Name: Semi-kwantitatieve opsporing van RNA-afhankelijke RNA-polymeraseactiviteit van menselijke Telomerase Reverse-Transcriptase eiwit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Leer een semi-kwantitatieve methode om RNA-afhankelijke RNA-polymeraseactiviteit van menselijk TERT-eiwit te detecteren in HeLa-cellen. Deze techniek biedt inzicht in de biologische rol van TERT in RNA-biologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd deels gesteund door het Project voor de ontwikkeling van innovatieve onderzoek naar kanker Therapeutics (P-DIRECT) (15cm0106102h0002, K.M.) en het Project voor kankeronderzoek en therapeutische Evolution (P-maken) (16cm 01061150001, K.M.) uit Japan Agency voor medisch onderzoek en ontwikkeling, AMED; de Takeda Science Foundation (Y.M.); Toekenning van de Prinses Takamatsu Cancer Research Fund (13-24520, Y.M.); en JSPS KAKENHI Grant nummer JP16K07133 (Y.M.).

1. reagens Setup
<ol><li>
Reagentia gebruikt voor de synchronisatie van de cel
	<ol>
<li>Los 30.28 mg van thymidine per 1 mL weefselkweek rang water te bereiden 125 mM thymidine wilt genereren Dulbecco van gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) met 2,5 mM thymidine. Het filtraat van de oplossing met een 0,22 μm spuit filter eenheid. Voeg 1 mL vers bereide 125 mM thymidine per 50 mL DMEM aangevuld met 10% (vol/vol) foetale runderserum (FBS).</li>
		<li>Voor het genereren van DMEM met 0,1 μg/mL van nocodazole, los nocodazole in dimethylsulfoxide (DMSO) voor te bereiden 5 μg/l nocodazole. Voeg 1 µL van 5 µg / µL nocodazole per 50 mL DMEM aangevuld met 10% (vol/vol) FBS.</li>
		<li>Voeg 1 µL van DMSO per 50 mL DMEM aangevuld met 10% (vol/vol) FBS wilt genereren DMEM met 0.002% (vol/vol) van DMSO.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Voor IP-RdRP assay gebruikte reagentia
	<ol>
<li>Bereiden van lysis buffer A: 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7.4) en 0,5% (vol/vol) Nonidet P-40 (NP-40). Bewaar het reagens bij 4 ° C.</li>
		<li>5 x acetaat buffer bereiden: 50 mM 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic zuur (HEPES)-KOH (pH 7,8), Kaliumacetaat 500 mM en 20 mM MgCl2. Bewaar het reagens bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Bereiden was buffer 1: 1 x acetaat buffer, 10% (vol/vol) glycerol, 0,1% (vol/vol) Triton X-100 en 0.06 x proteaseinhibitor cocktail, ethylenediamenetetraacetic azijnzuuroplossing (NA2EDTA)-gratis. Bereiden was buffer 1 op de dag van gebruik of de dag vóór gebruik. Bewaar het reagens bij 4 ° C.</li>
		<li>Bereiden van AGC oplossing: 1 x acetaat buffer, 10% (vol/vol) glycerol en 0,02% (wt/vol) 3-[(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonio] -1-propanesulfonat (CHAPS). Bewaar het reagens bij 4 ° C.</li>
		<li>Voeg 100 µL van 1 M CaCl2 per 50 mL AGC oplossing voor het genereren van AGC oplossing met 2 mM CaCl2. Bewaar het reagens bij 4 ° C.</li>
		<li>Voor het genereren van AGC oplossing met 3 mM ethyleenglycol-bis (b-aminoethylether)-N, N, N', N'-Dinatriumethyleendiaminetetra-azijnzuuroplossing (EGTA), voeg 375 µL van 0,4 M EGTA (pH 7.5) per 50 mL oplossing van AGC. Bewaar het reagens bij 4 ° C.</li>
		<li>Bereiden was buffer 2: 1 x acetaat buffer en 0,02% (wt/vol) KINNEBAKSPEK. Bewaar het reagens bij 4 ° C.</li>
		<li>Bereid HMD oplossing: 0,2 M HEPES-KOH (pH 7,8), 40 mM MgCl2 en 2 mM dithiothreitol (DTT). Bewaar het reagens bij-20 ° C. Opmerking: HMD oplossing moet worden verlengd ten minste drie maanden.</li>
		<li>2 x proteïnase K buffer bereiden: 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM EDTA en 1% (wt/vol) natrium dodecyl sulfaat (SDS). Bewaar het reagens bij-20 ° C.</li>
		<li>Bereiden van 2 x laden buffer: 95% (vol/vol) formamide, 20 mM EDTA en 1% (wt/vol) oranje G. Bewaar het reagens bij-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. voorbereiding van HeLa cellen
Opmerking: Bereiden HeLa cellen gesynchroniseerde in mitotische fase (gemanipuleerd) of asynchroon verdelen (unmanipulated). Cultuur van de cellen in het bijzijn van 5% CO2 bij 37 ° C.
<ol><li>
Synchronisatie van HeLa cellen in de mitose
	<ol>
<li>1 x 10 bord6 van HeLa cellen met 10 mL DMEM aangevuld met 10% (vol/vol) FBS in een cultuur van 10 cm schotel.</li>
		<li>Twee dagen na de beplating, wordt het medium vervangen door 10 mL DMEM met 2.5 mM thymidine en 10% (vol/vol) FBS. Cultuur van de cellen gedurende 24 uur.</li>
		<li>Spoel de cellen drie keer met 10 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (-), en cultuur van de cellen met 10 mL DMEM met 10% (vol/vol) FBS gedurende 6 uur.</li>
		<li>Vervang het medium met 10 mL DMEM met 0,1 µg/mL van nocodazole en 10% (vol/vol) FBS, en cultuur van de cellen voor 14u.</li>
		<li>Schud de cultuur schotel voorzichtig, en het supernatant met de vrijstaande mitotische cellen op te halen. Het nummer van de cel voor de IP-RdRP assay tellen.</li>
		<li>Centrifugeer het monster bij 490 x g gedurende 5 min bij 4 ° C, en verwijder het supernatant. Opmerking: De pellet cel kan worden opgeslagen bij-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Voorbereiding van unmanipulated HeLa cellen
	<ol>
<li>1 x 10 bord6 van HeLa cellen met 10 mL DMEM aangevuld met 10% (vol/vol) FBS in een cultuur van 10 cm schotel.</li>
		<li>Twee dagen na de beplating, wordt het medium vervangen door 10 mL DMEM met 10% (vol/vol) FBS. Cultuur van de cellen voor 30 h.</li>
		<li>Vervang het medium met 10 mL DMEM met 0.002% (vol/vol) DMSO en 10% (vol/vol) FBS, en cultuur van de cellen voor 14u.</li>
		<li>De cellen verzamelen door trypsinebehandeling met behulp van 0,7 mL trypsine (2,5 g/L) met 1 mM EDTA. Het nummer van de cel voor de IP-RdRP assay tellen.</li>
		<li>Centrifugeer het monster bij 490 x g gedurende 5 min bij 4 ° C, en verwijder het supernatant. Opmerking: De pellet cel kan worden opgeslagen bij-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. IP-RdRP Assay
<ol><li>Eiwit A-agarose kraal voorbereiding
	<ol>
<li>Breng 1 mL (bed volume 500 µL) van affiniteit hars een 1,5 mL microcentrifuge buis. Centrifugeer bij 800 x g gedurende 5 min bij 4 ° C, en verwijder het supernatant.</li>
		<li>800 µL van Lysis buffer A toevoegen aan de kralen, en meng goed door de buis meerdere malen omkeren. Centrifugeer bij 800 x g gedurende 3 min bij 4 ° C, en verwijder het supernatant. Herhaal deze stap tweemaal (totaal drie wasbeurten).</li>
		<li>800 µL van Lysis buffer A toevoegen aan de kralen, meng goed door de buis meerdere malen omkeren. Draai de buis 's nachts (of gedurende ten minste 4 uur) bij 4 ° C op een rondschudapparaat.</li>
		<li>Centrifugeer de buis bij 800 x g gedurende 3 min bij 4 ° C, en verwijder het supernatant.</li>
		<li>Voeg 500 µL van Lysis buffer A aan de kralen, en meng goed door de buis meerdere malen omkeren. Opslaan van de kralen bij 4 ° C.</li>
	</ol></li>
	<li>Voorbereiding van cel lysate
	<ol>
<li>(Optioneel) Als de cellen zijn bevroren in stap 2, plaats en ontdooien van bevroren cellen op ijs totdat de cellen losse worden.</li>
		<li>Wassen van de cellen een keer met 10 mL PBS (-). Centrifugeer het monster bij 1.450 x g gedurende 5 min bij 4 ° C, en verwijder het supernatant.</li>
		<li>Lyse de cellen met ijskoude Lysis-buffermengsel een (1 mL lysisbuffermengsel A per 1 x 10,7 , van de cellen) door zachte pipetteren.</li>
