Productie en zuivering van Baculovirus voor toepassing van de gentherapie

Het algemene doel van dit protocol is om baculovirus te produceren in insectencelcultuur, te zuiveren met heparine-affiniteitschromatografie en te concentreren met ultracentrifugering. Het eindproduct kan worden gebruikt voor in vivo gentransfer of als vaccin. Deze methode kan onderzoekers helpen die gezuiverd en geconcentreerd baculovirus willen gebruiken voor gentherapietoepassing.

Baculovirusdeeltjes kunnen cellulaire resten en eiwitten bevatten uit Sf9-cultuur die ontsteking of een immuunrespons kunnen veroorzaken wanneer ze bij mensen worden gebruikt. Om toxiciteit te voorkomen, wordt baculovirus gezuiverd en gescheiden van besmettende deeltjes. Sommige delen van de procedure zullen worden gedemonstreerd door Marilou Narciso, een onderzoeksassistent uit mijn laboratorium.

Om de suspensiecultuur op te zetten, zaai 50 milliliter Sf9-cellen in insectencultuurmedium in een 250 milliliters polycarbonaat Erlenmeyer-kolf. Plaats de kolf in een orbitale shakerincubator. Voeg twee milliliter P2 baculovirus-stamkweek toe aan de cellen en schud bij 135 rpm terwijl een constante temperatuur van 28 graden Celsius wordt gehandhaafd.

Vier dagen na infectie zal de hele Sf9-celpopulatie cytopathisch effect vertonen, wat een indicatie is van hoge titerbaculovervirusproductie. Amplificeer het baculovirus sequentieel tot het gewenste volume wordt verkregen, door het volume celcultuur bij elke volgende infectie 10 tot 50-voudig te verhogen. Na centrifugatie van de uiteindelijke baculovirus-supernatant gedurende 30 minuten bij 1000g en vier graden Celsius om het grove cellulaire puin te scheiden, breng de supernatant over naar een schone houder en behandel met nuclease bij 50 eenheden per milliliter gedurende twee uur bij 37 graden Celsius om de genomische DNA en RNA te verteren.

Filter ten slotte de virale supernatant door een 0,45 micron filtereenheid. Stel het chromatografiesysteem in door de wasbufferlijn van inlaatpoort A1 in een fles met minimaal 500 milliliter wasbuffer te plaatsen. Gebruik de A2-bufferinlaatpoort om de elutiebuffer te laden.

Plaats verschillende 50 milliliter conische buizen in de fractiecollector om de baculovirus-supernatant uit de kolom, de wasbuffer en de geëludeerde baculovirus te verzamelen. Equilibreer de heparine-kolom met vijf 7,9 milliliter kolomvolumen wasbuffer bij een lineaire stromingssnelheid van zeven milliliter per minuut. Laad 250 milliliter baculovirus-supernatant op de heparine-kolom met behulp van de monsterpomp van de inlaatmonsterpoort bij een lineaire stromingssnelheid van twee milliliter per minuut.

Laat vervolgens 10 kolomvolumen wasbuffer door de heparine-kolom lopen bij een lineaire stromingssnelheid van twee milliliter per minuut totdat de ultraviolette absorptiecurve is teruggekeerd naar de basislijn en stabiel is geworden. Eludeer de baculovirusdeeltjes van de heparine-kolom met vijf kolomvolumen elutiebuffer bij een lineaire stromingssnelheid van vier milliliter per minuut. Let op een scherpe elutiepiek van eiwit op het chromatogram wanneer de baculovirusdeeltjes zich dissociëren van de heparine-kolom.

Na elutie, verdun het geëludeerde baculovirus-supernatant onmiddellijk 10-voudig met 20 millimeter natriumfosfaatbuffer om activering van baculovirusdeeltjes door osmotische shock tijdens de volgende centrifugatie te voorkomen. Begin de concentratieprocedure door een gelijk volume van het baculovirus-supernatant toe te voegen aan autoclaveerbare ultracentrifugebuizen. Meet het gewicht van de buis met een weegschaal en pas het gewicht van de inhoud van de ultracentrifugebuizen aan met steriele PBS.

Plaats elk van de ultracentrifugebuizen in een tegenoverliggende emmer van de SW 32 Ti-rotor en laat de ultracentrifuge draaien bij 80.000 g gedurende 90 minuten bij vier graden Celsius. Na centrifugatie, open de ultracentrifugebuizen in een weefselkweekkap en aspireer asseptisch de vloeistof zonder het baculovirus-pellet te verwijderen. Voeg 200 microliter PBS met 0,5% BSA toe en hersuspendeer elk pellet door krachtig op en neer te pipetteren.

Ten slotte breng 50 tot 100 microliter aliquots van het geconcentreerde baculovirus over naar cryoflacons en bewaar bij min 80 graden Celsius. Baculovirus-titers werden geschat door infectie van HT1080-cellen. De lijn verbonden door diamantjes toont de totale infectieuze eenheden van baculovirus in elke fractie.

Baculovirusdeeltjes binden sterk aan de heparine-kolom, daarom wordt geen significante hoeveelheid virus gedetecteerd in de kolomwasbuffer. Er wordt een scherpe piek van eiwit waargenomen tijdens elutie, die overeenkomt met de baculovirusfractie. De parameters die in dit protocol worden gebruikt, maximaliseren de opbrengst en minimaliseren de inactivering van infectieuze baculovirusdeeltjes.

Dit protocol kan worden gebruikt voor de zuivering van andere virussen en eiwitten die een affiniteit hebben voor heparine.