Name: Productie en zuivering van Baculovirus voor toepassing van de gentherapie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 11 s
Description: Leer baculovirus produceren en zuiveren met heparine-affiniteitschromatografie en ultracentrifugatie voor gentherapie-toepassingen. Deze methode elimineert celdeeltjes en eiwitten voor veilige in vivo gentransfer.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk wordt gedeeltelijk ondersteund door de Start-Up financiering uit Cincinnati Children's Research Foundation (CCRF) voor M.N. en innovatieve Core Grant (ICG) ondersteund door het National Center for Advancing translationeel Wetenschappen van de National Institutes of Health onder Award nummer UL1 TR001425. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de National Institutes of Health.

Zie Figuur 1 ter een illustratie samenvatten van het protocol.
1. de zuivering van Baculovirus plasmide DNA
<ol><li>Groeien bacteriecultuur met baculoviral plasmide DNA (bacmid)14 in 200 mL van de pond-Bouillon met antibiotica; kanamycine (50 µg/mL), tetracycline (10 µg/mL) en gentamycine (7 µg/mL), gedurende 16 uur bij 37 ° C op een roteerschudapparaat omgeving op 300 rpm.</li>
	<li>Zuiveren van de bacmid van DNA van de bacteriële cultuur met behulp van standaard alkaline lysis protocol15, en de bacmid in de buffer TE ontbinden.</li>
</ol>2. productie van Baculovirus
<ol><li>Cultuur Sf9 cellen in een roteerschudapparaat incubator bij 135 rpm en 28 ° C in een polycarbonaat conische kolf met insect serumvrij cultuurmedium1,2,3. Opmerking: Als Sf9 cellen zijn ontdooid uit bevroren voorraad, toestaan ten minste twee weken voor de cellen te herstellen en voer de exponentiële fase van groei.</li>
	<li>Sf9 cellen geoogst in exponentiële fase van groei met een hemocytometer na kleuring met Trypan blauw tellen. 1 x 106 Sf9 levensvatbare cellen per putje in een 6-well Weefselkweek behandeld plaat in 2 mL zuiver medium zaad. Laat de cel te voegen gedurende 1 uur bij 28 ° C in een broedstoof.</li>
	<li>Vervang het groeimedium met 1 mL serumvrij unsupplemented Grace insect kweekmedium.</li>
	<li>Transfect de bacmid van DNA in de cellen van de Sf9 met behulp van insecten cel transfectiereagens.<ol>
<li>Mix 8 µL insect cel transfectiereagens met 100 µL van Grace Insect medium.</li>
		<li>Verdun 2 µg bacmid DNA in 100 µL van unsupplemented insecten medium en meng zachtjes door vortexing.</li>
		<li>De verdunde DNA te combineren met de verdunde insect cel transfectiereagens, en meng voorzichtig. Incubeer gedurende 15 tot 30 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Voeg het mengsel van de DNA-lipide ontkleuring op de cellen. Incubeer bij 28 ° C in een incubator voor ongeveer 5 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>De transfectie mengsel uit de cellen te verwijderen en de cellen met 2 mL PBS wassen.</li>
	<li>Voeg toe 2 mL insect kweekmedium en cultuur bij 28 ° C in een broedstoof blijven zonder het wijzigen van de media. Opmerking: Als de bacmid een fluorescente proteïne bevat, kan haar expressie in cellen 48u na transfectie worden gedetecteerd. Baculovirus is geproduceerd door transfected cellen van de Sf9 en uitgescheiden in het kweekmedium die vervolgens de untransfected cellen infecteert. De gehele celpopulatie wordt geïnfecteerd met baculovirus in 5 dagen en toont tekenen van virale infectie, ook wel genoemd cytopathogeen effect. Deze omvatten verhoogde cel diameter, vacuolen/korrels in het cytoplasma, stopzetting van de celgroei en dode of lysed cellen aanwezig in celkweek. Echter, als de efficiëntie van de transfectie of infectie niet optimaal is, de cultuur kan niet tonen een duidelijk cytopathogeen effect. De cytopathogeen effect kan worden gevisualiseerd met een omgekeerde fase Microscoop op 200-400 X vergroting. Baculovirus geïnfecteerde cel kan worden gedetecteerd door de kleuring met anti-gp64 antistof11.</li>
	<li>Oogst baculovirus supernatant 5 dagen na de transfectie en label als de P1 virus voorraad.</li>