		<li>Bewerk ultrasone trillingen ten het monster in een 1,5 mL tube met volgende voorwaarden; versterking van de ultrasoonapparaat ingesteld op 25% en bewerk ultrasone trillingen ten voor 10 s.</li>
		<li>Centrifugeer het monster bij 20,400 x g gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C.</li>
		<li>De bovendrijvende vloeistof te verzamelen. Pipetteer elk 1 mL van het supernatans in 1,5 mL microcentrifuge buizen. Let op: Alle procedures onder RNase-vrij voorwaarden uitvoeren.</li>
	</ol></li>
	<li>Immunoprecipitation
	<ol>
<li>Vooraf duidelijk de lysate uit stap 3.2.6 door toevoeging van 40 µL (kraal volume 20 µL) van de voorwas eiwit A-agarose kralen per 1 mL van de lysate. Meng goed door de buis meerdere malen omkeren en draai het monster gedurende 30 minuten bij 4 ° C.</li>
		<li>Centrifugeer het monster bij 13.000 x g voor 1 min bij 4 ° C, en het supernatant te herstellen.</li>
		<li>Voeg 40 µL (bed volume 20 µL) van de voorwas eiwit A-agarose kralen en 10 µg anti-menselijke TERT antilichaam (kloon: 10E9-2)8 in de vooraf gewiste lysate. Meng goed door de buis meerdere malen omkeren en draai het monster bij 4 ° C dan 's nachts.</li>
		<li>Centrifugeer het monster bij 3300 x g voor 0,5 min bij 4 ° C, en verwijder de bovendrijvende substantie.</li>
		<li>Wassen van de kralen met Wash buffer 1: 1 mL was buffer 1 toevoegen aan de kralen, meng goed door het omkeren van de buis en roteren van het monster gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Centrifugeer het monster bij 3300 x g voor 0,5 min bij 4 ° C, en verwijder de bovendrijvende substantie. Herhaal deze stap aanvullende driemaal.</li>
		<li>De kralen keer wassen met AGC oplossing die 2 mM CaCl2: Voeg 1 mL AGC oplossing met 2 mM CaCl2 tot de kralen, meng goed door het omkeren van de buis en roteren van het monster gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Centrifugeer het monster bij 3300 x g voor 0,5 min bij 4 ° C, en verwijder de bovendrijvende substantie.</li>
		<li>Behandelen van de kralen met Micrococcal nuclease (MNase): bereiden van het MNase reactiemengsel beschreven in tabel 1. Resuspendeer de kralen in 60 µL van het reactiemengsel MNase door zachte pipetteren. Schud het monster voorzichtig (20 tot 25 rpm) op een draaitafel van een shaker instellen in een Peltier-type incubator voor 15 min bij 25 ° C. Opmerking: Het is zeer belangrijk te gebruiken een golvende shaker en Volg strikt de maximumsnelheid in deze stap. Ander soort shakers, zoals roterende mixers, worden niet aanbevolen.</li>
		<li>Centrifugeer het monster bij 3300 x g voor 0,5 min bij 4 ° C, en verwijder de bovendrijvende substantie.</li>
		<li>Wassen van de kralen tweemaal met AGC oplossing met 3 mM EGTA: toevoegen van AGC met 3 mM EGTA tot de parels 1 mL, meng goed door het omkeren van de buis en draaien het monster gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Centrifugeer het monster bij 3300 x g voor 0,5 min bij 4 ° C, en verwijder de bovendrijvende substantie. Herhaal deze stap eenmaal.</li>
		<li>Wassen van de kralen eenmaal met Wash buffer 2: Voeg 1 mL was buffer 2de kralen, meng goed door het omkeren van de buis, te roteren het monster gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Centrifugeer het monster bij 3300 x g voor 0,5 min bij 4 ° C, en verwijder de bovendrijvende substantie. Houd de kralen op het ijs tijdens het opzetten van RdRP reactie. Let op: Alle procedures onder RNase-vrij voorwaarden uitvoeren.</li>
	</ol></li>
	<li>RdRP-reactie
	<ol>
<li>Bereid het reactiemengsel van een RdRP in een nieuwe buis zoals beschreven in tabel 2.</li>
		<li>Voeg 6 µL van [α -32P] UTP (3.000 Ci/mmol) aan het mengsel en meng goed door pipetteren. Opmerking: [α -32P] ATP, [α -32P] CTP, of [α -32P] GTP kan worden gebruikt voor de reactie in plaats van [α -32P] UTP.</li>
		<li>Voeg 1 µL van sjabloon RNA (1 µg/µL) aan het mengsel en meng goed door pipetteren. Opmerking: Om de bepaling van de RdRP, wordt de volgende sjabloon RNA aanbevolen: 5'-GGGAUCAUGUGGGUCCUAUUACAUUUUAAACCCA-3' 9.</li>
		<li>Resuspendeer de kralen met 20 µL van het mengsel uitmaakt van RdRP, reactie uit stap 3.4.3 door pipetteren.</li>
		<li>Schud het monster voorzichtig (20 tot 25 rpm) op een draaitafel van een shaker instellen in een peltier-type incubator voor 2 h bij 32 ° C.</li>
		<li>5.4 µL van proteïnase K (20 mg/mL) en 45.4 µL van 2 x proteïnase K buffer toevoegen aan het reactiemengsel. Meng door pipetteren en schud (20 tot 25 rpm) het monster op een draaitafel instellen in een incubator Peltier-type gedurende 30 minuten bij 37 ° C.</li>
		<li>Voeg 109.2 ÂµL van RNase-vrij water aan het monster.</li>
		<li>Voeg 200 µL van zure fenol-chloroform aan het monster. Meng goed door vortex, en vervolgens Centrifugeer het monster bij 21,100 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. De waterfase overbrengen in een nieuwe buis. Herhaal deze stap eenmaal.</li>
		<li>Voeg 20 µL van 3 M Natriumacetaat (pH = 5.2), 4 µL van neerslag vervoerder en 250 µL van ethanol tot de waterige fase. Schud de buis goed voor mixen en centrifugeren van het monster bij 21,100 x g gedurende 20 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.</li>
		<li>Wassen van de pellet met 300 µL van koude 70% (vol/vol) ethanol opgeslagen bij-20 ° C. Centrifugeer het monster bij 21,100 x g gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C.</li>
		<li>Verwijder het supernatant en drogen van de pellet. Let op: Alle procedures onder RNase-vrij voorwaarden uitvoeren. Opmerking: De pellet uit stap 3.4.11 kan worden achtergelaten bij-20 ° C gedurende ten minste 2 dagen.</li>
	</ol></li>
	<li>RNase behandeling
	<ol>
<li>Resuspendeer de pellet uit stap 3.4.11 in 20 ÂµL van RNase-gratis water.</li>
		<li>Bereiden een RNase reactiemengsel in een nieuwe buis zoals beschreven in tabel 3.</li>
		<li>180 µL van het reactiemengsel RNase Voeg aan het monster, en Incubeer de buis gedurende 2 uur bij 37 ° C.</li>
		<li>2.3 µL van 10% (vol/vol) SDS Voeg aan het monster en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 ° C.</li>
		<li>Voeg 2 µL van proteïnase K (20 mg/mL) aan het monster en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 ° C.</li>
		<li>205 µL van zure fenol-chloroform Voeg aan het monster. Meng goed door vortex, centrifugeer dan het monster bij 21,100 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. De waterfase overbrengen in een nieuwe buis.</li>
		<li>Voeg 20 µL van 3 M Natriumacetaat (pH 5.2), 4 µL van neerslag vervoerder en 250 µL van ethanol tot de waterige fase. Schud de buis goed voor mixen en centrifugeren van het monster bij 21,100 x g gedurende 20 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.</li>
		<li>Wassen van de pellet met 300 µL van koude 70% (vol/vol) ethanol opgeslagen bij-20 ° C. Centrifugeer het monster bij 21,100 x g gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C.</li>
		<li>Verwijder het supernatant en drogen van de pellet. Opmerking: De pellet uit stap 3.5.9 kan worden achtergelaten bij-20 ° C gedurende ten minste 2 dagen.</li>
	</ol></li>
	<li>De gelelektroforese van het en autoradiografie
	<ol>
<li>Resuspendeer de monster met 20 ÂµL van RNase-gratis water.</li>
		<li>Voeg 20 µL van 2 x laden van de buffer.</li>
		<li>Kook het monster gedurende 10 minuten bij 95 ° C. Plet het monster op het ijs.</li>
