Semi-kwantitatieve opsporing van RNA-afhankelijke RNA-polymeraseactiviteit van menselijke Telomerase Reverse-Transcriptase eiwit

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het RNA-biologieveld, zoals wat is de biologische betekenis van RdRP of TERT in menselijke cellen? Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze test is gevestigd als de eerste gevoelige methode om humane RdRP-activiteit te detecteren die in cellen wordt uitgedrukt. Begin deze procedure met de bereiding van HeLa-cellen zoals beschreven in het tekstprotocol.

Was de cellen eenmaal met 10 milliliter PBS. Centrifugeer vervolgens het monster met 1.450 keer zwaartekracht gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius en gooi het supernatant weg. Gebruik een milliliter ijskoud Lysis Buffer A per 10 miljoen cellen om de cellen te lyseren door voorzichtig te pipetten.

Soniceer het monster in een 1,5-milliliterbuis bij een sonicatorversterking van 25% gedurende 10 seconden. Centrifugeer na sonicatie het monster met 20.400 keer zwaartekracht gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius. Verzamel het supernatant en breng een milliliter van het supernatant over in 1,5-milliliter microcentrifugebuisjes.

Maak het lysaat klaar door 40 microliter voorgewassen Protein A-agarosekralen toe te voegen per milliliter lysaat. Meng goed door de buis meerdere keren te kantelen. Draai vervolgens het monster gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius.

Centrifugeer het monster met 13.000 keer zwaartekracht gedurende één minuut bij vier graden Celsius en verzamel het supernatant. Voeg vervolgens 40 microliter voorgewassen Protein A-agarosekralen en 10 microgram anti-menselijke TERT-antilichaam toe aan het vooraf opgehelderde lysaat. Meng goed door de buis meerdere keren te kantelen en draai het monster gedurende de nacht bij vier graden Celsius.

Na centrifugatie met 3.300 keer zwaartekracht gedurende 30 seconden bij vier graden Celsius, verwijder het supernatant. Was vervolgens de kralen met Wash Buffer One. Voeg een milliliter Wash Buffer One toe aan de kralen en meng goed door de buis te kantelen.

Draai vervolgens het monster gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Centrifugeer het monster met 3.300 keer zwaartekracht gedurende 30 seconden bij vier graden Celsius. Verwijder het supernatant en herhaal deze stap nog drie keer.

Na het AGC-oplossingswassen zoals beschreven in het tekstprotocol, behandel de kralen met micrococcale nuclease door ze op te schalken in 60 microliter van de micrococcale nuclease-reactiemix door voorzichtig te pipetten. Schud vervolgens het monster voorzichtig op een draaischijf van een shaker in een Peltier-type incubator gedurende 15 minuten bij 25 graden Celsius. Na centrifugatie van het monster met 3.300 keer zwaartekracht gedurende 30 seconden bij vier graden Celsius, verwijder het supernatant.

Was vervolgens de kralen twee keer met een AGC-oplossing die drie millimolar EGTA bevat, en was de kralen eenmaal met Wash Buffer Two zoals beschreven in het tekstprotocol. Bereid de RdRP-reactiemix in een nieuwe buis voor zoals beschreven in het tekstprotocol. Voeg zes microliter uridinetrifosfaat gelabeld op de alfafosfaatgroep met P-dash 32 toe aan de reactiemix en meng goed door te pipetten.

Voeg vervolgens een microliter sjabloon-RNA toe aan het mengsel en meng goed. Resuspendeer de kralen met 20 microliter van de resulterende RdRP-reactiemix. Schud het monster vervolgens voorzichtig op een draaischijf van een shaker in een Peltier-type incubator gedurende twee uur bij 32 graden Celsius.

Na incubatie, voeg 5,4 microliter van 20 milligram per milliliter Proteinase K en 45,4 microliter van 2X Proteinase K Buffer toe aan de reactiemix. Meng door te pipetten en schud het monster in een Peltier-type incubator gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Voeg na het toevoegen van 109,2 microliter RNase-vrij water aan het monster 200 microliter zuur fenol-chloroform toe.

Meng goed door te vortexen voordat u het monster centrifugeert met 21.100 keer zwaartekracht gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Breng de waterige fase over naar een nieuwe buis. Herhaal deze stap eenmaal.

Voeg vervolgens 20 microliter drie molaire natriumacetaat, pH 5,2, vier microliter precipitatiedrager en 250 microliter ethanol toe aan de waterige fase. Schud de buis goed om te mengen. Centrifugeer het monster met 21.100 keer zwaartekracht gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius en gooi het supernatant weg.

Was vervolgens de pellet met 300 microliter koude 70%volume per volume ethanol die bij min 20 graden Celsius is bewaard. Centrifugeer het monster met 21.100 keer zwaartekracht gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius. Gooi het supernatant weg en laat de pellet aan de lucht drogen.

Resuspendeer de pellet in 20 microliter RNase-vrij water. Bereid de RNase-reactiemix in een nieuwe buis voor zoals beschreven in het tekstprotocol. Voeg 180 microliter van de RNase-reactiemix toe aan het monster.

Incubeer vervolgens het buisje gedurende twee uur bij 37 graden Celsius. Voeg 2,3 microliter 10%volume per volume SDS toe aan het monster en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius. Voeg vervolgens twee microliter 20 milligram per milliliter Proteinase K toe aan het monster en incubeer gedurende nog eens 15 minuten bij 37 graden Celsius.

Voeg nu 205 microliter zuur fenol-chloroform toe aan het monster. Na mengen en centrifugeren zoals eerder, breng de waterige fase over naar een nieuwe buis. Voeg drie molaire natriumacetaat, precipitatiedrager en ethanol toe aan de waterige fase, gevolgd door mengen, centrifugeren en wassen van de pellet zoals eerder uitgevoerd.

Hier worden drie representatieve resultaten van de IP-RdRP-test in HeLa-cellen getoond die zijn behandeld met nocodazol of DMSO voor onbewerkte cellen. Een chemisch gesynthetiseerd 34-nucleotide RNA werd gebruikt als sjabloon. Na overnachtelijke blootstelling zijn RdRP-producten zichtbaar tussen 20 tot 30 nucleotiden, specifiek in HeLa-cellen in de mitotische fase.

Na het bekijken van deze video, zou u