	<li>Bewaar het supernatant, baculovirus die lichtgevoelig, in het donker met 0,5% bovien serumalbumine (BSA) in PBS. Bewaren bij 4 ° C voor de korte termijn (tot 90 dagen) of bij-80 ° C voor de lange termijn.</li>
	<li>Zaad 6 × 106 Sf9 cellen in een 10-cm Weefselkweek behandeld plaat in 10 mL insect kweekmedium. 1 mL van de initiële baculovirus supernatant (P1) aan de cellen toevoegen.</li>
	<li>Oogst baculovirus supernatant (P2) bij 5th dag na infectie.</li>
	<li>Zaad 50 mL Sf9 cellen (3 x 106 cellen/mL) in schorsing cultuur in insect kweekmedium in een 250 mL polycarbonaat conische kolf en plaats de kolf in een incubator rondschudapparaat. Voeg 2 mL P2 voorraad naar de cellen en schudden bij 135 rpm met behoud van een constante temperatuur van 28 ° C. Opmerking: Drie of vier dagen na de infectie, zal de hele Sf9-celpopulatie cytopathogeen effect, dat een indicatie van de hoge-titer baculovirus productie is tonen.</li>
	<li>Sequentieel versterken het supernatant baculovirus totdat het gewenste volume is bereikt (P3, P4,...) door het verhogen van 10 naar 50-fold volume van celcultuur in elke latere infectie. Opmerking: P3 is de 3rd ronde van infectie in welke 500 mL tot 1 L van de Sf9 cultuur van de cel kan worden besmet met 10 tot 20 mL P2 baculovirus supernatant; P4 is de 4th ronde van infectie in welke 5 tot 10 L van de Sf9 cultuur van de cel kan worden besmet met 100 tot 200 mL van het supernatans dat P3 baculovirus, enzovoort. Typisch, Sf9 cellen worden overgeënt op 3 × 106 cellen/mL in serumvrij insect voedingsbodems.</li>
	<li>Centrifugeer het baculovirus supernatant bij 1.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 ° C tot cellulaire puin verwijderen en behandelen de baculovirus supernatant met 50 eenheden/mL nuclease (250 eenheden/µL van voorraad) gedurende 2 uur bij 37 ° C te verteren de genomic DNA en RNA. Filter het supernatant door een 0,45 micrometer filtratie unit.</li>
</ol>3. voorbereiding van de chromatografie-systeem
<ol><li>Voorbereiden van de chromatografie-systeem door het achtereenvolgens spoelen de monster en buffer lijnen elke met steriel water, 1 N natriumhydroxide, water, en wassen van buffer (20 mM natriumfosfaat buffer met 150 mM-natriumchloride, pH 7,0) bij een lineaire debiet van 50 mL/min.</li>
	<li>Bereid een heparine 50 µm kolom (10 × 10 cm, 7.9 mL van kolom volume (CV)) door het opeenvolgend uitgevoerd kolom schoonmaken buffer (5 CV steriele 20 mM natriumfosfaat buffer met 2 M keukenzout of natriumchloride, pH 7,0) en 5 CV was buffer op een lineaire debiet van 7 mL/min.</li>
</ol>4. zuivering van Baculovirus Vector
<ol><li>De chromatografie-systeem als volgt instellen:<ol>
<li>Gebruik van het voorbeeld perszijde voor het laden van het supernatant baculovirus laden.</li>
		<li>Gebruik de buffer perszijde A1 voor het laden van de buffer wassen. Bereiden van een fles met ten minste 500 mL was buffer en plaats de was buffer lijn in de fles.</li>
		<li>Gebruik de buffer perszijde A2 voor het laden van de elutie buffer (20 mM natriumfosfaat met 1,5 M natriumchloride, pH 8,0). Bereiden van een fles met ten minste 500 mL elutie buffer en plaats de elutie buffer lijn in de fles.</li>
		<li>Meerdere 50 mL conische buisjes in de collector van de breuk te verzamelen van de kolom pass-through baculovirus bezinken, het was buffer en de eluted baculovirus invoegen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Equilibreer de heparine-kolom met vijf 7.9 mL kolom hoeveelheid (CVs) was buffer (40 mL) bij een lineaire debiet van 7,0 mL/min.</li>
	<li>Laden van 250 mL baculovirus supernatant op de heparine-kolom met behulp van de pomp (monster perszijde) van de steekproef van de chromatografie-systeem op een lineaire debiet van 2,0 mL/min.</li>
	<li>Doorlopen 10 CVs (80 mL) van was buffer heparine kolom aan een lineaire stroomtarief van 2,0 mL/min tot de ultraviolet (UV) extinctie curve (280 nm) is teruggekeerd naar basislijn en wordt stabiel.</li>
	<li>Elueer de baculovirus deeltjes uit de kolom heparine 7.9 mL met 5 CVs (40 mL) van elutie buffer op een lineaire debiet van 4,0 mL/min. horloge voor een scherpe elutie piek van eiwit op het chromatogram wanneer de baculovirus deeltjes van de heparine-kolom distantiëren.</li>
