWR</td><td>HiPerSolv CHROMANORM ULTRA for LC-MS, 83642</td><td>LC-MS grade vereist</td></tr><tr><td>agar-agar</td><td>Carl Roth</td><td>5210</td><td></td></tr><tr><td>ammonium molybdate ((NH4)2MoO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>277908</td><td></td></tr><tr><td>ammonium sulfate ((NH4)2SO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>ampicillin sodium salt</td><td>Carl Roth</td><td>K029</td><td></td></tr><tr><td>biotin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4501</td><td></td></tr><tr><td>bromofenolblauw</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>calciumchloride (CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>colloïdaal silica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Ludox HS-40, 420816</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brillant Blauw R 250</td><td>Carl Roth</td><td>3862</td><td></td></tr><tr><td>kopersulfaat (CuSO4)</td><td>Carl Roth</td><td>CP86.1</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Carl Roth</td><td>6780</td><td></td></tr><tr><td>di-natriumwaterstoffosfaat (Na2HPO4)</td><td>Carl Roth</td><td>X987</td><td></td></tr><tr><td>di-kaliumwaterstoffosfaat (K2HPO4)</td><td>Carl Roth</td><td>P749.1</td><td></td></tr><tr><td>1,4-dithiothreitol (DTT)</td><td>Carl Roth</td><td>6908</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025</td><td></td></tr><tr><td>ethanol</td><td>Carl Roth</td><td>9065.1</td><td></td></tr><tr><td>mierenzuur</td><td>VWR</td><td>HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS, 84865</td><td>LC-MS grade vereist</td></tr><tr><td>glycerol</td><td>Carl Roth</td><td>3783</td><td></td></tr><tr><td>imidazool</td><td>Carl Roth</td><td>X998</td><td></td></tr><tr><td>indole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3408</td><td></td></tr><tr><td>ijzer(II)chloride (FeCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>380024</td><td></td></tr><tr><td>isopropanol</td><td>Carl Roth</td><td>AE73.1</td><td></td></tr><tr><td>isopropyl &beta;-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>lysozym</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>magnesiumchloride (MgCl2)</td><td>Carl Roth</td><td>KK36.1</td><td></td></tr><tr><td>magnesiumsulfaat (MgSO4)</td><td>Carl Roth</td><td>8283.2</td><td></td></tr><tr><td>mangaanchloride (MnCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63535</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>Carl Roth</td><td>4227.3</td><td></td></tr><tr><td>kaliumchloride (KCl)</td><td>Carl Roth</td><td>6781.3</td><td></td></tr><tr><td>kaliumdiwaterstoffosfaat (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Carl Roth</td><td>7156</td><td></td></tr><tr><td>natriumchloride (NaCl)</td><td>Carl Roth</td><td>P029</td><td></td></tr><tr><td>natriumdiwaterstoffosfaat (NaH2PO4)</td><td>Carl Roth</td><td>T879</td><td></td></tr><tr><td>natriumdodecylsulfaat (NaC12H25SO4)</td><td>Carl Roth</td><td>0183</td><td></td></tr><tr><td>thiamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4625</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethaan (Tris)</td><td>Carl Roth</td><td>5429</td><td></td></tr><tr><td>Tris hydrochloride (Tris-HCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>857645</td><td></td></tr><tr><td>tryptone</td><td>Carl Roth</td><td>8952</td><td></td></tr><tr><td>gistextract</td><td>Carl Roth</td><td>2363</td><td></td></tr><tr><td>zinkchloride (ZnCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>229997</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>aminozuren</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-alanine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7627</td><td></td></tr><tr><td>L-arginine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5006</td><td></td></tr><tr><td>L-asparagine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8381</td><td></td></tr><tr><td>L-aspartic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0884</td><td></td></tr><tr><td>L-cysteine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3126</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2128</td><td></td></tr><tr><td>L-glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>L-histidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8000</td><td></td></tr><tr><td>L-isoleucine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2752</td><td></td></tr><tr><td>L-leucine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>L-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5501</td><td></td></tr><tr><td>L-methionine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9625</td><td></td></tr><tr><td>L-proline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0380</td><td></td></tr><tr><td>L-phenylalanine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2126</td><td></td></tr><tr><td>L-serine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4500</td><td></td></tr><tr><td>L-threonine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8625</td><td></td></tr><tr><td>L-tryptophan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0254</td><td></td></tr><tr><td>L-tyrosine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3754</td><td></td></tr><tr><td>L-valine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V0500</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Lab materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.45 &micro;m spuitfilter met PVDF-membraan</td><td>Carl Roth</td><td>CCY1.1</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL microcentrifugebuisjes</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>conische polystyreen (Falcon) buisjes, 50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Luer-Lock spuit 5 mL</td><td>Carl Roth</td><td>EP96.1</td><td></td></tr><tr><td>dialyse

engineering 'golden' fluorescentie door selectieve druk opneming van niet-canonieke aminozuren en eiwit analyse door massaspectrometrie en fluorescentie