		<li>De gel worden uitgevoerd. In het geval de sjabloon grootte 34 nts (Zie ook stap 3.4.3), wordt 7 M ureum - 10% polyacrylamidegel gebruikt voor denaturering van de Elektroforese van het gel.</li>
		<li>De gel met een gel droger drogen.</li>
		<li>Blootstellen van de film aan de gedroogde-gel binnen een X-ray cassette met een toenemende scherm bij-80 ° C.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Martinez, P., Blasco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeric+and+extra-telomeric+roles+for+telomerase+and+the+telomere-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Telomeric and extra-telomeric roles for telomerase and the telomere-binding proteins.</a> Nat Rev Cancer. 11 (3), 161-176 (2011).</li>
<li>Nakamura, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+catalytic+subunit+homologs+from+fission+yeast+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human.</a> Science. 277 (5328), 955-959 (1997).</li>
<li>Gillis, A. J., Schuller, A. P., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+Tribolium+castaneum+telomerase+catalytic+subunit+TERT%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT.</a> Nature. 455 (7213), 633-637 (2008).</li>
<li>Salgado, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+an+RNAi+polymerase+links+RNA+silencing+and+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The structure of an RNAi polymerase links RNA silencing and transcription.</a> PLoS Biol. 4 (12), e434(2006).</li>
<li>Castel, S. E., Martienssen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+in+the+nucleus%3A+roles+for+small+RNAs+in+transcription%2C+epigenetics+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA interference in the nucleus: roles for small RNAs in transcription, epigenetics and beyond.</a> Nat Rev Genet. 14 (2), 100-112 (2013).</li>
<li>Sugiyama, T., Cam, H., Verdel, A., Moazed, D., Grewal, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-dependent+RNA+polymerase+is+an+essential+component+of+a+self-enforcing+loop+coupling+heterochromatin+assembly+to+siRNA+production%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">RNA-dependent RNA polymerase is an essential component of a self-enforcing loop coupling heterochromatin assembly to siRNA production.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (1), 152-157 (2005).</li>
<li>Maida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA-dependent+RNA+polymerase+formed+by+TERT+and+the+RMRP+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An RNA-dependent RNA polymerase formed by TERT and the RMRP RNA.</a> Nature. 461 (7261), 230-235 (2009).</li>
<li>Maida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+telomerase+reverse+transcriptase+in+heterochromatin+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Involvement of telomerase reverse transcriptase in heterochromatin maintenance.</a> Mol Cell Biol. 34 (9), 1576-1593 (2014).</li>
<li>Maida, Y., Yasukawa, M., Masutomi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+Novo+RNA+Synthesis+by+RNA-Dependent+RNA+Polymerase+Activity+of+Telomerase+Reverse+Transcriptase%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">De Novo RNA Synthesis by RNA-Dependent RNA Polymerase Activity of Telomerase Reverse Transcriptase.</a> Mol Cell Biol. 36 (8), 1248-1259 (2016).</li>
<li>Okamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+tumor+initiating+cells+of+defined+genetic+composition+by+nucleostemin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Maintenance of tumor initiating cells of defined genetic composition by nucleostemin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20388-20393 (2011).</li>
<li>van Dijk, A. A., Makeyev, E. V., Bamford, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+viral+RNA-dependent+RNA+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Initiation of viral RNA-dependent RNA polymerization.</a> J Gen Virol. 85 (Pt 5), 1077-1093 (2004).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De IP-RdRP bepaling is een gevoelige methode om de RdRP activiteit van menselijke TERT detecteren. TERT-eiwit wordt sterk uitgedrukt in mitotische HeLa cellen, waarin TERT de RdRP complexe8,9,10 vormt. Dit suggereert dat mitotische HeLa cellen een optimale materiaal zijn te detecteren RdRP activiteit. In het protocol zoals hierboven beschreven, zijn mitotische en niet-gesynchroniseerde HeLa cellen opgenomen als een positief en een negatief voorbeeld, respectievelijk. Zoals blijkt uit figuur 1A, RdRP assay producten uit de aanbevolen RNA-sjabloon in mitotische HeLa cellen Toon brede radioactieve signalen tussen 20 tot 30 nt. Naast HeLa cellen, hebben we uitgevoerd van de test met verschillende soorten cellijnen, en vond dat het signaal patroon kan worden gewijzigd in een andere cel typen9: sommige tonen een sterk signaal slechts ongeveer 30 nt, sommige tonen een vergelijkbaar patroon met HeLa cellen. We hebben ook gepresteerd de bepaling met RNA sjablonen dan de 34 nt sjabloon8, kort en lang (~ 300 nt) RNAs met verschillende reeksen, en met succes verkregen RdRP producten die sjablonen hoewel er enkele voorkeur wellicht. Voor de eerste proef, echter raden we HeLa cellen in mitotische fase en de 34 nt RNA-sjabloon. RdRPs kunt double-stranded RNA genereren zowel in een primer-afhankelijke een primer-onafhankelijke manier11. We hebben gemeld dat TERT deze eigenschap als menselijke RdRP7,-9 bewaart; TERT synthetiseert dsRNA uit een RNA-sjabloon met 3'-foldback structuur via een rug-priming mechanisme7. Voor de 34 nt RNA-sjabloon synthetiseert TERT complementaire strengen zonder gebruik te maken van inleidingen9. Specifiek het detecteren van RdRP producten in een primer-onafhankelijke manier, d.w.z. DOVO gesynthetiseerd RNA producten, [α -32P] gesynthetiseerd NTP kan worden vervangen door [γ -32P] NTP in de RdRP reactie9.
MNase behandeling van immuuncomplexen van het TERT op parels is een cruciale stap om gewenste resultaten te bereiken. Als de MNase-behandeling wordt uitgevoerd, te lang of met intensieve schudden, zou de RdRP producten opmerkelijk worden teruggebracht. Om te voorkomen dat een dergelijke problemen, raden wij het protocol zorgvuldig strikt te volgen. HMD oplossing is een andere kritische factor voor succes. Als u vindt dat de signalen zeer zwak zijn, vervangen de HMD oplossing naar een nieuw bereid.
In het gehele protocol, moet men zorgvuldig om te voorkomen dat RNase besmetting nemen. Ribonuclease behandeling moet worden uitgevoerd met speciale apparatuur. Na het manipuleren van de Ribonuclease, een tips moet verwijderen en buizen met RNase onmiddellijk, RNase elimineren met gespecialiseerde oplossing (bijvoorbeeld RNase rustige), en wijzigen van de bosjes.
TERT interageert met niet alleen TERC maar ook vele soorten endogene RNAs, en hebben we een deel van hen7gemeld. Wijziging in de IP-RdRP assay, zoals de bepaling van de IP-RdRP zonder MNase behandeling, zal een volledige lijst van endogene RNA sjablonen voor TERT-geassocieerde RdRP activiteit en bioinformatic gids bevatten over de functies van hun reeks. We hebben dit protocol met succes toegepast op weefsel lysate. Omdat TERT wordt uitgedrukt in een verscheidenheid van normaal en tumor weefsels, kan deze bepaling zinvol zijn om te onderzoeken niet-canonieke enzymatische functie van TERT in de mens.