	<li>Na elutie, onmiddellijk verdunnen het geëlueerd baculovirus supernatant 10-fold met 20 mM natriumfosfaat buffer in water om te voorkomen dat de inactivatie van baculovirus deeltjes uit osmotische schok tijdens latere centrifugeren.</li>
	<li>Opslaan van 100 µL van elk van de fracties, met inbegrip van de kolom doorstroming verzameld tijdens het laden van het supernatans dat baculovirus, het was buffer en het eluaat. Besmetten deze baculovirus breuken ten HT1080 om de reiniging proces (zie punt 6) te evalueren.</li>
	<li>Reinig de kolom met kolom schoonmaken was buffer en buffer. Tot slot, de kolom met 5 CV steriele 20% ethanol in water bij een lineaire debiet van 7,0 mL/min spoelen en bewaren bij 4 ° C.</li>
	<li>De chromatografie-systeem met water, 1 N natriumhydroxide, opnieuw met water, en 20% ethanol in water bij een lineaire debiet van 50.0 mL/min schoon en bewaar het systeem in 20% ethanol.</li>
</ol>5. de concentratie van Baculovirus
<ol><li>Vooraf steriliseren centrifuge buizen met behulp van een autoclaaf. Voeg een gelijk volume baculovirus supernatant aan elke ultracentrifuge buizen in de kap van een weefselkweek. Meten van het gewicht van de buis door een evenwicht en het gewicht van de inhoud van de ultracentrifuge buizen met steriel PBS aan te passen.</li>
	<li>Plaats elk van de ultracentrifuge buizen zich te verzetten tegen de SW 32 Ti-rotor emmer.</li>
	<li>De ultracentrifuge draaien op 80.000 × g voor 90 min bij 4 ° C.</li>
	<li>Open de ultracentrifuge buizen in de kap van een weefselkweek en aseptisch gecombineerd de vloeistof zonder het verwijderen van de baculovirus pellet.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet van elke buis door krachtig pipetteren omhoog en omlaag met 200 µL PBS met 0,5% (w/vol) BSA.</li>
	<li>De geconcentreerde baculovirus overbrengen in cryovials (50 tot 100 µL per flacon) en opslaan bij-80 ° C.</li>
</ol>6. titratie van Baculovirus
<ol><li>De dag voordat de infectie, HT1080 cellen met behulp van een hemocytometer na cellen met Trypan blauw kleuring tellen. Zaad 1 x 105 HT1080 cellen per putje in een 6-well plaat in 2 mL van de Dulbecco bewerkt Eagle's Medium (DMEM) met 10% foetale runderserum (FBS). Zaad verschillende extra wells te kunnen bepalen van het exacte aantal cellen op het moment van infectie. Cultuur van de cellen in een incubator bij 37 ° C en 5% CO2. Opmerking: HT1080 cellen worden gebruikt voor de titratie als ze een hoger niveau van heparan sulfaat in vergelijking met de andere cel lijnen16express. Aangezien HT1080 cellen zijn aanhangend, titratie is eenvoudiger en minder tijdrovend in vergelijking met het gebruik van de traditionele Sf9 gebaseerde titratie.</li>
	<li>Op de dag van de infectie, door het aantal cellen per putje te bepalen door het tellen van cellen uit putten. De cellen infecteren door toevoeging van de verdunde oorspronkelijke baculovirus die was gereserveerd voorafgaand aan kolom zuivering en met monsters uit de kolom doorstroming, wassen en elutie breuken. Voor elk monster, bepaal de verdunnings- en volume empirisch gebaseerd op infectieuze baculovirus deeltjes en infecteren van elk putje in drievoud.</li>
	<li>Twee dagen na infectie, analyseren de cellen voor de uitdrukking van het gen van belang. Cellen kunnen worden geanalyseerd met behulp van een stroom cytometer als zij een fluorescente proteïne (bijvoorbeeld GFP)17 uiten.</li>
	<li>Berekenen van de titers (besmettelijke eenheid per mL) op basis van het aantal cellen aanwezig zijn op het moment van infectie, de verdunningsfactor, alsmede de percentages van fluorescente proteïnen in cellen met de formule: (aantal cellen tijdens de infectie × percentage van fluorescent proteïne positieve cellen × verdunningsfactor) / volume van baculovirus in mL. Opmerking: Bijvoorbeeld, als het totale aantal cellen per putje op het moment van infectie is 1,2 × 10-5, het percentage van fluorescente proteïne is 5%, de verdunningsfactor is 100 en het volume van de verdunde baculovirus toegevoegd is 10 µL, is de titer 6 × 107 besmettelijke eenheden (IU) /mL.</li>
</ol>