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Fluorescerende eiwitten zijn fundamentele hulpmiddelen voor de biowetenschappen, met name voor fluorescentie microscopie van levende cellen. Terwijl wild-type en gemanipuleerde varianten van de groen fluorescente proteïne uit Aequorea victoria (avGFP), alsmede van andere diersoorten homologen cover al grote delen van het optische spectrum, blijft een spectrale kloof in de regio nabij-infrarood, voor welke avGFP gebaseerde fluorophores zijn niet beschikbaar. Red-verschoven fluorescente proteïne (FP) varianten zou aanzienlijk uitbreiden van de toolkit voor de spectrale randverwijdering van meerdere moleculaire soorten, maar de natuurlijk voorkomende rood-verschoven FPs afgeleid van koralen of zeeanemonen hebben lagere fluorescentie quantumrendement en inferieur foto-stabiliteit t.o.v. de avGFP varianten. Verdere manipulatie en de mogelijke uitbreiding van de chromofore van geconjugeerd systeem ten aanzien van de far-red spectrale regio wordt ook beperkt door het repertoire van 20 canonieke aminozuren voorgeschreven door de genetische code. Deze beperkingen wilt opheffen, kunnen synthetische biologie verder spectrale rood-shifting via inbrengen van niet-canonieke aminozuren in de chromofore triade. We beschrijven de toepassingvan SPI de varianten van de avGFP van de ingenieur met nieuwe spectrale eigenschappen. Eiwit expressie wordt uitgevoerd in een tryptofaan-auxotrofe E. coli stam en door groei media aan te vullen met geschikte indool precursoren. In de cellen, zijn deze precursoren geconverteerd naar de corresponderende tryptofaan-analogen en eiwitten ingelijfd door de ribosomal machine in reactie op UGG codonen. De vervanging van Trp-66 in de verbeterde "cyaan" variant van avGFP (ECFP) door een elektron-doneren 4-aminotryptophan resulteert in GdFP met een 108 nm Stokes shift en een maximale sterk rood-verschoven emissie (574 nm), terwijl het thermodynamisch stabieler dan zijn voorganger ECFP. Residu-specifieke opneming van de niet-canonieke aminozuur wordt geanalyseerd door de Spectrometrie van de massa. De spectroscopische eigenschappen van GdFP worden gekenmerkt door time-resolved Fluorescentiespectroscopie als één van de waardevolle toepassingen van genetisch gecodeerde bps in biowetenschappen.