Menselijke telomerase reverse-transcriptase (TERT) staat bekend als de katalytische subeenheid van telomerase en het kieuwopeningenvorm telomeer telomerase RNA component (TERC), de specifieke RNA sjabloon1gebruiken. Hoewel TERT polymerizes Telomere DNA als onderdeel van telomerase, blijkt het structurele en fylogenetische analyses dat TERT nauw met de virale RNA-afhankelijke RNA-polymerase (RdRPs), evenals virale reverse-transcriptase verbonden is, en deelt van domeinen met deze polymerase2,3,4. RdRP is het enzym dat aanvullende RNA strand aan een sjabloon RNA genereert. Het enzym wordt gecodeerd, niet alleen in virussen, maar ook in modelorganismen, zoals installaties, gist en worm, en double-stranded RNA-synthese door RdRP draagt bij aan transcriptionele en post-transcriptional gen zwijgen in deze organismen5,6 . Hoewel menselijke RdRP had gemist voor een lange tijd, vonden we RdRP activiteit in menselijke TERT in 20097.
We eerst RdRP activiteit van TERT met recombinant eiwit7bevestigd, dan een gevoelige in vitro assay voor het detecteren van RdRP activiteit van endogene TERT8vastgesteld. Hier tonen we de in vitro RdRP assay (IP-RdRP assay) voor endogene TERT. Deze methode begint met immunoprecipitation (IP) van endogene TERT, en wordt gevolgd door in vitro RdRP reactie, waarop radioactieve ribonucleotides zijn opgenomen in de ontluikende RNA strengen.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&rsquo;s modified Eagle&rsquo;s medium (DMEM)</td><td>Wako</td><td>044-29765</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum (FBS)</td><td>CORNING</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin gemengde oplossing</td><td>nacalai tesque</td><td>26253-84</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-Ethyleendiameentetraazijnzuur (EDTA) oplossing</td><td>nacalai tesque</td><td>32777-44</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS(-))</td><td>Wako</td><td>166-23555</td><td></td></tr><tr><td>Thymidine</td><td>nacalai tesque</td><td>07147-61</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazol</td><td>Sigma</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td><td>nacalai tesque</td><td>08904-85</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>nacalai tesque</td><td>31333-45</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethaan</td><td>nacalai tesque</td><td>35434-21</td><td></td></tr><tr><td>Zoutzuur</td><td>nacalai tesque</td><td>18321-05</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40 (NP-40)</td><td>nacalai tesque</td><td>25223-04</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Protein A Plus Agarose</td><td>Thermo scientific</td><td>22812</td><td></td></tr><tr><td>2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]eetaansulfonzuur (HEPES)</td><td>nacalai tesque</td><td>17514-15</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumhydroxide</td><td>Wako</td><td>168-21815</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumacetaat</td><td>nacalai tesque</td><td>28405-05</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchloride hexahydraat (MgCl2&bull;6H2O)</td><td>Wako</td><td>135-00165</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>nacalai tesque</td><td>17045-65</td><td></td></tr><tr><td>Polyoxyethyleen(10) octylfenylether (Triton X-100)</td><td>Wako</td><td>169-21105</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, EDTA-vrij</td><td>Roche Applied Science</td><td>11 873 580 001</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchloride dihydraat (CaCl2&bull;2H2O)</td><td>nacalai tesque</td><td>06731-05</td><td></td></tr><tr><td>Micrococcinale nuclease (MNase)</td><td>Takara Bio</td><td>2910A</td><td></td></tr><tr><td>Ethyleenglycol bis (b-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraazijnzuur (EGTA)</td><td>nacalai tesque</td><td>15214-92</td><td></td></tr><tr><td>3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propaansulfonaat (CHAPS)</td><td>nacalai tesque</td><td>07957-64</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>nacalai tesque</td><td>14128-91</td><td></td></tr><tr><td>rCTP, rATP, rUTP, rGTP, elk 100mM</td><td>Promega</td><td>E6000</td><td></td></tr><tr><td>[a-32P]UTP (3.000 Ci/mmol)</td><td>PerkinElmer</td><td>NEG507H</td><td>Gebruik verse RI voor de test</td></tr><tr><td>RNase-remmer</td><td>TOYOBO</td><td>SIN-201</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Takara</td><td>9033</td><td></td></tr><tr><td>Zuur-fenol:Chloroform, pH 4,5 (met IAA, 125:24:1)</td><td>Life Technologies</td><td>AM9720</td><td></td></tr><tr><td>3 M natriumacetaat</td><td>NIPPON GENE</td><td>316-90081</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (99,5)</td><td>nacalai tesque</td><td>14713-95</td><td></td></tr><tr><td>Dr. GenTLE Precipitatie Carrier</td><td>Takara Bio</td><td>9094</td><td></td></tr><tr><td>RNase One Ribonuclease</td><td>Promega</td><td>M4265</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfaat (SDS)</td><td>nacalai tesque</td><td>02873-75</td><td></td></tr><tr><td>Formamide, gedeïoniseerd</td><td>nacalai tesque</td><td>16345-65</td><td></td></tr><tr><td>Ethyleendiaminetetraazijnzuur Dinatriumzout Dihydraat (EDTA)</td><td>nacalai tesque</td><td>15130-95</td><td></td></tr><tr><td>Oranje G</td><td>nacalai tesque</td><td>25401-22</td><td></td></tr><tr><td>CO2-incubator</td><td>bijv. ASTEC</td><td>SCA-325DRS</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>bijv. TOMY</td><td>EX-135</td><td>Voor stap B)</td></tr><tr><td>Micro gekoelde centrifuge</td><td>bijv. KUBOTA</td><td>3740</td><td>Voor stap 6.2</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Qsonica</td><td>Q125</td><td>Plaats een microtip (#4422) op de sonicator, voor stap 6.4</td></tr><tr><td>Micro gekoelde centrifuge</td><td>bijv. TOMY</td><td>MX-305</td><td>Voor stap 6.5</td></tr><tr><td>Gekoelde incubator</td><td>bijv. Panasonic</td><td>MIR-154-PJ</td><td>Plaats een schudkelvin binnen</td></tr><tr><td>Schudkelvin</td><td>bijv. TAITEC</td><td>RT-5</td><td></td></tr><tr><td>Gekoelde incubator&nbsp;</td><td>bijv. TAITEC</td><td>BR-43FL</td><td>Plaats een schudkelvin &ldquo;MINI WAVE&rdquo; binnen, voor stap 7.7</td></tr><tr><td>MINI WAVE</td><td>AS ONE</td><td>WEV-03</td><td>Een schudkelvin voor stappen 7.7, 8.5 en 8.6</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>bijv. TAITEC</td><td>HB-80</td><td>Plaats een schudkelvin &ldquo;MINI WAVE&rdquo; binnen, voor stap 8.5 en 8.6</td></tr><tr><td>Blokincubator</td><td>bijv. ASTEC</td><td>BI-516S</td><td></td></tr></tbody></table>