<ol><li>Ikonomou, L., Schneider, Y. J., Agathos, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+cell+culture+for+industrial+production+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Insect cell culture for industrial production of recombinant proteins.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 62 (1), 1-20 (2003).</li>
<li>Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+using+the+baculovirus-insect+cell+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Prog%22%5BJournal%5D)">Protein production using the baculovirus-insect cell expression system.</a> Biotechnol Prog. 30 (1), 1-18 (2014).</li>
<li>Cox, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+protein+vaccines+produced+in+insect+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Recombinant protein vaccines produced in insect cells.</a> Vaccine. 30 (10), 1759-1766 (2012).</li>
<li>Boyce, F. M., Bucher, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus-mediated+gene+transfer+into+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (6), 2348-2352 (1996).</li>
<li>Airenne, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus%3A+an+insect-derived+vector+for+diverse+gene+transfer+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Baculovirus: an insect-derived vector for diverse gene transfer applications.</a> Mol Ther. 21 (4), 739-749 (2013).</li>
<li>Sung, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+delivery+into+cell+lines+and+stem+cells+using+baculovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Efficient gene delivery into cell lines and stem cells using baculovirus.</a> Nat Protoc. 9 (8), 1882-1899 (2014).</li>
<li>Zeng, J., Du, J., Lin, J., Bak, X. Y., Wu, C., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transient+transduction+of+human+embryonic+stem+cell-derived+neurons+with+baculoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transient transduction of human embryonic stem cell-derived neurons with baculoviral vectors.</a> Mol Ther. 17 (9), 1585-1593 (2009).</li>
<li>Zeng, J., Du, J., Zhao, Y., Palanisamy, N., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculoviral+vector-mediated+transient+and+stable+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Baculoviral vector-mediated transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 25 (4), 1055-1061 (2007).</li>
<li>Wu, C., Soh, K. Y., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion-exchange+membrane+chromatography+method+for+rapid+and+efficient+purification+of+recombinant+baculovirus+and+baculovirus+gp64+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Ion-exchange membrane chromatography method for rapid and efficient purification of recombinant baculovirus and baculovirus gp64 protein.</a> Hum Gene Ther. 18 (7), 665-672 (2007).</li>
<li>Grein, T. A., Michalsky, R., Vega Lopez, M., Czermak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+a+recombinant+baculovirus+of+Autographa+californica+M+nucleopolyhedrovirus+by+ion+exchange+membrane+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Purification of a recombinant baculovirus of Autographa californica M nucleopolyhedrovirus by ion exchange membrane chromatography.</a> J Virol Methods. 183 (2), 117-124 (2012).</li>
<li>Nasimuzzaman, M., Lynn, D., van der Loo, J. C., Malik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+baculovirus+vectors+using+heparin+affinity+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Purification of baculovirus vectors using heparin affinity chromatography.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16071(2016).</li>
<li>Makkonen, K. E., Turkki, P., Laakkonen, J. P., Yla-Herttuala, S., Marjomaki, V., Airenne, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((6-o-+and+N-sulfated+syndecan-1+promotes+baculovirus+binding+and+entry+into+Mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">6-o- and N-sulfated syndecan-1 promotes baculovirus binding and entry into Mammalian cells.</a> J Virol. 87 (20), 11148-11159 (2013).</li>
<li>Nasimuzzaman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparan+sulfate+in+baculovirus+binding+and+entry+of+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Heparan sulfate in baculovirus binding and entry of mammalian cells.</a> J Virol. 88 (8), 4607-4608 (2014).</li>
<li>Urabe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+generation+of+high-titer+recombinant+adeno-associated+virus+type+5+in+insect+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Scalable generation of high-titer recombinant adeno-associated virus type 5 in insect cells.</a> J Virol. 80 (4), 1874-1885 (2006).</li>
<li>Feliciello, I., Chinali, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+alkaline+lysis+method+for+the+preparation+of+highly+purified+plasmid+DNA+from+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A modified alkaline lysis method for the preparation of highly purified plasmid DNA from Escherichia coli.</a> Anal Biochem. 212 (2), 394-401 (1993).</li>
<li>Nasimuzzaman, M., Persons, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Membrane-associated+heparan+sulfate+is+a+receptor+for+prototype+foamy+virus+in+human%2C+monkey%2C+and+rodent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Cell Membrane-associated heparan sulfate is a receptor for prototype foamy virus in human, monkey, and rodent cells.</a> Mol Ther. 20 (6), 1158-1166 (2012).</li>
<li>Earl, P. L., Americo, J. L., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+use+of+a+vaccinia+virus+neutralization+assay+based+on+flow+cytometric+detection+of+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Development and use of a vaccinia virus neutralization assay based on flow cytometric detection of green fluorescent protein.</a> J Virol. 77 (19), 10684-10688 (2003).</li>
<li>Kim, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+tumor+growth+in+xenograft+model+mice+by+programmed+cell+death+4+gene+delivery+using+folate-PEG-baculovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Suppression of tumor growth in xenograft model mice by programmed cell death 4 gene delivery using folate-PEG-baculovirus.</a> Cancer Gene Ther. 17 (11), 751-760 (2010).</li>
<li>Stanbridge, L. J., Dussupt, V., Maitland, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculoviruses+as+vectors+for+gene+therapy+against+human+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Baculoviruses as vectors for gene therapy against human prostate cancer.</a> J Biomed Biotechnol. 2003 (2), 79-91 (2003).</li>
<li>Nasimuzzaman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+purification+of+high-titer+foamy+virus+vector+for+the+treatment+of+leukocyte+adhesion+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Production and purification of high-titer foamy virus vector for the treatment of leukocyte adhesion deficiency.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16004(2015).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Het hier gepresenteerde protocol beschrijft de productie van baculovirus in Sf9 cellen in schorsing cultuur en zuivering van baculovirus met behulp van een chromatografie van de affiniteit van heparine. De parameters die worden gebruikt in dit protocol de opbrengst te maximaliseren en minimaliseren de inactivering van besmettelijke baculovirus. Het protocol hier toont dat een aanzienlijk verbeterde herstel van baculovirus deeltjes ten opzichte van terugvorderingen bereikt door anderen9.
<p cla...