Met behulp van de techniek van de opneming van de selectieve druk, kan Trp-66 in de trits chromofore van ECFP (en Trp-57, het alleen andere Trp residu in ECFP) worden vervangen door 4-amino-Trp, waardoor het genereren van de rood-verschoven GdFP met verschillende spectrale eigenschappen. Massaspectrometrie moet worden gebruikt om aan te tonen van de gewenste stoichiometrische integratie van de niet-canonieke aminozuur in het eiwit, met resultaten die worden weergegeven in Figuur 1. Daarna bieden we gegevens uit microscopie, UV-Vis Absorptie spectroscopie evenals steady-state en tijd - en golflengte-resolved Fluorescentiespectroscopie te karakteriseren van de eigenschappen van de GdFP fluorophore met een focus op de afhankelijkheid van de pH van de Spectra.
Om te bevestigen de uitwisseling van de twee Trp residuen in ECFP door 4-amino-Trp, wordt massaspectrometrische analyse uitgevoerd. Figuur 1 toont een representatieve deconvoluted ESI-MS spectrum van GdFP. Hoewel wild-type ECFP een massa berekende eiwit voor 28,283.9 Da na de rijping chromofore heeft, is de overeenkomstige massa van GdFP 28,313.9 Da. Het deconvoluted ESI-MS spectrum van GdFP vertoont een grote massa piek bij 28,314.1 ± 0,1 Da, die van de theoretische waarde door minder dan 10 ppm afwijkt. Wordt binnen het bereik van de gemiddelde nauwkeurigheid voor dit soort analyse25, dit bevestigt de opneming van de ncAA via SPI (experimentele waarde voor wild-type ECFP: 28,283.7 Da).
Figuur 2 toont confocal fluorescentie imaging microscopie (CFIM) beelden van bacteriële cellen uiten van EGFP, EYFP, ECFP en GdFP op resuspensie van bacteriën in PBS buffer. Alle beelden werden verworven op een microscoop voorzien van een UV objectieve en laser excitatie bij over dezelfde energie voor elk monster.
Figuur 3A geeft een overlay van CFIM beelden van E. coli bacteriën uiting van verschillende FPs met inbegrip van GdFP, altijd gecontroleerd met zeer vergelijkbaar excitatie energie (golflengten zoals in Figuur 2). Figuur 3B toont de chromofore structuren van de varianten van de FP komt te staan. Met betrekking tot de helderheid van de GdFP in vergelijking met ECFP (fluorescentie quantum opbrengst φ = 0,4), EGFP (φ = 0,6) en EYFP (φ = 0.6) het is belangrijk op te merken dat voor GdFP, een breder scala van de overname van de fluorescentie-licht (30 nm) werd gebruikt in tegenstelling tot 20 nm gebruikt voor alle andere spe cies, om aan te passen van de intensiteit van de afbeeldingen om gelijkaardige waarden. Met een iets lagere uitsterven coëfficiënt en een verminderde quantumrendement als gevolg van de unieke fotofysische eigenschappen, is de helderheid van de GdFP lager in vergelijking met de andere FPs komt te staan.
Het absorptiespectrum van ECFP (Figuur 3 c) heeft twee karakteristieke maxima op 434 nm en 452 nm. In tegenstelling, GdFP wordt gekenmerkt door een brede absorptie van rood-verschoven band met het maximum op 466 nm. De absorptie van EGFP is verder rood-verschoven naar 488 nm. Echter, als gevolg van de veel grotere Stokes-verschuiving van de GdFP (108 nm) in vergelijking met ECFP (41 nm) en EGFP (20 nm), het emissiespectrum van GdFP is het meest rode-verschoven van alle drie GFP derivaten hier onderzocht (figuur 3D). Terwijl de uitstoot van de fluorescentie van ECFP twee karakteristieke maxima op 475 toont nm en 505 nm, EGFP heeft een brede belangrijkste emissie band piek op 508 nm (λmax) met een lichte schouder bij 540 nm. De fluorescentie van GdFP blijkt bij ongeveer 565 nm (λmax.) (Afbeelding 3D). Het emissiespectrum bevat een kleine bijdrage te leveren van wild-type ECFP dat ook zichtbaar is als een kleine schouder naar 475 nm. Deze kleine ECFP-fractie wordt gesynthetiseerd voordat inductie tijdens de SPI-procedure, als beschreven33.
De 3E figuur toont de pH-afhankelijke veranderingen in het spectrum van de absorptie van GdFP. Voor een pH verandering van 8 tot en met 5, de maximale emissie verschuift iets naar de rode en een lichte verruiming van de absorptie-band wordt waargenomen. De vermindering van de amplitude van de absorptie is echter slechts ongeveer 10% tussen pH 8 en pH 5, waaruit blijkt dat de eigenschappen van de grondtoestand van het GdFP chromofore zeer zwak gewijzigd door pH.