semi-kwantitatieve opsporing van rna-afhankelijke rna-polymeraseactiviteit van menselijke telomerase reverse-transcriptase eiwit

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Menselijke telomerase reverse-transcriptase (TERT) is de katalytische subeenheid van telomerase, en het kieuwopeningenvorm telomeer door RNA-afhankelijke DNA-polymeraseactiviteit. Hoewel TERT wordt genoemd als een reverse-transcriptase, aantonen structurele en fylogenetische analyses van TERT dat TERT deel van rechtshandige polymerase uitmaakt, en heeft betrekking op virale RNA-afhankelijke RNA-polymerase (RdRPs) evenals virale reverse-transcriptase. We allereerst geconstateerd dat RdRP activiteit van menselijke TERT dat complementaire RNA genereert staan aan een sjabloon niet-coderende RNA en draagt bij aan RNA silencing in kankercellen. Voor het analyseren van deze niet-canonieke enzymatische activiteit, we RdRP assay met recombinant TERT ontwikkeld in 2009, daarna gevestigd in vitro RdRP assay voor endogene TERT. In dit manuscript beschrijven we de laatste methode. Kort, TERT immuuncomplexen zijn geïsoleerd uit cellen, en geïncubeerd met template RNA en rNTPs met inbegrip van radioactieve rNTP voor RdRP reactie. Om te elimineren single-stranded RNA, worden reactieproducten behandeld met RNase ik, en de eindproducten worden geanalyseerd met polyacrylamide gelelektroforese. Radiolabeled RdRP producten kunnen worden opgespoord met behulp van autoradiografie na nachtelijke blootstelling.