Baculovirus wordt voornamelijk gebruikt voor de productie van recombinante eiwitten en vaccins in nachtvlinder Spodoptera fugiperda (Sf) 9 insect cellen met behulp van recombinant Autographa californica multicapsid nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV) 1 , 2 , 3 , 4. meer recentelijk het ontpopt zich als een veelbelovende vector voor gene therapie toepassing5. Het is bekend dat er een brede host en weefsel tropisme, zowel rustige en delende cellen infecteert, is niet-pathogene en niet doet integreren in de host chromosoom4,5,6. Baculovirus kan bovendien worden geproduceerd in serumvrij schorsing cultuur die is schaalbaar en gesloten systeem verwerking voor toekomstige klinische productie1voorziet.
De zuiverheid van baculovirus deeltjes is belangrijk voor het bereiken van effectieve transductie terwijl het minimaliseren van de cytotoxiciteit7,8,9. Baculovirus kunnen worden geconcentreerd door ultracentrifugatie of tangentiële stroom filtratie (TFF) met beperkte invloed op de besmettelijkheid. Deze procedures niet alleen concentreren virusdeeltjes maar ook cellulaire puin en eiwitten uit de Sf9 cultuur, die kan worden giftig in vitro (persoonlijke opmerking) en kunnen leiden tot ontsteking of een immuunrespons wanneer gebruikt in vivo. Om dit te vermijden, vooral als met behulp van zeer geconcentreerd virusvoorraden, moet besmettelijke baculovirus worden gezuiverd en gescheiden van verontreinigende deeltjes.
Verschillende methoden zijn voor de zuivering en de concentratie van baculovirus vectoren10,11,12gerapporteerd. Van de beschikbare benaderingen zorgt de chromatografie van de affiniteit van de heparine voor een-voor-stapmodus hoog niveau van zuivering met de lage concentratie van proteïnen12besmetten. De methode is gebaseerd op de identificatie van heparan sulfaat als de receptor voor baculovirus13,14. Na het laden van Sf9 cel supernatant op de kolom en de binding van baculovirus, kan de kolom worden gewassen met fysiologische (isotone) buffer om niet-afhankelijke of losjes gebonden verontreinigende deeltjes te verwijderen. Aangezien de binding aan heparine omkeerbaar is, kunnen baculovirus deeltjes met een hoog zout buffer, die onmiddellijk wordt verdund aan fysiologische (isotone) zoutconcentratie ter voorkoming van inactivatie door osmotische schok12worden geëlueerd. Bovendien, de productie van baculovirus, evenals vangen op en de elutie van de chromatografie-kolom, kan worden uitgevoerd met behulp van een gesloten-systeemproces die verenigbaar is met de huidige goede productiepraktijken (cGMP).
Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor vervaardiging, zuivering, en concentratie van besmettelijke baculovirus met behulp van de chromatografie van de affiniteit en centrifugeren. Kortom, wij produceren baculovirus door transfectie van Sf9 cellen met een baculovirus plasmide DNA in aanhangend cultuur en verdere uitbreiding van de besmettelijke baculovirus in serumvrij schorsing cultuur. We zuiveren baculovirus met behulp van de chromatografie van de affiniteit van heparine en ultracentrifugatie gebruiken als de laatste stap te sterk concentreren de vector voor gen-therapie-toepassing.