De tijd opgelost fluorescentie emissie gecontroleerd door één foton tellen wordt weergegeven in Figuur 4. De curven van de verval gecontroleerd in de spectrale kanalen gecentreerd op 550 nm en 600 nm (figuur 4A) vertonen een iets snellere verval van de fluorescentie op 600 nm ten opzichte van het verval op 550 nm. De resultaten van een wereldwijde pasvorm van de fluorescentie decay krommen met twee exponentiële onderdelen resultaten in twee spectraal te onderscheiden fluorescentie decay componenten met tijd constanten van 1.0 ns en 3.3 ns (figuur 4C en D).
De uitstoot van de fluorescentie van GdFP afhankelijk sterk van pH, zoals het is typisch voor veel fluorescerende eiwit varianten van het GFP-familie. Figuur 4B vergelijkt de uitstoot van de fluorescentie van GdFP tussen pH 5 en pH 8, waaruit duidelijk een daling van de intensiteit van de fluorescentie bij een lagere pH, blijkt terwijl de spectrumkenmerken constant blijven.
De verval-geassocieerde spectra (DAS)39 van GdFP (figuur 4C en D) worden gekenmerkt door twee verschillende emissie bands. De bijdrage van de langzame 3.3 ns component is meer uitgesproken in het korte golflengtegebied rond 550 nm (60%) met kleine bijdrage van de snellere component (40%). Op 600 nm, beide componenten hebben over de dezelfde amplitude. Op een verschuiving van de pH 7 (figuur 4C) op een pH van 6 (Figuur 4 d), de spectrale kenmerken van de DAS nauwelijks veranderen en de tijd-constanten van de wereldwijde montage routine zijn ook hetzelfde (de nauwkeurigheid van de DAS tijd constanten is ongeveer ± 0,15 ns). Echter, het verschil in de absolute amplitudes van de twee componenten van de DAS is duidelijk herkenbaar, die volledig verantwoordelijk voor de amplitude van de uitstoot verlaagd fluorescentie op de dezelfde verschuiving van de pH in figuur 4B.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57017/57017fig1.jpg"> Figuur 1: vertegenwoordiger deconvoluted ESI-MS spectrum van GdFP. Het spectrum van de ESI-MS van GdFP (gouden kleur, vergrote perceel getoond als inzet) toont een belangrijkste piek bij 28314.1 Da (berekend van de waarde 28313.9 Da). Het spectrum voor wild-type ECFP wordt weergegeven in het zwart. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57017/57017fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57017/57017fig2.jpg"> Figuur 2: confocale fluorescentie microscopie beelden van bacteriële bevolking uiting van verschillende FOD. De volgende instellingen: golflengte werden gebruikt voor Beeldacquisitie: ECFP (λex = 457 nm, detectie: 461-480 nm), EGFP (λex = 488 nm, detectie: 495-515 nm), GDFP (λex = 476 nm, detectie: 560-590 nm), EYFP (λex = 514 nm, detectie: 520-530 nm). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57017/57017fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57017/57017fig3.jpg"> Figuur 3: spectrale eigenschappen van GdFP. (A) CFIM afbeelding van een mengsel van bacteriële cellen uiten van EGFP, ECFP en GdFP na de resuspensie van bacteriën in PBS buffer. (B) chromofoor structuren van GdFP (met 4-amino-Trp in plaats van residu 66), de ouderlijke ECFP (met Trp op positie 66) en EFGP (met Tyr op positie 66). (C) vergelijking voor de genormaliseerde absorptiespectra van GdFP, ECFP en EGFP, overwegende dat in (D), de genormaliseerde fluorescentie emissiespectrum van ECFP (excitatie op 430 nm) is in vergelijking met de fluorescentie emissie spectra van EGFP en GdFP (zowel enthousiast op 450 nm). (E) pH-afhankelijkheid van de Absorptiespectra (genormaliseerd absorptie bij 280 nm). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57017/57017fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57017/57017fig4.jpg"> Figuur 4: Time-resolved fluorescentie van GdFP. (A) fluorescentie verval van GdFP gevolgd door tijd - en golflengte-opgelost één foton tellen in de spectrale kanalen gecentreerd op 550 nm en 600 nm (± 12,5 nm) na excitatie met 470 nm laserpulsen. De instrumentale reactie-functie (IRF) bevat informatie over de resolutie van de tijd van de gebruikte setup. (B) variant van het emissiespectrum van GdFP afhankelijk van de pH (excitatie op 460 nm). (C, D) Verval-geassocieerde spectra (DAS) van GdFP bij pH 7 (C) en pH 6 (D) bepaald nadat deconvolutie van tijd - en golflengte-resolved fluorescentie vervalt en globale montage van de vervalt in alle kanalen door een algemene set van twee exponentiële functies met gekoppelde tijd-constanten zijn. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57017/57017fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57017/57017fig5.jpg"> Figuur 5: structuren van de intramoleculaire gratis overdracht van ECFP (zwart) en GdFP (goud)-chromophores. De toename van de omvang van het systeem van de chromofore door de goede elektronendonor van een amino groep als onderdeel van de ncAA kan de vorming van meer mesomeric structuren tot stabilisatie van de resonantie van de geëxciteerde toestand. De verbindingspunten aan de steiger van de FP worden weergegeven als semicircles. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57017/57017fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Stockoplossing</td>
			<td>concentratie, oplosmiddel</td>
			<td colspan="2">Opmerking</td>
		</tr>
<tr>
<td>20% D-glucose</td>
			<td>200 g/L D-glucose in ddH2O</td>
			<td colspan="2">steriliseren door filtratie door een 0,45 µm porie grootte spuit filter</td>
		</tr>
<tr>
<td>indool</td>
			<td>50 mM in isopropanol</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td>4-amino-indole</td>
			<td>50 mM in 20% ethanol (20 mL ethanol in een eindvolume van 100 mL gevuld met ddH2O)</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td>IPTG</td>
			<td>1 M in ddH2O</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td>L-tryptofaan</td>
			<td>15 mM opgelost in ddH2O met behulp van 1 M HCl (toevoegen van HCl ontkleuring onder roeren tot poeder dissoved is)</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td>lysozym</td>
			<td>50 mg/mL in ddH2O</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td>DNase ik</td>
			<td>1 mg/mL in ddH2O</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td>RNase A</td>
			<td>1 mg/mL in ddH2O</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td>Amp100</td>
			<td>100 mg/mL ampicilline in ddH2O</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td>natrium-dodecylsulfate (SDS)</td>
			<td>200 g/L in ddH2O</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td>ammoniumsulfaat ((NH4)2SO4)</td>
			<td>1 M in ddH2O</td>
			<td colspan="2">steriliseren in autoclaaf</td>
		</tr>
<tr>
<td>kalium Natriumdiwaterstoffosfaat fosfaat (KH2PO4)</td>
			<td>1 M in ddH2O</td>
			<td colspan="2">steriliseren in autoclaaf</td>
		</tr>
<tr>
<td>di-kalium waterstof fosfaat (K2HPO4)</td>
			<td>1 M in ddH2O</td>
			<td colspan="2">steriliseren in autoclaaf</td>
		</tr>
<tr>
<td>magnesium-sulfaat (MgSO4)</td>
			<td>1 M in ddH2O</td>
			<td colspan="2">steriliseren in autoclaaf</td>
		</tr>
<tr>
<td>D-glucose</td>
			<td>1 M in ddH2O</td>
			<td colspan="2">steriliseren door filtratie door een 0,45 µm porie grootte spuit filter</td>
		</tr>
<tr>
<td>natriumchloride (NaCl)</td>
			<td>5 M in ddH2O</td>
			<td colspan="2">steriliseren in autoclaaf</td>
		</tr>
<tr>
<td>calciumchloride (CaCl2)</td>
			<td>1 g/L</td>
			<td colspan="2">steriliseren door filtratie door een 0,45 µm porie grootte spuit filter</td>
		</tr>
<tr>
<td>ijzer(II) chloride (FeCl2)</td>
			<td>1 g/L</td>
			<td colspan="2">steriliseren door filtratie door een 0,45 µm porie grootte spuit filter</td>
		</tr>
<tr>
<td>Thiamine</td>
			<td>10 g/L</td>
			<td colspan="2">steriliseren door filtratie door een 0,45 µm porie grootte spuit filter</td>
		</tr>
<tr>
<td>Biotine</td>
			<td>10 g/L</td>
			<td colspan="2">steriliseren door filtratie door een 0,45 µm porie grootte spuit filter</td>
		</tr>
<tr>
<td>mix van sporenelementen</td>
			<td>kopersulfaat CuSO4, zink chloride (ZnCl2), mangaan chloride (MnCl2), ammoniummolybdaat ((NH4)2MoO4); elke 1 mg/L in ddH2O</td>
			<td colspan="2">steriliseren door filtratie door een 0,45 µm porie grootte spuit filter</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">19 aminozuren mix</td>
			<td colspan="3">1.) Los 0,5 g L-fenylalanine en 0,5 g L-tyrosine in 100 ml ddH2O met dropwise toevoeging van 1 M HCl onder roeren tot poeder wordt ontbonden.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">2.) Weeg 0,5 g van elk van de resterende L-amino zuren (met uitzondering van L-tryptofaan). Meng met 22 mL fo 1 M KH2PO4 en 48 mL 1 M K2HPO4. DdH2O aan ongeveer 800 mL toevoegen. Roer de oplossing pas duidelijk.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">3.) toevoegen de opgeloste L-fenylalanine en L-tyrosine uit stap 1). en pas het volume aan 1 L met ddH2O.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">4.) Sterilize het aminozuur mengsel door vacuüm filtratie met een fles top filter eenheid.</td>
