Engineering 'Golden' fluorescentie door selectieve druk opneming van niet-canonieke aminozuren en eiwit analyse door massaspectrometrie en fluorescentie

Het doel van dit experiment is om een canonieke aminozuur te vervangen door een niet-canoniek aminozuur voor recombinante eiwitproductie door middel van selectieve druk incorporatie om het nieuwe goudgefluorescerende eiwit te produceren. De methode van selectieve druk incorporatie is bedoeld om eiwitten met nieuwe chemische eigenschappen te produceren. Dit is vooral nuttig bij het proberen te begrijpen of te ontwerpen van eiwitfunctie.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het relatief eenvoudig uit te voeren is omdat het vergelijkbaar is met gebruikelijke recombinante eiwitproductie. Tijd- en golflengte-gecorreleerde fluorescentie is nuttig om de opgewonden toestanddynamica van het gemodificeerde eiwit te onderzoeken, wat op zijn beurt het gemakkelijker maakt om de invloed van het niet-canonieke aminozuur dat in het chromofoor is geïntroduceerd, op de optische eigenschappen te begrijpen. SPI kan in principe worden toegepast op elke eiwitproductieinstelling waarvoor auxotrofe stammen en chemisch gedefinieerde media beschikbaar zijn.

Dit omvat ook andere bacteriestammen en zoogdiercelcultuur. Het timing en de opstelling van expressiecondities zijn cruciaal omdat het verplicht is om de productie van het niet-gemodificeerde wild-type eiwit te onderdrukken. Daarom moeten bepaalde parameters zoals de temperatuur, de inductietijd of de samenstelling van het kweekmedium worden geoptimaliseerd.

We kregen voor het eerst het idee voor deze methode na initiële studies van eiwitextract met methyl-bevattende aminozuren zoals selenomethionine. Het demonstreren van de procedure zal worden gedaan door Almut Pelzer, een student uit mijn laboratorium. Om deze procedure te beginnen, transformeer je auxotrofe E.coli cellen met tryptofaan met het expressieplasmide voor ECFP.

Gebruik een enkele kolonie om een precultuur van vijf milliliter LB-medium gesupplementeerd met ampicilline in een kweekbuis te inoculeren. Incuberen overnacht bij 37 graden Celsius en 200 rpm. De volgende dag, inoculeer 100 milliliter gesupplementeerd NMM19-medium met behulp van een milliliter van de overnachtelijke cultuur in een liter Erlenmeyer kolf.

Bekijk vervolgens de cultuur overnacht in een orbitale shaker bij 200 rpm en 30 graden Celsius. De volgende dag meet u de optische dichtheid bij 600 nanometer elke 30 minuten totdat de waarde minder dan 0,05 verandert over 30 minuten. Centrifugeer vervolgens de cultuur bij 5.000 keer g en vier graden Celsius gedurende 10 minuten om de bacteriecellen te oogsten.

Gooi het supernatant weg door te decanteren. Resuspendeer de cellen in NMM19-medium gesupplementeerd met ampicilline tot een totaal volume van 100 milliliter. Breng deze suspensie terug naar dezelfde Erlenmeyer kolf.

Voeg 4-amino-indole toe tot een eindconcentratie van één millimolair. Incuberen in een orbitale shaker gedurende 30 minuten bij 30 graden Celsius en 200 rpm. Voeg na 30 minuten IPTG toe aan de cultuur tot een eindconcentratie van 0,5 millimolair om doelgenexpressie te induceren.

Incuberen overnacht in een orbitale shaker bij 30 graden Celsius en 200 rpm. De volgende dag oogst u de bacteriecellen door centrifugatie bij 5.000 keer g en vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Gooi het supernatant weg door te decanteren.

Bevriest de celpellet op min 20 graden Celsius of min 80 graden Celsius totdat u klaar bent om doelwiteiwitzuivering uit te voeren. Bereid eerst het bacteriële cellysaat voor zoals beschreven in het tekstprotocol. Na het voorbereiden van de chromatografiekolom volgens de instructies van de fabrikant, gebruikt u bindbuffer om de geïmmobiliseerde metaalionenaffiniteitschromatografiekolom te gelijkstellen.

Laad het lysaat op de kolom tot voltooiing. Let op het goudkleurige eiwit dat aan het chromatografiehars is gebonden. Was de kolom met bindbuffer.

Elute vervolgens het doelwiteiwit met behulp van elutiebuffer. Verzamel en pool eventuele eluteerfracties die goudgefluorescerend eiwit bevatten, wat kan worden geïdentificeerd door de zichtbare gouden kleur. Bereid vervolgens een dialysemembraan met een moleculair gewichtsdoorlaat tussen 5.000 en 10.000 volgens de instructies van de fabrikant.

Dialyseer een monster van één milliliter tegen minimaal 100 milliliter buffer gedurende minimaal twee uur. Gebruik MS-buffer om het eiwitmonster te verdunnen tot 0,1 milligram per milliliter, zodat het eindvolume 80 microliter is. Pipetteer voorzichtig om te mengen.

Breng de oplossing over in een MS-autosamplervial met glazen inzetstuk en sluit deze met een dop. Sla de vial om luchtbellen te verwijderen. Bereid vervolgens een blanco bevattende MS-buffer in een tweede vial.

Plaats beide vials in de HPLC-autosampler. Bereid vervolgens het MS-instrument volgens de instructies van de fabrikant voor en kalibreer het. Stel het autosamplerinjectievolume in op vijf microliter voor de hoogwaardige vloeistofchromatografie gekoppelde elektrosprayionisatie tijd-van-vlucht massaspectrometrie methode.

Maak een werklijst voor de blanco run, gevolgd door de GdFP-steekproefrun. Wijs het injectievolume, de overeenkomstige autosamplervialposities toe en voer de werklijst uit. Om te beginnen, bereidt u een goudgefluorescerende eiwit-oplossing en de detector voor tijd- en golflengte-gecorreleerde enkele foton tellen zoals beschreven in het tekstprotocol.

Met behulp van enkele foton tellende software, verwerft u fluorescentie emissie bij een tellersnelheid van ongeveer 200.000 fotonen per seconde tot ongeveer 10.000 tellingen zijn opgehoopt in de aanschaf maximum van de fluorescentie vervalcurven. Vervang vervolgens de steekproefcuvet met een een-centimeter kwartscuvet gevuld met colloïdale silica in PBS-buffer. Haal de laserfilter eruit en pas de rooster aan voor de aanschaf van 470-nanometer fotonen in het centrale kanaal van de detector.

Verwerf vervolgens de instrumentele responsfunctie tot ongeveer 10.000 tellingen zijn opgehoopt in de emissie maximum. Converteer, pas aan en plot de resulterende gegevens zoals beschreven in het tekstprotocol om de vervalgeassocieerde spectra te verkrijgen, die de afhankelijkheid van de fluorescentie vervaltijden op de emissiegolflengte vertegenwoordigen