<table><tbody><tr><td>Akta Avant 150</td><td>GE Healthcare</td><td>28976337</td><td>Chromatografiesysteem</td></tr><tr><td>POROS Heparin 50 &micro;m Column</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4333414</td><td>Heparine kolom</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckman-Coulter</td><td>Niet-catalogusitem</td><td>Concentreert virus op hoge snelheid</td></tr><tr><td>Polyallomer Ultracentrifugebuis</td><td>Beckman-Coulter</td><td>326823</td><td>Concentreert virus op hoge snelheid</td></tr><tr><td>MaxQ 8000 orbitale shakerincubator&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Niet-catalogusitem</td><td>Schakelaar voor suspensiecultuur</td></tr><tr><td>250 mL Erlenmeyerkolven</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>238071</td><td>Kolf voor suspensiecultuur</td></tr><tr><td>1 L Erlenmeyerkolven</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>238072</td><td>Kolf voor suspensiecultuur</td></tr><tr><td>Microscoop (Olympus CKX41)</td><td>Olympus</td><td>Niet-catalogusitem</td><td>Celmonitoring en -telling&nbsp;</td></tr><tr><td>Tabelcentrifuge</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75253839/433607</td><td>Voor opheldering van Baculovirus supernatant</td></tr><tr><td>50 ml Conische buis</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-959-49A</td><td>Voor het verzamelen van Baculovirus supernatant</td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>07-200-80</td><td>Weefselcultuur behandelde plaat</td></tr><tr><td>10-cm plaat</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>08-772E</td><td>Weefselcultuur behandelde plaat</td></tr><tr><td>Stericup-HV, 0.45&nbsp;&micro;m, PVDF</td><td>EMD-Millipore</td><td>SCHVU05RE</td><td>Filtratie-eenheid</td></tr><tr><td>Kanamycine</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15160-054</td><td></td></tr><tr><td>Tetracycline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7660</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycine</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Bac-to-Bac Vector Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10360-014</td><td>Baculovirus expressiesysteem</td></tr><tr><td>DH10B-T1R&nbsp; Competente cel</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12331-013</td><td>Competente cel voor bacmid</td></tr><tr><td>TE buffer</td><td>In-house</td><td>Niet-catalogusitem</td><td>10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0.</td></tr><tr><td>Plasmid Maxiprep kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K2100-06</td><td>Voor bacmid zuivering</td></tr><tr><td>Sf9 Cellen</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11496-015</td><td>Insectencellen</td></tr><tr><td>Grace&rsquo;s Insect Cell Culture Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11605-094</td><td>Transfectiemedium</td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>20012227</td><td>Cellen wassen, monsters verdunnen</td></tr><tr><td>HyClone SFX-Insect cell media</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30278.02</td><td>Serumvrij insectencelgroeimedium</td></tr><tr><td>Benzonase Nuclease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1014</td><td>Enzym om DNA en RNA af te breken</td></tr><tr><td>Baculovirus plasmid (bacmid) DNA</td><td>In-house</td><td>Niet-catalogusitem</td><td>Bacmid voor Baculovirus Productie</td></tr><tr><td>Cellfectin II&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10362</td><td>Transfectie reagens voor insectencellen</td></tr><tr><td>Rundserumalbumine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4737</td><td>Stabiliseert Baculovirus</td></tr><tr><td>Cryovial</td><td>Thomas Scientific</td><td>1222C24</td><td>Voor opslag van Baculovirus</td></tr><tr><td>HT1080 cellijn</td><td>ATCC</td><td>CCL-121</td><td>Fibroblastencellijn</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429</td><td>Groeimedia voor cellijnen</td></tr><tr><td>Wasbuffer</td><td>In-house</td><td>Niet-catalogusitem</td><td>20 mmol/l fosfaatbuffer met 150 mmol/l natriumchloride</td></tr><tr><td>Elutiebuffer</td><td>In-house</td><td>Niet-catalogusitem</td><td>20 mmol/l fosfaatbuffer met 1,5 mol/l natriumchloride</td></tr><tr><td>Kolomreinigingsbuffer</td><td>In-house</td><td>Niet-catalogusitem</td><td>20 mmol/l fosfaatbuffer met 2,0 mol/l natriumchloride</td></tr><tr><td>Steriele water</td><td>In-house</td><td>Niet-catalogusitem</td><td>Voor Akta Avant reiniging</td></tr><tr><td>Natriumhydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.09137</td><td>Voor Akta Avant reiniging</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7073</td><td>Voor Akta Avant reiniging</td></tr></tbody></table>