		</tr>
</tbody></table><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Buffers en Media</td>
			<td colspan="3">Samenstelling/voorbereiding</td>
		</tr>
<tr>
<td>SDS laden kleurstof buffer, 5 x geconcentreerd</td>
			<td colspan="3">0,25 M Tris pH 6.8, 50% v/v glycerol, 0,25% w/v broomfenolblauw, 0.5 M didhiothreitol (DTT; u kunt ook β-mercaptoethanol 5%), 10% w/v natrium-dodecylsulfate (SDS)</td>
		</tr>
<tr>
<td>bindende buffer</td>
			<td colspan="3">50 mM natrium dihydrogenphosphate (NaH2PO4), 500 mM NaCl, 10 mM imidazool, pH 8</td>
		</tr>
<tr>
<td>elutie buffer</td>
			<td colspan="3">50 mM natrium dihydrogenphosphate (NaH2PO4), 500 mM NaCl, 250 mM imidazool, pH 8</td>
		</tr>
<tr>
<td>dialyse buffer</td>
			<td colspan="3">50 mM natrium dihydrogenphosphate (NaH2PO4), 150 mM NaCl, 100 mL/L glycerol, pH 8</td>
		</tr>
<tr>
<td>MS buffer</td>
			<td colspan="3">10 mM Tris-HCl, pH 8</td>
		</tr>
<tr>
<td>nieuwe minimaal medium met 19 L-amino zuren met uitzondering van L-tryptofaan (NMM19)</td>
			<td colspan="3">Vermeng alle voorraad oplossingen om het verkrijgen van de volgende eindconcentraties: 7.5 mM (NH4)2SO4, 1.7 mM NaCl, 22 mM KH2PO4, 50 mM K2HPO4, 1 mM MgSO4, 20 mM D-glucose, 50 mg/L 19 aminozuren mix, 1 µg/L CaCl21 µg/L FeCl2, 10 µg/L thiamine, Biotine 10 mg/L, 0,01 mg/L sporenelementen mix</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="6">LB medium</td>
			<td colspan="3">Samenstelling: 10 g/L trypton, 5 g/L gistextract, 10 g/L NaCl, pH 7,0 in ddH2O</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">Bereiding:</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">1.) Weeg uit trypton 50 g 25 g gistextract, 5 g NaCl in een 1 L-fles.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">2.) toevoegen ddH2O tot ~ 800 mL en los onderdelen onder roeren.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">3.) meten van pH en pas op een pH van 7 door dropwise toevoeging van 1 M HCl of 1 M NaOH, indien nodig. Toevoegen van ddH2O tot 1 L.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">4.) Sterilize in autoclaaf, Controleer volume verlies daarna en toevoegen van steriele ddH2O te compenseren indien nodig. Bewaren bij 4 ° C tot gebruik.</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="8">LB agar platen</td>
			<td colspan="3">Samenstelling: 10 g/L trypton, 5 g/L gistextract, 10 g/L NaCl, 15 g/L agar-agar, pH 7.0 in ddH2O</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">Bereiding:</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">1.) Weeg uit trypton 50 g 25 g gistextract, 5 g NaCl, 7,5 g agar-agar in een 1 L-fles.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">2.) toevoegen ddH2O tot 500 mL en los componenten onder roeren.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">3.) meten van pH en pas op een pH van 7 door dropwise toevoeging van 1 M HCl of 1 M NaOH, indien nodig. Toevoegen van ddH2O tot 1 L.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">4.) Sterilize in autoclaaf, Controleer volume verlies daarna en toevoegen van steriele ddH2O te vergoeden, indien nodig. (Opmerking: LB agar kan worden achtergelaten bij 4 ° C tot gebruik voor bereiding van LB agar platen. Zorgvuldig smelten gestolde agar met behulp van een magnetron)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">5.) wanneer de oplossing is nog steeds warm (30-40 ° C), ampicilline toevoegen om een eindconcentratie van 100 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">6.) pour ongeveer 15 mL van de vloeistof uit stap 5.) in een steriele 10 cm petrischaal onder steriele omstandigheden. Wanneer de agar is gestold, kunnen platen worden opgeslagen voor 1 week bij 4 ° C tot gebruik.</td>
		</tr>
<tr>
<td>fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)</td>
			<td colspan="3">Samenstelling: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM nb2HPO4met 1,8 mM KH2PO4, 1 mM CaCl2, 0.5 mM MgCl2, pH 7. Steriliseren in autoclaaf of filtratie.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Stock oplossing en buffer.