Met de sjabloon aanbevolen RNA zijn radioactieve RdRP producten waargenomen tussen 20 tot 30 nucleotiden (nt) specifiek in HeLa cellen in mitotische fase na nachtelijke blootstelling (figuur 1A). Typisch, signaalsterkte van de producten van de RdRP toont twee bergtoppen die zijn gepositioneerd rond de 25 nt en 30 nt in consonant met de grootteverdeling van de producten bevestigd door volgende generatie sequencing9. In tegenstelling tot de mitotische cellen tonen HeLa cellen zonder synchronisatie bijna afwezigheid van de 20-30 nt radioactieve producten. Ovale signalen, die worden geplaatst onder 20 nt in alle monsters, zijn niet-specifieke driften.
In het geval dat er alleen een ~ 30 nt product met zwak signaal in mitotische HeLa cellen, betekent dit dat de RdRP reactie niet goed gaan. Bijvoorbeeld, als MNase behandeling op ongeveer en ongepast gebeurt, de signaalsterkte in mitotische HeLa cellen daalt aanzienlijk (figuur 1B). RdRP reactie uitgevoerd met oude HMD oplossing vermindert ook de producten (Figuur 1 c).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57021/57021fig1.jpg"> Figuur 1 : Vertegenwoordiger RdRP producten van endogene TERT in mitotische HeLa cellen. (A) drie representatieve resultaten van de bepaling van de IP-RdRP in HeLa cellen behandeld met nocodazole (gemanipuleerd) of DMSO (unmanipulated). De chemisch gesynthetiseerde 34 nt RNA werd gebruikt als een sjabloon. (B) IP-RdRP assay in mitotische HeLa cellen uitgevoerd met ongepaste behandeling van de MNase. (C) IP-RdRP assay in mitotische HeLa cellen uitgevoerd met verse of oude HMD oplossing. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57021/57021fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagentia</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
<tr>
<td>Micrococcal Nuclease, 20 U/µL</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Micrococcal Nuclease Buffer, 10 x</td>
			<td>8 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNase-gratis water</td>
			<td>51 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: MNase reactie mix component.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagentia</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
<tr>
<td>CHAPS, 0,07 procent (wt/vol)</td>
			<td>6 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>HMD oplossing</td>
			<td>2 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>rATP, 80 mM</td>
			<td>0,5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>rGTP, 8 mM</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>rUTP, 0,4 mM</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>rCTP, 8 mM</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNase remmer, 40 U/µL</td>
			<td>0,5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNase-gratis water</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: RdRP reactie mix component.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagentia</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNase één Ribonuclease, 10 U/µL</td>
			<td>0.2 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reactie Buffer, 10 x</td>
			<td>20 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNase-gratis water</td>
			<td>159.8 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 3: Ribonuclease reactie mix component.