productie en zuivering van baculovirus voor toepassing van de gentherapie

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

Baculovirus heeft van oudsher gebruikt voor de productie van recombinante eiwitten en vaccin. Echter, meer recentelijk, baculovirus ontpopt zich als een veelbelovende vector voor gen-therapie-toepassing. Hier, wordt baculovirus geproduceerd door voorbijgaande transfectie van het baculovirus plasmide DNA (bacmid) in een aanhangend cultuur van Sf9 cellen. Baculovirus wordt vervolgens uitgebreid in Sf9 cellen in een serumvrij schorsing cultuur totdat het gewenste volume is bereikt. Het wordt dan gezuiverd uit de cultuur supernatant met behulp van de chromatografie van de affiniteit van de heparine. Virus supernatant wordt geladen op de heparine-kolom die baculovirus deeltjes in de bovendrijvende substantie als gevolg van de affiniteit van heparine bindt voor baculovirus glycoproteïne omhullen. De kolom wordt gewassen met een buffer om het verwijderen van verontreinigingen en baculovirus uit de kolom met een hoge-zout-buffer wordt geëlueerd. Het eluaat is verdund tot een isotone zoutconcentratie en baculovirus deeltjes zijn verdere geconcentreerd met ultracentrifugatie. Met deze methode kan baculovirus worden geconcentreerd tot 500-fold met een 25% terugwinning van infectieuze deeltjes. Hoewel het protocol beschreven hier het productie en zuivering van de baculovirus uit culturen tot 1 L toont, de methode kan worden geschaald-up in een gesloten-systeem schorsing cultuur tot een klinische-grade vector voor gen-therapie-toepassing.

Het protocol gepresenteerd is in een stroomdiagram (Figuur 1). Stappen omvatten de voorbijgaande transfectie van Sf9 cellen met DNA te produceren baculovirus in aanhangend cultuur in een plaat, de latere versterking in serumvrij schorsing cultuur, nuclease behandeling en verduidelijking door centrifugeren en filtratie, bacmid en de zuivering met behulp van de chromatografie van de affiniteit van heparine gevolgd door concentratie met ultracentrifugatie.
<...

In dit protocol is baculovirus geproduceerd door voorbijgaande transfectie van baculovirus plasmide in Sf9 cellen en versterkt in een serumvrij schorsing cultuur. De bovendrijvende substantie is gezuiverd door de chromatografie van de affiniteit van heparine en verder geconcentreerd door ultracentrifugatie. Dit protocol is handig voor de productie en zuivering van baculovirus voor gen-therapie-toepassing.

Productie en zuivering van Baculovirus voor toepassing van de gentherapie

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Het algemene doel van dit protocol is om baculovirus te produceren in insectencelcultuur, te zuiveren via heparine-affiniteitschromatografie en te concentreren met ultracentrifugatie. Het eindproduct kan worden gebruikt voor in vivo gentransfer of als vaccin. Deze methode kan onderzoekers helpen die gezuiverd en geconcentreerd baculovirus willen gebruiken voor gentherapie-applicaties.Baculovirusdeeltjes kunnen cellulaire resten en eiwitten uit de Sf9-cultuur bevatten, die bij gebruik bij mensen ontstekingen of een immuunrespons kunnen opwekken. Om toxiciteit te voorkomen, wordt het baculovirus gezuiverd en gescheiden van contaminerende deeltjes. Een deel van de procedure zal worden gedemonstreerd door Marilou Narciso, een onderzoeksassistent uit mijn laboratorium.Om de suspensiecultuur op te zetten, worden 50 milliliters Sf9-cellen in insectencultuurmedium overgebracht naar een polycarbonaat Erlenmeyer-kolf van 250 milliliters. Plaats de kolf in een orbitale schudincubator. Voeg twee milliliters P2-baculovirusstock toe aan de cellen en schud bij 135rpm terwijl een constante temperatuur van 28 degrees Celsius wordt gehandhaafd.Vier dagen na infectie zal de gehele Sf9-celpopulatie cy

production-purification-baculovirus-for-gene-therapy

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Wij rapporteren hier methoden over de moleculair-genetische manipulatie van de Yarrowia lipolytica Po1g stam voor verbeterde gendeletie-efficiëntie. De resulterende gemanipuleerde Y. lipolytica stammen hebben potentiële toepassingen in biobrandstof en biochemische productie.