Synthetische biologie waardoor de engineering van eiwitten met ongekende eigenschappen met behulp van het co-translational inbrengen van niet-canonieke aminozuren. Hier, presenteerden we hoe een spectraal rood-verschoven variant van een GFP-type fluorophore met roman fluorescentie spectroscopische eigenschappen, genoemd "goud" fluorescent proteïne (GdFP), wordt geproduceerd in E. coli via selectieve druk opneming (SPI).

Engineering 'Golden' fluorescentie door selectieve druk opneming van niet-canonieke aminozuren en eiwit analyse door massaspectrometrie en fluorescentie

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and ...

Het doel van dit experiment is om een canonieke aminozuur te vervangen door een niet-canoniek aminozuur voor recombinante eiwitproductie door middel van selectieve druk incorporatie om het nieuwe goudgefluorescerende eiwit te produceren. De methode van selectieve druk incorporatie is bedoeld om eiwitten met nieuwe chemische eigenschappen te produceren. Dit is vooral nuttig bij het proberen te begrijpen of te ontwerpen van eiwitfunctie.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het relatief eenvoudig uit te voeren is omdat het vergelijkbaar is met gebruikelijke recombinante eiwitproductie. Tijd- en golflengte-gecorreleerde fluorescentie is nuttig om de opgewonden toestanddynamica van het gemodificeerde eiwit te onderzoeken, wat op zijn beurt het gemakkelijker maakt om de invloed van het niet-canonieke aminozuur dat in het chromofoor is geïntroduceerd, op de optische eigenschappen te begrijpen. SPI kan in principe worden toegepast op elke eiwitproductieinstelling waarvoor auxotrofe stammen en chemisch gedefinieerde media beschikbaar zijn.Dit omvat ook andere bacteriestammen en zoogdiercelcultuur. Het timing en de opstelling van expressiecondities zijn cruciaal omdat het verplicht is om de productie van het niet-gemodificeerde wild-type eiwit te onderdrukken. Daarom moeten bepaalde parameters zoals de temperatuur, de inductietijd of de samenstelling van het kweekmedium worden geoptimaliseerd.We kregen voor het eerst het idee voor deze methode na initiële studies van eiwitextract met methyl-bevattende aminozuren zoals selenomethionine. Het demonstreren van de procedure zal worden gedaan door Almut Pelzer, een student uit mijn laboratorium. Om deze procedure te beginnen, transformeer je auxotrofe E.coli cellen met tryptofaan met het expressieplasmide voor ECFP.Gebruik een enkele kolonie om een precultuur van vijf milliliter LB-medium gesupplementeerd met ampicilline in een kweekbuis te inoculeren. Incuberen overnacht bij 37 graden Celsius en 200 rpm. De volgende dag, inoculeer 100 milliliter gesupplementeerd NMM19-medium met behulp van een milliliter van de overnachtelijke cultuur in een liter Erlenmeyer kolf.Bekijk vervolgens de cultuur overnacht in een orbitale shaker bij 200 rpm en 30 graden Celsius. De volgende dag meet u de optische dichtheid bij 600 nanometer elke 30 minuten totdat de waarde minder dan 0,05 verandert over 30 minuten. Centrifugeer vervolgens de cultuur bij 5.000 keer g en vier graden Celsius gedurende 10 minuten om de bacteriecellen te oogsten.Gooi het supernatant weg door te decanteren. Resuspendeer de cellen in NMM19-medium gesupplementeerd met ampicilline tot een totaal volume van 100 milliliter. Breng deze suspensie terug naar dezelfde Erlenmeyer kolf.Voeg 4-amino-indole toe tot een eindconcentratie van één millimolair. Incuberen in een orbitale shaker gedurende 30 minuten bij 30 graden Celsius en 200 rpm. Voeg na 30 minuten IPTG toe aan de cultuur tot een eindconcentratie van 0,5 millimolair om doelgenexpressie te induceren.Incuberen overnacht in een orbitale shaker bij 30 graden Celsius en 200 rpm. De volgende dag oogst u de bacteriecellen door centrifugatie bij 5.000 keer g en vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Gooi het supernatant weg door te decanteren.Bevriest de celpellet op min 20 graden Celsius of min 80 graden Celsius totdat u klaar bent om doelwiteiwitzuivering uit te voeren. Bereid eerst het bacteriële cellysaat voor zoals beschreven in het tekstprotocol. Na het voorbereiden van de chromatografiekolom volgens de instructies van de fabrikant, gebruikt u bindbuffer om de geïmmobiliseerde metaalionenaffiniteitschromatografiekolom te gelijkstellen.Laad het lysaat op de kolom tot voltooiing. Let op het goudkleurige eiwit dat aan het chromatografiehars is gebonden. Was de kolom met bindbuffer.Elute vervolgens het doelwiteiwit met behulp van elutiebuffer. Verzamel en pool eventuele eluteerfracties die goudgefluorescerend eiwit bevatten, wat kan worden geïdentificeerd door de zichtbare gouden kleur. Bereid vervolgens een dialysemembraan met een moleculair gewichtsdoorlaat tussen 5.000 en 10.000 volgens de instructies van de fabrikant.Dialyseer een monster van één milliliter tegen minimaal 100 milliliter buffer gedurende minimaal twee uur. Gebruik MS-buffer om het eiwitmonster te verdunnen tot 0,1 milligram per milliliter, zodat het eindvolume 80 microliter is. Pipetteer voorzichtig om te mengen.Breng de oplossing over in een MS-autosamplervial met glazen inzetstuk en sluit deze met een dop. Sla de vial om luchtbellen te verwijderen. Bereid vervolgens een blanco bevattende MS-buffer in een tweede vial.Plaats beide vials in de HPLC-autosampler. Bereid vervolgens het MS-instrument volgens de instructies van de fabrikant voor en kalibreer het. Stel het autosamplerinjectievolume in op vijf microliter voor de hoogwaardige vloeistofchromatografie gekoppelde elektrosprayionisatie tijd-van-vlucht massaspectrometrie methode.Maak een werklijst voor de blanco run, gevolgd door de GdFP-steekproefrun. Wijs het injectievolume, de overeenkomstige autosamplervialposities toe en voer de werklijst uit. Om te beginnen, bereidt u een goudgefluorescerende eiwit-oplossing en de detector voor tijd- en golflengte-gecorreleerde enkele foton tellen zoals beschreven in het tekstprotocol.Met behulp van enkele foton tellende software, verwerft u fluorescentie emissie bij een tellersnelheid van ongeveer 200.000 fotonen per seconde tot ongeveer 10.000 tellingen zijn opgehoopt in de aanschaf maximum van de fluorescentie vervalcurven. Vervang vervolgens de steekproefcuvet met een een-centimeter kwartscuvet gevuld met colloïdale silica in PBS-buffer. Haal de laserfilter eruit en pas de rooster aan voor de aanschaf van 470-nanometer fotonen in het centrale kanaal van de detector.Verwerf vervolgens de instrumentele responsfunctie tot ongeveer 10.000 tellingen zijn opgehoopt in de emissie maximum. Converteer, pas aan en plot de resulterende gegevens zoals beschreven in het tekstprotocol om de vervalgeassocieerde spectra te verkrijgen, die de afhankelijkheid van de fluorescentie vervaltijden op de emissiegolflengte vertegenwoordigen

engineering-golden-fluorescence-selective-pressure-incorporation-non

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Een fundamentele zoektocht in de celbiologie is het definiëren van de mechanismen die de identiteit van de organellen die eukaryotische cellen te maken ten grondslag liggen. Hier stellen we een methode om de genen die verantwoordelijk zijn voor de morfologische en functionele integriteit van plantaardige organellen met behulp van fluorescentie microscopie en next-generation sequencing tools te identificeren.

Fluorescentie-microscopie Screening en next-generation sequencing: Handige hulpmiddelen voor de identificatie van genen betrokken bij organel Integriteit

In this video, we demonstrate a fluorescence-detection size-exclusion chromatography technique to screen for green fluorescent protein (GFP)-fused membrane protein stability in Escherichia coli following detergent solubilization. Proteins exhibiting a symmetrical peak in the size-exclusion profile with little or no free GFP indicate purified proteins with minimum degradation and aggregation, which can subsequently be selected for structure-function analysis.