Menselijke telomerase reverse-transcriptase (TERT) synthetiseert niet alleen Telomere DNA, maar ook double-stranded RNA door RNA-afhankelijke RNA-polymeraseactiviteit. Hier beschrijven we een nieuw opgerichte assay voor het detecteren van RNA-afhankelijke RNA-polymeraseactiviteit van endogene TERT.

Semi-kwantitatieve opsporing van RNA-afhankelijke RNA-polymeraseactiviteit van menselijke Telomerase Reverse-Transcriptase eiwit

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het RNA-biologieveld, zoals wat is de biologische betekenis van RdRP of TERT in menselijke cellen? Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze test is gevestigd als de eerste gevoelige methode om humane RdRP-activiteit te detecteren die in cellen wordt uitgedrukt. Begin deze procedure met de bereiding van HeLa-cellen zoals beschreven in het tekstprotocol.Was de cellen eenmaal met 10 milliliter PBS. Centrifugeer vervolgens het monster met 1.450 keer zwaartekracht gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius en gooi het supernatant weg. Gebruik een milliliter ijskoud Lysis Buffer A per 10 miljoen cellen om de cellen te lyseren door voorzichtig te pipetten.Soniceer het monster in een 1,5-milliliterbuis bij een sonicatorversterking van 25% gedurende 10 seconden. Centrifugeer na sonicatie het monster met 20.400 keer zwaartekracht gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius. Verzamel het supernatant en breng een milliliter van het supernatant over in 1,5-milliliter microcentrifugebuisjes.Maak het lysaat klaar door 40 microliter voorgewassen Protein A-agarosekralen toe te voegen per milliliter lysaat. Meng goed door de buis meerdere keren te kantelen. Draai vervolgens het monster gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius.Centrifugeer het monster met 13.000 keer zwaartekracht gedurende één minuut bij vier graden Celsius en verzamel het supernatant. Voeg vervolgens 40 microliter voorgewassen Protein A-agarosekralen en 10 microgram anti-menselijke TERT-antilichaam toe aan het vooraf opgehelderde lysaat. Meng goed door de buis meerdere keren te kantelen en draai het monster gedurende de nacht bij vier graden Celsius.Na centrifugatie met 3.300 keer zwaartekracht gedurende 30 seconden bij vier graden Celsius, verwijder het supernatant. Was vervolgens de kralen met Wash Buffer One. Voeg een milliliter Wash Buffer One toe aan de kralen en meng goed door de buis te kantelen.Draai vervolgens het monster gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Centrifugeer het monster met 3.300 keer zwaartekracht gedurende 30 seconden bij vier graden Celsius. Verwijder het supernatant en herhaal deze stap nog drie keer.Na het AGC-oplossingswassen zoals beschreven in het tekstprotocol, behandel de kralen met micrococcale nuclease door ze op te schalken in 60 microliter van de micrococcale nuclease-reactiemix door voorzichtig te pipetten. Schud vervolgens het monster voorzichtig op een draaischijf van een shaker in een Peltier-type incubator gedurende 15 minuten bij 25 graden Celsius. Na centrifugatie van het monster met 3.300 keer zwaartekracht gedurende 30 seconden bij vier graden Celsius, verwijder het supernatant.Was vervolgens de kralen twee keer met een AGC-oplossing die drie millimolar EGTA bevat, en was de kralen eenmaal met Wash Buffer Two zoals beschreven in het tekstprotocol. Bereid de RdRP-reactiemix in een nieuwe buis voor zoals beschreven in het tekstprotocol. Voeg zes microliter uridinetrifosfaat gelabeld op de alfafosfaatgroep met P-dash 32 toe aan de reactiemix en meng goed door te pipetten.Voeg vervolgens een microliter sjabloon-RNA toe aan het mengsel en meng goed. Resuspendeer de kralen met 20 microliter van de resulterende RdRP-reactiemix. Schud het monster vervolgens voorzichtig op een draaischijf van een shaker in een Peltier-type incubator gedurende twee uur bij 32 graden Celsius.Na incubatie, voeg 5,4 microliter van 20 milligram per milliliter Proteinase K en 45,4 microliter van 2X Proteinase K Buffer toe aan de reactiemix. Meng door te pipetten en schud het monster in een Peltier-type incubator gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Voeg na het toevoegen van 109,2 microliter RNase-vrij water aan het monster 200 microliter zuur fenol-chloroform toe.Meng goed door te vortexen voordat u het monster centrifugeert met 21.100 keer zwaartekracht gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Breng de waterige fase over naar een nieuwe buis. Herhaal deze stap eenmaal.Voeg vervolgens 20 microliter drie molaire natriumacetaat, pH 5,2, vier microliter precipitatiedrager en 250 microliter ethanol toe aan de waterige fase. Schud de buis goed om te mengen. Centrifugeer het monster met 21.100 keer zwaartekracht gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius en gooi het supernatant weg.Was vervolgens de pellet met 300 microliter koude 70%volume per volume ethanol die bij min 20 graden Celsius is bewaard. Centrifugeer het monster met 21.100 keer zwaartekracht gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius. Gooi het supernatant weg en laat de pellet aan de lucht drogen.Resuspendeer de pellet in 20 microliter RNase-vrij water. Bereid de RNase-reactiemix in een nieuwe buis voor zoals beschreven in het tekstprotocol. Voeg 180 microliter van de RNase-reactiemix toe aan het monster.Incubeer vervolgens het buisje gedurende twee uur bij 37 graden Celsius. Voeg 2,3 microliter 10%volume per volume SDS toe aan het monster en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius. Voeg vervolgens twee microliter 20 milligram per milliliter Proteinase K toe aan het monster en incubeer gedurende nog eens 15 minuten bij 37 graden Celsius.Voeg nu 205 microliter zuur fenol-chloroform toe aan het monster. Na mengen en centrifugeren zoals eerder, breng de waterige fase over naar een nieuwe buis. Voeg drie molaire natriumacetaat, precipitatiedrager en ethanol toe aan de waterige fase, gevolgd door mengen, centrifugeren en wassen van de pellet zoals eerder uitgevoerd.Hier worden drie representatieve resultaten van de IP-RdRP-test in HeLa-cellen getoond die zijn behandeld met nocodazol of DMSO voor onbewerkte cellen. Een chemisch gesynthetiseerd 34-nucleotide RNA werd gebruikt als sjabloon. Na overnachtelijke blootstelling zijn RdRP-producten zichtbaar tussen 20 tot 30 nucleotiden, specifiek in HeLa-cellen in de mitotische fase.Na het bekijken van deze video, zou u