Genetische manipulatie van een onconventionele Gist voor duurzame biobrandstoffen en biochemische Production

We beschrijven een methode om enkele zoogdiercellen te sorteren en om de expressie van maximaal 96 doelgenen van belang in elke cel te kwantificeren. Deze methode omvat het gebruik van interne qPCR-standaarden om de schatting van absolute transcripttellingen mogelijk te maken.

Eencellige Gene Expression Profiling Met behulp van FACS en qPCR met interne standaarden

We beschrijven de strategie van de productie van integrase-deficiënte lentivirale vectoren (IDLVs) als voertuigen voor het leveren van CRISPR/Cas9 naar de cellen. Met een vermogen om te bemiddelen snelle en robuuste gene bewerken in cellen, IDLVs presenteren een veiliger en even effectieve vector platform voor de levering van het gen in vergelijking met integrase-bevoegde vectoren.

Een Protocol voor de productie van Integrase-deficiënte lentivirale vectoren voor CRISPR/Cas9-gemedieerde Gene knock-out in cellen verdelen

Gerichte genoom bewerken in het modelsysteem Danio rerio (zebravis) is sterk bevorderd door de opkomst van de CRISPR gebaseerde benaderingen. Hierin beschrijven we een gestroomlijnde, robuust protocol voor generatie en van onzin CRISPR afkomstige allelen waarin de heteroduplex mobility assay en identificatie van mutaties met behulp van de volgende generatie sequencing.

Efficiënte productie en identificatie van CRISPR/Cas9-gegenereerd Gene uitsparingen in de modelsysteem Danio rerio

Een protocol voor snelle CRISPR/Cas9-gemedieerde gene verstoring van muis en mens primaire hematopoietische cellen wordt beschreven in dit artikel. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins worden ingevoerd via electroporation met sgRNAs gegenereerd via in vitro transcriptie en commerciële Cas9. Hoge bewerken rendementen worden bereikt met beperkte tijd en de financiële kosten.

Hoogefficiënte Gene verstoring van lymfkliertest en menselijke hematopoïetische voorlopercellen door CRISPR/Cas9

Het doel van dit protocol is het isoleren van niet-menselijke primaten CD34+ cellen uit primer beenmerg, gen-wijzigen van deze cellen met lentivirale vectoren, en voor te bereiden een product infusie in de autologe host. Het protocol van de totale lengte is ongeveer 48 uur.

Voorbereiding en genetische modificatie van Nonhuman primaat hematopoietische stamcellen en voorlopercellen

Dit protocol beschrijft de stappen die nodig zijn voor het genereren van een modelsysteem waarin de transcriptie van een endogene gen van belang voorwaardelijk kan worden gecontroleerd in de levende dieren of cellen met behulp van verbeterde lac -onderdrukker en/of tet activator systemen.

In vivo toepassing van het systeem van de afstandsbediening voor de manipulatie van de endogene genexpressie

Parasponia andersonii is een snelgroeiende tropische boom die behoort tot de cannabis familie (Cannabaceae) en kan stikstof fixerende wortel knobbeltjes vormen in samenwerking met de Rhizobium. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor omgekeerde genetische analyses in P. andersonii op basis van Agrobacterium tumefaciens-gemedieerde stabiele transformatie en op crispr/Cas9 gebaseerde genoom bewerking.

Transformeren, genoom bewerking en Fenotyping de stikstoffixatie tropische Cannabaceae boom Parasponia andersonii

Hier beschreven is een protocol voor het karakteriseren van modules van biologisch synergetische miRNAs en hun assemblage in korte transgenen, waardoor gelijktijdige overexpressie voor gentherapie toepassingen mogelijk is.

Karakterisatie van functioneel geassocieerde Mirna's in glioblastoma en hun engineering in kunstmatige clusters voor gentherapie

Hier presenteren we een aangepaste methode voor cryopreservatie van eencellige embryo's, evenals een protocol dat het gebruik van gevriesontdooide embryo's en elektroporatie koppelt voor de efficiënte generatie van genetisch gemodificeerde muizen.

Gebruik van gevriesde embryo's voor hoogrendementproductie van genetisch gemodificeerde muizen

Leer baculovirus produceren en zuiveren met heparine-affiniteitschromatografie en ultracentrifugatie voor gentherapie-toepassingen. Deze methode elimineert celdeeltjes en eiwitten voor veilige in vivo gentransfer.

Productie en zuivering van Baculovirus voor toepassing van de gentherapie

Meer video's verkennen