Fluorescence-Detection Size-Exclusion Chromatography: A Technique to Identify the Integrity of Fluorescent Membrane Proteins upon Detergent Solubilization

In this video, we describe the fluorescence anisotropy technique to study the interactions between the fluorophore-tagged Shwachman-diamond syndrome (SBDS) protein and the elongation factor-like 1 GTPase (EFL1). On incubating SBDS proteins with gradually increasing concentrations of EFL1, a steady increase in anisotropy is observed, indicating a successful interaction between the two proteins.

Fluorescence Anisotropy-Based Detection of Protein-Protein Interactions

Een gestroomlijnde benadering screening op de expressie van recombinant membraaneiwitten in Escherichia coli gebaseerd op fusie met groen fluorescent proteïne gepresenteerd.

Green Fluorescent Protein gebaseerd Expression Screening van membraaneiwitten in<em&gt; Escherichia coli</em

Een gebruiksvriendelijk, celvrij expressieprotocol voor de residurespecifieke incorporatie van niet-canonieke aminozuuranalogen in eiwitten, inclusief downstream-analyse, wordt gepresenteerd voor medisch, farmaceutisch, structureel en functioneel onderzoek.

Residu-specifieke Opneming van noncanonical aminozuren in Eiwitten Model behulp van een<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Cell-free transcriptie-vertaalsysteem

Eiwit interacties vormen de kern van de functie van een cel. Calorimetrische en spectroscopische technieken worden gewoonlijk gebruikt om ze te karakteriseren. Hier beschrijven we fluorescentie anisotropie als middel om de interactie tussen het eiwit gemuteerd in de Shwachman-Diamond Syndroom (SBDS) en elongatiefactor-1 achtige GTPase (EFL1) te bestuderen.

Fluorescentie anisotropie als een instrument om eiwit-eiwit interacties te bestuderen

Een facile fluorescentie-bepaling is bedoeld om te evalueren van de doeltreffendheid van amino-acyl-tRNA-synthetase/tRNA paren integratie van niet-canonieke aminozuren (ncAAs) in eiwitten uitgedrukt in zoogdiercellen. De toepassing van ncAAs op het bestuderen van de G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCRs) wordt beschreven, met inbegrip van foto-crosslinking toewijzing van bindende sites en bioorthogonal GPCR etiketten op levende cellen.

Optimaliseren van de genetische opneming van chemische sondes in GPCRs voor foto-crosslinking kartering en Bioorthogonal scheikunde in levende cellen van zoogdieren

Dit artikel beschrijft protocollen voor de beoordeling van het effect van fluorescente proteïnen op de aggregatie en toxiciteit van de expansie van de misfolded polyglutamine voor de snelle evaluatie van een nieuw genfunctieonderzoek TL proteïne in het kader van fluorescerende verslaggevers.

Effect van fluorescente proteïnen op Fusion Partners Polyglutamine Toxicity Tests met gist

CENP-A ubiquitylation is an important requirement for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability. Hier beschrijven we massaspectrometrieanalyse om alomtegenwoordigheid van EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A) eiwit te identificeren.

Massaspectrometrieanalyse om alomtegenwoordigheid van EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A) te identificeren

Om de beperkingen van klassieke site-directed mutagenese te overwinnen, werden proline analogen met specifieke modificaties opgenomen in verschillende fluorescerende eiwitten. We laten zien hoe de vervanging van waterstof door fluor of van de enkele door dubbele bindingen in prolineresiduen ("moleculaire chirurgie") fundamentele eiwiteigenschappen beïnvloedt, inclusief hun vouwing en interactie met licht.

Residu-specifieke uitwisseling van Proline door Proline-analogen in fluorescerende eiwitten: hoe "moleculaire chirurgie" van de ruggengraat de vouwing en stabiliteit beïnvloedt

Dit artikel biedt een eenvoudig en duidelijk protocol om Salmonella-uitgescheiden effectoren te labelen met behulp van genetische code-uitbreiding (GCE) site-specifiek en de subcellulaire lokalisatie van uitgescheiden eiwitten in HeLa-cellen in beeld te brengen met behulp van directe stochastische optische reconstructiemicroscopie (dSTORM)...

Superresolutiebeeldvorming van bacteriële uitgescheiden eiwitten met behulp van genetische code-uitbreiding

Ontdek hoe je een goudkleurig fluorescent eiwit produceert via selectieve druk opneming van niet-canonieke aminozuren in E. coli. Deze methode biedt nieuwe mogelijkheden voor synthetische biologie en eiwitengineering.

Engineering Golden fluorescentie door selectieve druk opneming van niet-canonieke aminozuren en eiwit analyse door massaspectrometrie en fluorescentie (Video) | JoVE Journal

Engineering 'Golden' fluorescentie door selectieve druk opneming van niet-canonieke aminozuren en eiwit analyse door massaspectrometrie en fluorescentie

Meer video's verkennen