semi-quantitative-detection-rna-dependent-rna-polymerase-activity

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Inspanningen om de katalytische subeenheid van telomerase isoleren, tert, in voldoende hoeveelheden voor structurele studies, is voldaan met beperkt succes voor meer dan een decennium. Hier presenteren we methoden voor de isolatie van het recombinante Tribolium castaneum TERT...

In vitro reconstitutie van de Active T. castaneum Telomerase

Source: Scarborough, R. J., et al. Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates a reverse transcriptase (RT) assay to assess the effect of a test RNA on virus-like particle (VLP) production. Cells are co-transfected with plasmids, and RT activity is measured as a quantitative indicator of VLP output. A decrease in RT activity reflects suppression of viral gene expression by the test RNA.

Reverse Transcriptase Activity as a Marker for Virus-Like Particle Production

Een nauwkeurige, korte, verfijnd en goedkope methode wordt beschreven dat beoordeelt lengte van telomeren in meerdere weefsels en diersoorten met behulp van qRT-PCR. Daarnaast zullen we een eenvoudige test om telomerase activiteit uitoefent als aanvullend backbone test telomeren beschrijven.

Lengte van telomeren en telomerase activiteit; Een Yin en Yang van celsenescentie

Telomerase wordt tot expressie gebracht in de neonatale hersenen en ook in verschillende regio's van de volwassen hersenen. We presenteren een niet-toxische, tijdbesparende TRAP-assay voor de analyse van telomerase-activiteit in verschillende regio's van de muizenhersenen en voor het detecteren van verschillen in telomerase-activiteit tussen mannelijke en vrouwelijke muizenhersenen.

Telomerase activiteit in de verschillende regio&#39;s van de hersenen van muizen: Non-Radioactive Telomerase Herhaal Amplification Protocol (TRAP) Assay

Dit protocol diagnose Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia weefsels met behulp van de RT-PCR methodes. De hele methode is beschreven van weefsel dissectie totaal RNA extractie, gevolgd door de cDNA synthese en opsporing van TiLV door conventionele PCR of kwantitatieve PCR dsDNA bindend een bindende fluorescerende kleurstof gebruiken.

Detectie van Tilapia Lake Virus met behulp van conventionele rechts-PCR en SYBR groene RT-qPCR

We hebben met succes omgezet de standaard Telomere REPEAT versterking Protocol (TRAP) assay te worden gebruikt in druppel digitale polymerase chain reacties. Deze nieuwe Assay, genaamd ddTRAP, is gevoeliger en kwantitatieve, waardoor een betere opsporing en statistische analyse van telomerase activiteit binnen verschillende menselijke cellen.

Druppel digitale val (ddTRAP): aanpassing van de Telomere Herhaal versterking protocol aan druppel digitale polymerase kettingreactie

Hier presenteren we een geoptimaliseerde in vitro methode om eiwitinteractoren van specifieke RNA-sequenties te ontdekken, kwantificeren en valideren, met behulp van totaal eiwitextract uit menselijke cellen, streptavidineparels bedekt met gebiotinyleerd RNA en massaspectrometrie-analyse.

Een geoptimaliseerde kwantitatieve pull-down analyse van RNA-bindende eiwitten met behulp van kort gebiotinyleerd RNA

Hier beschrijven we in detail het protocol voor het kwantificeren van de telomeerlengte met behulp van niet-radioactieve chemiluminescente detectie, met een focus op de optimalisatie van verschillende prestatieparameters van de TAGGG-telomeerlengtetestkit, zoals bufferhoeveelheden en sondeconcentraties.

Optimalisatie van prestatieparameters van de TAGGG-telomeerlengtetest

Hier presenteren we een protocol voor het meten van de relatieve telomeerlengte (TL) met behulp van de monochrome multiplex kwantitatieve polymerasekettingreactie (MMqPCR) assay. De MMqPCR-test is een herhaalbare, efficiënte en kosteneffectieve methode voor het meten van TL uit menselijk DNA in populatiestudies.

Monochrome Multiplex kwantitatieve PCR-telomeerlengtemeting 

Deze studie beschrijft methoden voor de T7-gemedieerde co-expressie van meerdere genen uit een enkel plasmide in Escherichia coli met behulp van het pMGX plasmide systeem.

Induceerbaar T7 RNA Polymerase-gemedieerde Multigene Expression System, pMGX

Leer een semi-kwantitatieve methode om RNA-afhankelijke RNA-polymeraseactiviteit van menselijk TERT-eiwit te detecteren in HeLa-cellen. Deze techniek biedt inzicht in de biologische rol van TERT in RNA-biologie.

Semi-kwantitatieve opsporing van RNA-afhankelijke RNA-polymeraseactiviteit van menselijke Telomerase Reverse-Transcriptase eiwit (Video) | JoVE Journal

Semi-kwantitatieve opsporing van RNA-afhankelijke RNA-polymeraseactiviteit van menselijke Telomerase Reverse-Transcriptase eiwit

Meer video's verkennen